吳志亮，黃 瑩,，王則金,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)副產(chǎn)品保鮮技術(shù)開發(fā)基地，福建 福州 350002）

草菇（Volvariella volvacea）又稱作中國(guó)蘑菇，是熱帶、亞熱帶地區(qū)栽培最多的食用菌之一。草菇是典型的高溫型食用菌，適于在高溫環(huán)境下生長(zhǎng)。當(dāng)生長(zhǎng)溫度低于15 ℃時(shí)，草菇菌絲體的活力下降、生長(zhǎng)變緩甚至死亡。當(dāng)貯藏溫度低于15 ℃時(shí)，草菇子實(shí)體也在12 h內(nèi)發(fā)生自溶。草菇低溫自溶的特性制約了草菇菌種保藏和子實(shí)體生產(chǎn)流通，嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

目前，國(guó)內(nèi)外的研究多集中于草菇菌絲體的基因水平變化。Bao Dapeng等[1]將草菇的菌絲體在4 ℃下處理0、2 h和4 h，然后通過檢測(cè)每個(gè)階段中表達(dá)的mRNA來研究草菇的低溫自溶。Gong Ming等[2-3]進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析發(fā)現(xiàn)，草菇菌絲體在4 ℃下處理4、6 h和8 h后，泛素綴合酶E2和一個(gè)具有F-box結(jié)構(gòu)域細(xì)胞周期特定類型的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)顯著上調(diào)，這兩個(gè)基因被認(rèn)為與草菇的低溫自溶相關(guān)。關(guān)于草菇自溶時(shí)的蛋白質(zhì)水平變化鮮見報(bào)道。本研究以草菇子實(shí)體為對(duì)象，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究草菇子實(shí)體響應(yīng)低溫脅迫的差異蛋白質(zhì)，揭示草菇發(fā)生低溫自溶后的代謝通路變化，旨在為草菇低溫自溶機(jī)理的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)草菇（Volvariella volvacea）品種為V23，購(gòu)于福建省漳州市角美鎮(zhèn)佳興食用菌合作社。于清晨6點(diǎn)采摘蛋形期草菇，采后立即運(yùn)回福建農(nóng)林大學(xué)保鮮實(shí)驗(yàn)室。

iTRAQ試劑盒 美國(guó)SCIEX公司；Bradford蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒 美國(guó)Bio-Rad公司；RNAiso Plus試劑盒、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、TB Green? Premix ExTaq?試劑盒 日本Takara公司；鹽酸、氯乙酰胺、乙酸乙酯、脫氧膽酸鈉、三氟乙酸、乙二胺四乙酸、尿素、碘乙酰胺、三羥甲基氨基甲烷、二甲基亞砜、二硫蘇糖醇、六水合氯化鐵、十二烷基硫酸鈉、三氯乙酸 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸 美國(guó)Thermo Fisher公司；乙基苯基聚乙二醇、甲醇、引物 上海生工生物工程股份有限公司；其他常用化學(xué)試劑（分析純） 國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600 plus串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)SCIEX公司；1260半制備型液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；JY98-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀寧波新芝生物科技有限公司；NanoLC-Ultra 1Dplus液相色譜儀 美國(guó)Eksigent公司；5424 R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；T10研磨儀 德國(guó)IKA公司；SimpliAmp熱循環(huán)儀、7300 qPCR系統(tǒng) 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；FluorChem FC3凝膠成相分析系統(tǒng)美國(guó)ProteinSimple公司；DW-86L626超低溫冰箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

挑選橢圓形、大小均一、無機(jī)械損傷的草菇作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，新鮮草菇設(shè)為對(duì)照組，低溫脅迫處理組的草莓置于溫度為4 ℃的冷庫(kù)內(nèi)12 h。取部分進(jìn)行拍照；其他取樣后立即使用液氮速凍，并保存于-80 ℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取及質(zhì)量濃度測(cè)定

