吳志亮，黃 瑩,，王則金,

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建省農副產品保鮮技術開發(fā)基地，福建 福州 350002）

草菇（Volvariella volvacea）又稱作中國蘑菇，是熱帶、亞熱帶地區(qū)栽培最多的食用菌之一。草菇是典型的高溫型食用菌，適于在高溫環(huán)境下生長。當生長溫度低于15 ℃時，草菇菌絲體的活力下降、生長變緩甚至死亡。當貯藏溫度低于15 ℃時，草菇子實體也在12 h內發(fā)生自溶。草菇低溫自溶的特性制約了草菇菌種保藏和子實體生產流通，嚴重影響了該產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

目前，國內外的研究多集中于草菇菌絲體的基因水平變化。Bao Dapeng等[1]將草菇的菌絲體在4 ℃下處理0、2 h和4 h，然后通過檢測每個階段中表達的mRNA來研究草菇的低溫自溶。Gong Ming等[2-3]進一步通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析發(fā)現(xiàn)，草菇菌絲體在4 ℃下處理4、6 h和8 h后，泛素綴合酶E2和一個具有F-box結構域細胞周期特定類型的蛋白質的基因表達顯著上調，這兩個基因被認為與草菇的低溫自溶相關。關于草菇自溶時的蛋白質水平變化鮮見報道。本研究以草菇子實體為對象，利用蛋白質組學技術研究草菇子實體響應低溫脅迫的差異蛋白質，揭示草菇發(fā)生低溫自溶后的代謝通路變化，旨在為草菇低溫自溶機理的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗草菇（Volvariella volvacea）品種為V23，購于福建省漳州市角美鎮(zhèn)佳興食用菌合作社。于清晨6點采摘蛋形期草菇，采后立即運回福建農林大學保鮮實驗室。

iTRAQ試劑盒 美國SCIEX公司；Bradford蛋白質濃度測定試劑盒 美國Bio-Rad公司；RNAiso Plus試劑盒、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、TB Green? Premix ExTaq?試劑盒 日本Takara公司；鹽酸、氯乙酰胺、乙酸乙酯、脫氧膽酸鈉、三氟乙酸、乙二胺四乙酸、尿素、碘乙酰胺、三羥甲基氨基甲烷、二甲基亞砜、二硫蘇糖醇、六水合氯化鐵、十二烷基硫酸鈉、三氯乙酸 美國Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸 美國Thermo Fisher公司；乙基苯基聚乙二醇、甲醇、引物 上海生工生物工程股份有限公司；其他常用化學試劑（分析純） 國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Triple TOF 5600 plus串聯(lián)四極桿飛行時間液相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國SCIEX公司；1260半制備型液相色譜儀 美國Agilent公司；JY98-IIN超聲波細胞破碎儀寧波新芝生物科技有限公司；NanoLC-Ultra 1Dplus液相色譜儀 美國Eksigent公司；5424 R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；T10研磨儀 德國IKA公司；SimpliAmp熱循環(huán)儀、7300 qPCR系統(tǒng) 美國應用生物系統(tǒng)公司；FluorChem FC3凝膠成相分析系統(tǒng)美國ProteinSimple公司；DW-86L626超低溫冰箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

挑選橢圓形、大小均一、無機械損傷的草菇作為實驗對象，新鮮草菇設為對照組，低溫脅迫處理組的草莓置于溫度為4 ℃的冷庫內12 h。取部分進行拍照；其他取樣后立即使用液氮速凍，并保存于-80 ℃冰箱中備用。實驗重復2 次。

1.3.2 蛋白質提取及質量濃度測定

取1 mg草菇組織樣本，加入5.0 mL裂解液（含2.5 g/100 mL十二烷基硫酸鈉、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0），充分混合均勻。使用組織破碎儀進行組織破碎勻漿，煮沸10 min，超聲（80 W）處理10 min后，12 000 r/min離心15 min，取上清液。加入上清液5 倍體積的預冷10 g/100 mL三氯乙酸-丙酮溶液，振蕩混合，在-20 ℃放置2 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。加入預冷丙酮清洗沉淀，充分混勻后，在冰上放置15 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集沉淀，此步驟重復2 次。向得到的蛋白質沉淀中加入500 μL復溶液（含8 mol/L尿素、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0）。復溶后，加入200 μL現(xiàn)配的二硫蘇糖醇溶液（含50 mmol/L 二硫蘇糖醇、8 mol/L尿素、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0），37 ℃水浴1 h。加入100 μL現(xiàn)配的碘乙酰胺溶液（含50 mmol/L碘乙酰胺、8 mol/L尿素、100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 8.0），于室溫靜置1 h。于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液（蛋白溶液）。根據(jù)Bradford法測定上清液蛋白質量濃度。

1.3.3 蛋白組成測定

蛋白質定量后取1.3.2節(jié)所得的蛋白溶液（含50 μg蛋白質），采用12 g/100 mL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。分離后的凝膠采用考馬斯亮藍染色法進行染色。具體操作如下：固定2 h，染色12 h，水洗至背景清晰。染色后的凝膠使用FluorChem FC3凝膠成相分析系統(tǒng)進行掃描，掃描模式為全彩模式。

1.3.4 胰蛋白酶酶解及標記

在蛋白溶液中加入100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（pH 8.0）。按照酶與蛋白質1∶50的質量比加入胰蛋白酶，在37 ℃下孵育振蕩過夜。第2天加入1.5 μL體積分數(shù)0.1%三氟乙酸終止酶切，并調節(jié)溶液pH值至6.0，12 000 r/min離心15 min。取上清液進行固相萃取柱Sep-Pak C18脫鹽，除鹽后的肽段溶液經離心濃縮儀抽干后，在-20 ℃下凍存待用。每個樣品取100 μg酶解后的肽段進行同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）標記。標記后的樣品混合后使用Sep-Pak C18進行除鹽，真空抽干。

1.3.5 高效液相反相色譜分離

采用1260半制備型高效液相色譜儀對混合樣品進行反相色譜分離，最終合并為15 個組分。色譜柱：TechMate C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A：20 mmol/L甲氨酸，用氨水調pH值至10；流動相B：20 mmol/L甲氨酸（溶劑為體積分數(shù)80%乙腈溶液）；進樣體積：100 μL；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL/min；運行時間：60 min；圖像二極管陣列檢測器檢測吸收波長：216 nm；四元泵梯度洗脫。

1.3.6 液相二級質譜分析

采用串聯(lián)四極桿飛行時間液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀對樣品進行液相二級質譜分析。

液相色譜條件：肽段樣品通過自動進樣器吸入后結合至C18捕獲柱（5 mm×0.3 mm，5 μm）后，被洗脫至Eksigent C18色譜柱（75 μm×150 mm，3 μm）進行分離。利用流動相A（含3%（體積分數(shù)，下同）二甲基亞砜、0.1%甲酸的水溶液）和流動相B（含3%二甲基亞砜、0.1%甲酸-乙腈溶液）建立100 min的分析梯度（0 min，5% B；0～65 min，5%～23% B；65～85 min，2 3%～5 2% B；8 5 ～8 6 m i n：5 2%～8 0% B；86～90 min，80% B；90～90.1 min，80%～5% B；90.1～100 min，5% B）。流速：300 nL/min。

質譜條件：掃描方式為質譜數(shù)據(jù)依賴型掃描模式分析，每個掃描循環(huán)中包含1 個MS全掃描（質量掃描范圍：m/z350～1 500，離子累積時間：250 ms）以及40 個MS/MS掃描（質量掃描范圍：m/z100～1 500，離子累積時間：50 ms）。

1.3.7 生物信息學分析

實驗數(shù)據(jù)采用ProteinPilot 4.5軟件分析，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫中傘菌目的Uniprot.taxonomy.Agaricales.20190429.fasta蛋白質序列參考數(shù)據(jù)庫。檢索結果以Unused≥1.3為標準篩選可信蛋白質信息用作后續(xù)的分析。為了獲得基因本體（gene ontology，GO）注釋分析、同源蛋白簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析的數(shù)據(jù)，將差異蛋白質數(shù)據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）和KEGG數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/）并分析。

1.3.8 RNA提取、逆轉錄和qPCR

使用RNAiso Plus試劑盒提取樣品的總RNA。使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒去除樣品總RNA中的基因組DNA并進行逆轉錄。使用TB Green? Premix ExTaq?試劑盒進行qPCR。使用微管蛋白α（tubulin-α，TUB）作為草菇的內參基因來驗證甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和NADH-泛醌氧化還原酶（NADH-quinone oxidoreductase，NADH）的基因。使用NCBI引物設計工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）設計引物（表1）。使用2ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 草菇受低溫脅迫的形態(tài)變化