取1 mg草菇組織樣本，加入5.0 mL裂解液（含2.5 g/100 mL十二烷基硫酸鈉、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0），充分混合均勻。使用組織破碎儀進(jìn)行組織破碎勻漿，煮沸10 min，超聲（80 W）處理10 min后，12 000 r/min離心15 min，取上清液。加入上清液5 倍體積的預(yù)冷10 g/100 mL三氯乙酸-丙酮溶液，振蕩混合，在-20 ℃放置2 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。加入預(yù)冷丙酮清洗沉淀，充分混勻后，在冰上放置15 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集沉淀，此步驟重復(fù)2 次。向得到的蛋白質(zhì)沉淀中加入500 μL復(fù)溶液（含8 mol/L尿素、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0）。復(fù)溶后，加入200 μL現(xiàn)配的二硫蘇糖醇溶液（含50 mmol/L 二硫蘇糖醇、8 mol/L尿素、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0），37 ℃水浴1 h。加入100 μL現(xiàn)配的碘乙酰胺溶液（含50 mmol/L碘乙酰胺、8 mol/L尿素、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0），于室溫靜置1 h。于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液（蛋白溶液）。根據(jù)Bradford法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3 蛋白組成測(cè)定

蛋白質(zhì)定量后取1.3.2節(jié)所得的蛋白溶液（含50 μg蛋白質(zhì)），采用12 g/100 mL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。分離后的凝膠采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染色。具體操作如下：固定2 h，染色12 h，水洗至背景清晰。染色后的凝膠使用FluorChem FC3凝膠成相分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，掃描模式為全彩模式。

1.3.4 胰蛋白酶酶解及標(biāo)記

在蛋白溶液中加入100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（pH 8.0）。按照酶與蛋白質(zhì)1∶50的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，在37 ℃下孵育振蕩過夜。第2天加入1.5 μL體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸終止酶切，并調(diào)節(jié)溶液pH值至6.0，12 000 r/min離心15 min。取上清液進(jìn)行固相萃取柱Sep-Pak C18脫鹽，除鹽后的肽段溶液經(jīng)離心濃縮儀抽干后，在-20 ℃下凍存待用。每個(gè)樣品取100 μg酶解后的肽段進(jìn)行同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）標(biāo)記。標(biāo)記后的樣品混合后使用Sep-Pak C18進(jìn)行除鹽，真空抽干。

1.3.5 高效液相反相色譜分離

采用1260半制備型高效液相色譜儀對(duì)混合樣品進(jìn)行反相色譜分離，最終合并為15 個(gè)組分。色譜柱：TechMate C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：20 mmol/L甲氨酸，用氨水調(diào)pH值至10；流動(dòng)相B：20 mmol/L甲氨酸（溶劑為體積分?jǐn)?shù)80%乙腈溶液）；進(jìn)樣體積：100 μL；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL/min；運(yùn)行時(shí)間：60 min；圖像二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)吸收波長(zhǎng)：216 nm；四元泵梯度洗脫。

1.3.6 液相二級(jí)質(zhì)譜分析

采用串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行液相二級(jí)質(zhì)譜分析。

液相色譜條件：肽段樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱（5 mm×0.3 mm，5 μm）后，被洗脫至Eksigent C18色譜柱（75 μm×150 mm，3 μm）進(jìn)行分離。利用流動(dòng)相A（含3%（體積分?jǐn)?shù)，下同）二甲基亞砜、0.1%甲酸的水溶液）和流動(dòng)相B（含3%二甲基亞砜、0.1%甲酸-乙腈溶液）建立100 min的分析梯度（0 min，5% B；0～65 min，5%～23% B；65～85 min，2 3%～5 2% B；8 5 ～8 6 m i n：5 2%～8 0% B；86～90 min，80% B；90～90.1 min，80%～5% B；90.1～100 min，5% B）。流速：300 nL/min。