圖1 草菇響應低溫脅迫的形態(tài)變化Fig. 1 Changes in the morphology of straw mushroom in response to cold stress

草菇子實體由菌膜、菌托、菌傘、菌柄、菌褶構成。新鮮草菇的外部上方為灰黑色，往下至菌托漸淡，位于內部的成分均為白色，帶有草菇特有清香（圖1A）。經低溫（4 ℃）處理12 h后，草菇發(fā)生了自溶，草菇表面覆蓋水珠并發(fā)生褐變，內部以菌膜褐變最為嚴重，內部間隙可見自溶產生的積液，質地變軟萎蔫，發(fā)出腐爛的惡臭味（圖1B）。

2.2 草菇菌傘組織蛋白分析結果

分別從新鮮的草菇和經低溫處理的草菇的菌傘組織提取蛋白質，根據(jù)Bradford法測定得對照組C1、C2和低溫脅迫處理組CS1和CS2的上清液蛋白質量濃度分別為2.35、3.05、2.69 μg/μL和2.39 μg/μL，隨后進行SDS-PAGE。由圖2可知，樣品的SDS-PAGE圖條帶清晰，樣品之間平行度較好，對照組與低溫處理組之間具有一定差異。蛋白質提取樣本量足夠，樣品量適于進行后續(xù)實驗。

圖2 草菇菌傘組織蛋白響應低溫脅迫的SDS-PAGE圖Fig. 2 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of proteins in straw mushroom in response to cold stress

2.3 差異蛋白質篩選結果

表2 變化倍數(shù)較高的上調蛋白質Table 2 List of highly up-regulated proteins

草菇在4 ℃下處理12 h后，其蛋白質表達發(fā)生了一定的變化。樣品經質譜檢測，篩選出2 455 種Unused≥1.3的可信蛋白質。以P＜0.05、變化倍數(shù)≥1.5或≤0.667（1/1.5）為依據(jù)篩選出332 種差異蛋白質，其中包含了64 種上調蛋白質、268 種下調蛋白質。表2列出了20 種變化倍數(shù)較高的上調蛋白質信息。圖3為所有差異蛋白質的火山圖，黑色為沒有顯著差異的蛋白質，藍色為顯著下調的差異蛋白質，紅色為顯著上調的差異蛋白質。

圖3 草菇響應低溫脅迫差異蛋白質的火山圖Fig. 3 Volcanic map of differentially expressed proteins of straw mushrooms in response to cold stress

2.4 GO注釋分析結果

為進一步了解草菇在低溫脅迫下差異蛋白質的生物學功能，對差異蛋白質進行GO注釋分析，從生物學過程、細胞組成和分子功能方面進行富集分析。生物學過程注釋表明差異蛋白質主要參與細胞過程（37.04%）、代謝過程（31.71%）、定位（10.42%）、生物調節(jié)（8.33%）、細胞成分的組織或生物發(fā)生（7.18%）、應激響應（3.94%）。細胞組分注釋表明差異蛋白質主要分布在細胞部分（37.68%）、含蛋白質的復合物（21.92%）、細胞器（14.04%）和細胞器部分（13.05%）等。分子功能主要涉及結合活性（45.97%）、催化活性（40.52%）和結構分子活性（8.31%）等。

圖4 草菇響應低溫脅迫差異蛋白質的GO注釋分析Fig. 4 Gene ontology analysis for differentially expressed proteins of straw mushrooms in response to cold stress

2.5 KEGG通路分析結果

為了進一步了解草菇受到低溫脅迫時代謝通路的途徑信息，將差異蛋白質上傳到KEGG網站，以注釋序列和代謝途徑。在P＜0.05的范圍內，有109 種差異蛋白質被注釋到57 條KEGG通路上。其中差異蛋白質數(shù)量最多的通路是核糖體，有28 種，通路圖是map03010（圖5）。其次是RNA轉運，有15 種。與甲型流感相關的差異蛋白質有13 種。與肌動蛋白細胞骨架調節(jié)相關的差異蛋白質有11 種。與緊密連接相關的差異蛋白質有10 種。與病毒致癌相關的差異蛋白質有10 種。與精氨酸和脯氨酸代謝相關的差異蛋白質有10 種。由此可見，草菇在受到低溫脅迫后，核糖體、RNA轉運等代謝通路受到較大影響。