質(zhì)譜條件：掃描方式為質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴型掃描模式分析，每個(gè)掃描循環(huán)中包含1 個(gè)MS全掃描（質(zhì)量掃描范圍：m/z350～1 500，離子累積時(shí)間：250 ms）以及40 個(gè)MS/MS掃描（質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1 500，離子累積時(shí)間：50 ms）。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ProteinPilot 4.5軟件分析，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中傘菌目的Uniprot.taxonomy.Agaricales.20190429.fasta蛋白質(zhì)序列參考數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索結(jié)果以Unused≥1.3為標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白質(zhì)信息用作后續(xù)的分析。為了獲得基因本體（gene ontology，GO）注釋分析、同源蛋白簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析的數(shù)據(jù)，將差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/）并分析。

1.3.8 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qPCR

使用RNAiso Plus試劑盒提取樣品的總RNA。使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒去除樣品總RNA中的基因組DNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用TB Green? Premix ExTaq?試劑盒進(jìn)行qPCR。使用微管蛋白α（tubulin-α，TUB）作為草菇的內(nèi)參基因來驗(yàn)證甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和NADH-泛醌氧化還原酶（NADH-quinone oxidoreductase，NADH）的基因。使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）設(shè)計(jì)引物（表1）。使用2ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 草菇受低溫脅迫的形態(tài)變化

圖1 草菇響應(yīng)低溫脅迫的形態(tài)變化Fig. 1 Changes in the morphology of straw mushroom in response to cold stress

草菇子實(shí)體由菌膜、菌托、菌傘、菌柄、菌褶構(gòu)成。新鮮草菇的外部上方為灰黑色，往下至菌托漸淡，位于內(nèi)部的成分均為白色，帶有草菇特有清香（圖1A）。經(jīng)低溫（4 ℃）處理12 h后，草菇發(fā)生了自溶，草菇表面覆蓋水珠并發(fā)生褐變，內(nèi)部以菌膜褐變最為嚴(yán)重，內(nèi)部間隙可見自溶產(chǎn)生的積液，質(zhì)地變軟萎蔫，發(fā)出腐爛的惡臭味（圖1B）。

2.2 草菇菌傘組織蛋白分析結(jié)果

分別從新鮮的草菇和經(jīng)低溫處理的草菇的菌傘組織提取蛋白質(zhì)，根據(jù)Bradford法測(cè)定得對(duì)照組C1、C2和低溫脅迫處理組CS1和CS2的上清液蛋白質(zhì)量濃度分別為2.35、3.05、2.69 μg/μL和2.39 μg/μL，隨后進(jìn)行SDS-PAGE。由圖2可知，樣品的SDS-PAGE圖條帶清晰，樣品之間平行度較好，對(duì)照組與低溫處理組之間具有一定差異。蛋白質(zhì)提取樣本量足夠，樣品量適于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 草菇菌傘組織蛋白響應(yīng)低溫脅迫的SDS-PAGE圖Fig. 2 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of proteins in straw mushroom in response to cold stress

2.3 差異蛋白質(zhì)篩選結(jié)果

表2 變化倍數(shù)較高的上調(diào)蛋白質(zhì)Table 2 List of highly up-regulated proteins

草菇在4 ℃下處理12 h后，其蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了一定的變化。樣品經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，篩選出2 455 種Unused≥1.3的可信蛋白質(zhì)。以P＜0.05、變化倍數(shù)≥1.5或≤0.667（1/1.5）為依據(jù)篩選出332 種差異蛋白質(zhì)，其中包含了64 種上調(diào)蛋白質(zhì)、268 種下調(diào)蛋白質(zhì)。表2列出了20 種變化倍數(shù)較高的上調(diào)蛋白質(zhì)信息。圖3為所有差異蛋白質(zhì)的火山圖，黑色為沒有顯著差異的蛋白質(zhì)，藍(lán)色為顯著下調(diào)的差異蛋白質(zhì)，紅色為顯著上調(diào)的差異蛋白質(zhì)。