2.6 COG分析結果

為研究草菇響應低溫脅迫的差異蛋白質，將鑒定到的蛋白質和COG數(shù)據(jù)庫進行比對，共計328 種蛋白質獲得注釋，分為22 種COG功能，分別用A～Z表示（表3）。如表3所示，P＜0.05的功能聚類有J（翻譯、核糖體結構和生物合成）、Z（細胞骨架）、Y（細胞核結構），分別包含61、19、8 種差異蛋白質。這表明低溫脅迫主要影響了草菇的J、Z、Y功能，結果與KEGG通路分析結果一致。

表3 草菇響應低溫脅迫的差異蛋白質COG聚類Table 3 COG clustering of differentially expressed proteins of straw mushroom in response to cold stress

2.7 qPCR驗證實驗結果

Western bloting技術是驗證蛋白質組數(shù)據(jù)的最佳方法，但食用菌大多數(shù)蛋白質缺乏針對性的抗體，所以采用qPCR技術驗證草菇蛋白質組學數(shù)據(jù)[4]。篩選常用的內參基因所對應的蛋白質（表4），翻譯延伸因子1-α、β-肌動蛋白、GAPDH在蛋白質水平出現(xiàn)差異表達，不適合作為qPCR驗證實驗的內參基因。選擇變化倍數(shù)小于10%的TUB-β作為qPCR驗證實驗的內參基因。NADH-泛醌氧化還原酶是線粒體呼吸鏈的復合物Ⅰ，是具有代表性的差異蛋白質。如表5所示，甘油醛-3-磷酸脫氫酶和NADH-泛醌氧化還原酶的基因轉錄水平表達變化和蛋白質水平一致。

表4 與內參基因相關的差異蛋白質Table 4 Differentially expressed proteins related to house-keeping genes

圖5 涉及核糖體的差異表達蛋白質的KEGG代謝途徑Fig. 5 Metabolic pathway maps of differentially expressed proteins involved in ribosome in KEGG

表5 關鍵蛋白質qPCR驗證結果Table 5 qPCR validation of key proteins

3 討 論

有研究表明低溫脅迫可影響草菇的膜脂代謝、活性氧代謝、海藻糖代謝等相關生物學過程[5-7]。本研究利用iTRAQ蛋白質組學技術定量了草菇響應低溫脅迫的蛋白質，一些差異表達的蛋白質可能在草菇響應低溫脅迫的代謝過程中起重要作用。討論部分歸納分析了與能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸合成與代謝、信號通路、活性氧代謝、膜脂代謝、核糖體代謝等代謝過程相關的差異蛋白質，旨在為草菇低溫自溶機理的研究提供新的線索。

3.1 與能量代謝相關的差異蛋白質

線粒體主呼吸鏈（N A D H 呼吸鏈）由復合物I（NADH-泛醌氧化還原酶）、復合物III（細胞色素b-c1）和復合物V（ATP合成酶）組成[8]。NADH-泛醌氧化還原酶位于線粒體內膜，催化電子從NADH傳遞至輔酶Q[9]。細胞色素b-c1偶聯(lián)催化電子由氫醌到細胞色素c的轉移和質子基質由膜內向膜外空間的運輸。ATP合成酶α亞基能夠調節(jié)ATP合成酶的活性，ATP合成酶在跨膜質子動力勢的推動下合成ATP[10]。蛋白質組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)NADH-醌氧化還原酶、細胞色素b-c1復合物亞基Rieske和ATP合成酶α亞基在草菇進行低溫處理后上調，推測其通過NADH呼吸鏈增強呼吸強度以產生更多的能量以對抗低溫脅迫。草菇在低溫貯藏時仍具有較強的呼吸作用，線粒體主呼吸鏈相關蛋白質上調可能是該現(xiàn)象的內在原因。

丙酮酸激酶參與糖酵解過程中最后的不可逆終反應，催化生成ATP和丙酮酸，在細胞能量代謝過程中具有重要的作用[11]。檸檬酸合成酶在三羧酸循環(huán)的第一步反應中，催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸[12]。上述兩個上調的差異蛋白質可能在草菇受到低溫脅迫時調控能量代謝途徑。