圖3 草菇響應(yīng)低溫脅迫差異蛋白質(zhì)的火山圖Fig. 3 Volcanic map of differentially expressed proteins of straw mushrooms in response to cold stress

2.4 GO注釋分析結(jié)果

為進(jìn)一步了解草菇在低溫脅迫下差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO注釋分析，從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能方面進(jìn)行富集分析。生物學(xué)過程注釋表明差異蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞過程（37.04%）、代謝過程（31.71%）、定位（10.42%）、生物調(diào)節(jié)（8.33%）、細(xì)胞成分的組織或生物發(fā)生（7.18%）、應(yīng)激響應(yīng)（3.94%）。細(xì)胞組分注釋表明差異蛋白質(zhì)主要分布在細(xì)胞部分（37.68%）、含蛋白質(zhì)的復(fù)合物（21.92%）、細(xì)胞器（14.04%）和細(xì)胞器部分（13.05%）等。分子功能主要涉及結(jié)合活性（45.97%）、催化活性（40.52%）和結(jié)構(gòu)分子活性（8.31%）等。

圖4 草菇響應(yīng)低溫脅迫差異蛋白質(zhì)的GO注釋分析Fig. 4 Gene ontology analysis for differentially expressed proteins of straw mushrooms in response to cold stress

2.5 KEGG通路分析結(jié)果

為了進(jìn)一步了解草菇受到低溫脅迫時(shí)代謝通路的途徑信息，將差異蛋白質(zhì)上傳到KEGG網(wǎng)站，以注釋序列和代謝途徑。在P＜0.05的范圍內(nèi)，有109 種差異蛋白質(zhì)被注釋到57 條KEGG通路上。其中差異蛋白質(zhì)數(shù)量最多的通路是核糖體，有28 種，通路圖是map03010（圖5）。其次是RNA轉(zhuǎn)運(yùn)，有15 種。與甲型流感相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有13 種。與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有11 種。與緊密連接相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有10 種。與病毒致癌相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有10 種。與精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有10 種。由此可見，草菇在受到低溫脅迫后，核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝通路受到較大影響。

2.6 COG分析結(jié)果

為研究草菇響應(yīng)低溫脅迫的差異蛋白質(zhì)，將鑒定到的蛋白質(zhì)和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共計(jì)328 種蛋白質(zhì)獲得注釋，分為22 種COG功能，分別用A～Z表示（表3）。如表3所示，P＜0.05的功能聚類有J（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成）、Z（細(xì)胞骨架）、Y（細(xì)胞核結(jié)構(gòu)），分別包含61、19、8 種差異蛋白質(zhì)。這表明低溫脅迫主要影響了草菇的J、Z、Y功能，結(jié)果與KEGG通路分析結(jié)果一致。

表3 草菇響應(yīng)低溫脅迫的差異蛋白質(zhì)COG聚類Table 3 COG clustering of differentially expressed proteins of straw mushroom in response to cold stress

2.7 qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Western bloting技術(shù)是驗(yàn)證蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的最佳方法，但食用菌大多數(shù)蛋白質(zhì)缺乏針對(duì)性的抗體，所以采用qPCR技術(shù)驗(yàn)證草菇蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)[4]。篩選常用的內(nèi)參基因所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)（表4），翻譯延伸因子1-α、β-肌動(dòng)蛋白、GAPDH在蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)差異表達(dá)，不適合作為qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。選擇變化倍數(shù)小于10%的TUB-β作為qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。NADH-泛醌氧化還原酶是線粒體呼吸鏈的復(fù)合物Ⅰ，是具有代表性的差異蛋白質(zhì)。如表5所示，甘油醛-3-磷酸脫氫酶和NADH-泛醌氧化還原酶的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化和蛋白質(zhì)水平一致。

表4 與內(nèi)參基因相關(guān)的差異蛋白質(zhì)Table 4 Differentially expressed proteins related to house-keeping genes

圖5 涉及核糖體的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝途徑Fig. 5 Metabolic pathway maps of differentially expressed proteins involved in ribosome in KEGG

表5 關(guān)鍵蛋白質(zhì)qPCR驗(yàn)證結(jié)果Table 5 qPCR validation of key proteins

3 討 論

有研究表明低溫脅迫可影響草菇的膜脂代謝、活性氧代謝、海藻糖代謝等相關(guān)生物學(xué)過程[5-7]。本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定量了草菇響應(yīng)低溫脅迫的蛋白質(zhì)，一些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能在草菇響應(yīng)低溫脅迫的代謝過程中起重要作用。討論部分歸納分析了與能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸合成與代謝、信號(hào)通路、活性氧代謝、膜脂代謝、核糖體代謝等代謝過程相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，旨在為草菇低溫自溶機(jī)理的研究提供新的線索。

3.1 與能量代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

線粒體主呼吸鏈（N A D H 呼吸鏈）由復(fù)合物I（NADH-泛醌氧化還原酶）、復(fù)合物III（細(xì)胞色素b-c1）和復(fù)合物V（ATP合成酶）組成[8]。NADH-泛醌氧化還原酶位于線粒體內(nèi)膜，催化電子從NADH傳遞至輔酶Q[9]。細(xì)胞色素b-c1偶聯(lián)催化電子由氫醌到細(xì)胞色素c的轉(zhuǎn)移和質(zhì)子基質(zhì)由膜內(nèi)向膜外空間的運(yùn)輸。ATP合成酶α亞基能夠調(diào)節(jié)ATP合成酶的活性，ATP合成酶在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的推動(dòng)下合成ATP[10]。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)NADH-醌氧化還原酶、細(xì)胞色素b-c1復(fù)合物亞基Rieske和ATP合成酶α亞基在草菇進(jìn)行低溫處理后上調(diào)，推測(cè)其通過NADH呼吸鏈增強(qiáng)呼吸強(qiáng)度以產(chǎn)生更多的能量以對(duì)抗低溫脅迫。草菇在低溫貯藏時(shí)仍具有較強(qiáng)的呼吸作用，線粒體主呼吸鏈相關(guān)蛋白質(zhì)上調(diào)可能是該現(xiàn)象的內(nèi)在原因。

丙酮酸激酶參與糖酵解過程中最后的不可逆終反應(yīng)，催化生成ATP和丙酮酸，在細(xì)胞能量代謝過程中具有重要的作用[11]。檸檬酸合成酶在三羧酸循環(huán)的第一步反應(yīng)中，催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸[12]。上述兩個(gè)上調(diào)的差異蛋白質(zhì)可能在草菇受到低溫脅迫時(shí)調(diào)控能量代謝途徑。

此外，數(shù)據(jù)顯示ATP合成酶β亞基下調(diào)和丙酮酸脫氫酶E1α亞基上調(diào)。ATP合成酶β亞基功能紊亂與糖尿病、肥胖等多種疾病相關(guān)。研究表明，ATP合成酶β亞基的下調(diào)會(huì)加重小鼠糖尿病腎病[13]，肥胖患者骨骼肌ATP合成酶β亞基合成率和活性降低[14]。丙酮酸脫氫酶E1α亞基突變或者磷酸化是丙酮酸脫氫酶系缺失的主要原因，丙酮酸脫氫酶系缺失可導(dǎo)致線粒體代謝紊亂[15]。低溫脅迫可能導(dǎo)致了草菇線粒體代謝和ATP合成酶代謝紊亂，ATP合成酶β亞基和丙酮酸脫氫酶E1α亞基可能與草菇自溶相關(guān)。

3.2 與碳水化合物代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

真菌細(xì)胞壁降解的酶機(jī)制十分復(fù)雜，需要大量的糖苷水解酶和碳水化合物裂解酶。糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）催化糖苷鍵的水解，是細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動(dòng)物中碳水化合物代謝中的重要酶類[16]。GH家族13的代表酶類有α淀粉酶、環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和分支酶，可作用于淀粉、蔗糖等的α-葡聚糖[16]。對(duì)GH家族63研究最多的酶是α-葡萄糖苷酶I，其特異性水解Glc3Man9GlcNAc2的末端α-1,2-葡萄糖苷鍵[17]。醛脫氫酶廣泛存在于白腐菌擔(dān)子菌中，它們參與真菌木質(zhì)素和芳香異生素的降解[18]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶[19]。此外，轉(zhuǎn)酮酶是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，在磷酸戊糖途徑與糖酵解的連接中起著至關(guān)重要的作用[20-21]。數(shù)據(jù)表明GH家族13、GH家族63、醛脫氫酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、轉(zhuǎn)酮酶這5 種蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào)，說明受到低溫脅迫時(shí)草菇的磷酸戊糖途徑受到抑制，水解酶活性和木質(zhì)素相關(guān)的代謝下降以減少不必要的能量和物質(zhì)消耗。但本研究發(fā)現(xiàn)2 個(gè)具有水解酶活性的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，分別是碳水化合物酯酶家族9蛋白質(zhì)和與EXG1-exo-beta-1,3-葡聚糖酶相關(guān)的蛋白質(zhì)。推測(cè)這兩個(gè)差異蛋白質(zhì)可能在草菇遭受低溫脅迫時(shí)使草菇的細(xì)胞壁發(fā)生降解，推測(cè)其與草菇低溫自溶相關(guān)。

海藻糖是真菌中重要的貯藏性碳源之一，可被海藻糖酶水解成葡萄糖提供能量，又可在低溫、干旱等脅迫環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞[22-23]。在本研究中，海藻糖-6-磷酸合酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）和海藻糖磷酸化酶（trehalose phosphorylase，TP）表達(dá)下調(diào)，而海藻糖酶表達(dá)無顯著性變化。TPS參與海藻糖合成途徑[22]，TP則同時(shí)參與海藻糖的分解和合成[24]。TPS和TP蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致草菇耐寒性下降，這可能是草菇對(duì)低溫敏感的主要原因之一。

3.3 與氨基酸合成和代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化酸性氨基酸和相應(yīng)的酮酸相應(yīng)轉(zhuǎn)化，對(duì)氨基酸代謝過程起到非常重要的作用[25]。O-乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶參與硫酸鹽同化途徑及半胱氨酸合成[26]。氨肽酶是一種蛋白酶，常應(yīng)用于改善食品的風(fēng)味，還應(yīng)用于制備活性肽和蛋白質(zhì)序列檢測(cè)等領(lǐng)域[27-28]，亮氨酸氨肽酶是最具代表性的氨肽酶，對(duì)N端帶有亮氨酸殘基的底物具有很高水解活性[29]。由主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）I類分子呈遞的抗原主要由細(xì)胞溶質(zhì)中的蛋白酶產(chǎn)生。人類細(xì)胞中的細(xì)胞溶質(zhì)氨肽酶以等位基因依賴性的方式影響MHC I類分子呈遞的抗原表達(dá)[30]。翻譯延伸因子1α是重要的翻譯因子，參與信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯控制、凋亡、細(xì)胞骨架組成、病毒復(fù)制及癌基因轉(zhuǎn)化等重要的細(xì)胞過程和疾病[31]。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶、亮氨酸氨肽酶、細(xì)胞溶質(zhì)氨肽酶、翻譯延伸因子1α這5 種差異蛋白質(zhì)在草菇受到低溫脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其參與調(diào)節(jié)氨基酸的合成和代謝以響應(yīng)低溫脅迫。

3.4 與信號(hào)通路相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

一些控制適應(yīng)環(huán)境變化的信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控、繁殖和應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過程。在本研究中，參與MAPK信號(hào)通路的絲裂原活化蛋白激酶、Ras蛋白質(zhì)、Rho家族蛋白質(zhì)、推定熱休克同源70蛋白質(zhì)表達(dá)均下調(diào)，說明草菇受到低溫脅迫時(shí)MAPK信號(hào)通路受到抑制。

3.5 與活性氧代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

受到低溫等非生物脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝往往被破壞，活性氧自由基大量積累并引發(fā)或加劇脂質(zhì)過氧化作用，傷害膜系統(tǒng)和體內(nèi)大分子。過氧化氫酶（catalase，CAT）是植物重要活性氧清除酶。CAT蛋白表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致H2O2的累積，從而對(duì)草菇細(xì)胞造成氧化傷害，推測(cè)CAT活性與草菇自溶相關(guān)。

3.6 與膜脂代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

脂肪酸是生物膜的核心組成部分，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成、能量產(chǎn)生和儲(chǔ)存，控制蛋白質(zhì)定位和其他生物學(xué)重要分子的生物合成。脂肪酸合成酶α亞基的表達(dá)上調(diào)可能通過增大細(xì)胞膜的通透性以增加白靈菇的代謝產(chǎn)物[32]。FAD結(jié)合蛋白質(zhì)是一種膜結(jié)合蛋白質(zhì)，參與催化不飽和脂肪酸的生物合成，參與生物和非生物脅迫防御反應(yīng)[33-34]。膜脂不飽和脂肪酸含量升高能提高植物的耐寒性[35]。數(shù)據(jù)顯示脂肪酸合成酶α亞基和FAD結(jié)合蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，說明草菇可能通過提高合成不飽和脂肪酸的能力來增加耐寒性，但細(xì)胞膜通透性增大被認(rèn)為是因?yàn)榈蜏貙?duì)植物的傷害，脂肪酸合成酶α亞基可能與低溫自溶相關(guān)。

脂氧合酶催化多元不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)，生成脂肪酸過氧化物和大量的活性氧自由基，其作用的底物主要是細(xì)胞質(zhì)膜的多元不飽和脂肪酸，如亞油酸、亞麻酸等。本研究鑒定到亞油酸10R-脂氧合酶的表達(dá)上調(diào)，表明草菇的膜脂過氧化作用被促進(jìn)。

3.7 與核糖體代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

核糖體代謝通路涉及到的大多數(shù)差異蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，上調(diào)的差異蛋白質(zhì)包括核糖體蛋白質(zhì)、40S核糖體蛋白質(zhì)S4和60S核糖體蛋白質(zhì)L33及未知蛋白質(zhì)。核糖體蛋白質(zhì)不僅能與核糖體RNA組合成新的核糖體，還具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等核糖體外功能[36]。推測(cè)低溫脅迫對(duì)草菇核糖體形成和核糖體體外功能具有一定影響，核糖體蛋白質(zhì)可能與草菇低溫自溶相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究草菇子實(shí)體響應(yīng)4 ℃低溫脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，從蛋白質(zhì)水平了解草菇低溫自溶的機(jī)理。結(jié)果表明，64 種上調(diào)蛋白質(zhì)和268 種下調(diào)蛋白質(zhì)響應(yīng)低溫脅迫，生物信息學(xué)分析從宏觀角度反映了草菇自溶后的生物學(xué)功能和代謝通路變化，討論部分具體分析了與能量代謝等7 種代謝過程相關(guān)差異蛋白質(zhì)，認(rèn)為ATP合成酶β亞基、丙酮酸脫氫酶E1α亞基、碳水化合物酯酶家族9蛋白質(zhì)、與EXG1-exo-beta-1,3-葡聚糖酶相關(guān)的蛋白質(zhì)、TPS、TP、CAT和核糖體蛋白質(zhì)等差異蛋白質(zhì)可能與草菇低溫自溶相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。