此外，數(shù)據(jù)顯示ATP合成酶β亞基下調和丙酮酸脫氫酶E1α亞基上調。ATP合成酶β亞基功能紊亂與糖尿病、肥胖等多種疾病相關。研究表明，ATP合成酶β亞基的下調會加重小鼠糖尿病腎病[13]，肥胖患者骨骼肌ATP合成酶β亞基合成率和活性降低[14]。丙酮酸脫氫酶E1α亞基突變或者磷酸化是丙酮酸脫氫酶系缺失的主要原因，丙酮酸脫氫酶系缺失可導致線粒體代謝紊亂[15]。低溫脅迫可能導致了草菇線粒體代謝和ATP合成酶代謝紊亂，ATP合成酶β亞基和丙酮酸脫氫酶E1α亞基可能與草菇自溶相關。

3.2 與碳水化合物代謝相關的差異蛋白質

真菌細胞壁降解的酶機制十分復雜，需要大量的糖苷水解酶和碳水化合物裂解酶。糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）催化糖苷鍵的水解，是細菌、真菌、植物和哺乳動物中碳水化合物代謝中的重要酶類[16]。GH家族13的代表酶類有α淀粉酶、環(huán)糊精葡萄糖轉移酶和分支酶，可作用于淀粉、蔗糖等的α-葡聚糖[16]。對GH家族63研究最多的酶是α-葡萄糖苷酶I，其特異性水解Glc3Man9GlcNAc2的末端α-1,2-葡萄糖苷鍵[17]。醛脫氫酶廣泛存在于白腐菌擔子菌中，它們參與真菌木質素和芳香異生素的降解[18]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物合成木質素的關鍵酶[19]。此外，轉酮酶是磷酸戊糖途徑的關鍵酶，在磷酸戊糖途徑與糖酵解的連接中起著至關重要的作用[20-21]。數(shù)據(jù)表明GH家族13、GH家族63、醛脫氫酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、轉酮酶這5 種蛋白質的表達量下調，說明受到低溫脅迫時草菇的磷酸戊糖途徑受到抑制，水解酶活性和木質素相關的代謝下降以減少不必要的能量和物質消耗。但本研究發(fā)現(xiàn)2 個具有水解酶活性的蛋白質表達上調，分別是碳水化合物酯酶家族9蛋白質和與EXG1-exo-beta-1,3-葡聚糖酶相關的蛋白質。推測這兩個差異蛋白質可能在草菇遭受低溫脅迫時使草菇的細胞壁發(fā)生降解，推測其與草菇低溫自溶相關。

海藻糖是真菌中重要的貯藏性碳源之一，可被海藻糖酶水解成葡萄糖提供能量，又可在低溫、干旱等脅迫環(huán)境下保護細胞[22-23]。在本研究中，海藻糖-6-磷酸合酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）和海藻糖磷酸化酶（trehalose phosphorylase，TP）表達下調，而海藻糖酶表達無顯著性變化。TPS參與海藻糖合成途徑[22]，TP則同時參與海藻糖的分解和合成[24]。TPS和TP蛋白質表達下調導致草菇耐寒性下降，這可能是草菇對低溫敏感的主要原因之一。

3.3 與氨基酸合成和代謝相關的差異蛋白質

天冬氨酸氨基轉移酶催化酸性氨基酸和相應的酮酸相應轉化，對氨基酸代謝過程起到非常重要的作用[25]。O-乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶參與硫酸鹽同化途徑及半胱氨酸合成[26]。氨肽酶是一種蛋白酶，常應用于改善食品的風味，還應用于制備活性肽和蛋白質序列檢測等領域[27-28]，亮氨酸氨肽酶是最具代表性的氨肽酶，對N端帶有亮氨酸殘基的底物具有很高水解活性[29]。由主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）I類分子呈遞的抗原主要由細胞溶質中的蛋白酶產生。人類細胞中的細胞溶質氨肽酶以等位基因依賴性的方式影響MHC I類分子呈遞的抗原表達[30]。翻譯延伸因子1α是重要的翻譯因子，參與信號傳導、翻譯控制、凋亡、細胞骨架組成、病毒復制及癌基因轉化等重要的細胞過程和疾病[31]。天冬氨酸氨基轉移酶、O-乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶、亮氨酸氨肽酶、細胞溶質氨肽酶、翻譯延伸因子1α這5 種差異蛋白質在草菇受到低溫脅迫時表達上調，推測其參與調節(jié)氨基酸的合成和代謝以響應低溫脅迫。

3.4 與信號通路相關的差異蛋白質

一些控制適應環(huán)境變化的信號通路對細胞周期調控、繁殖和應激反應至關重要。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路是生物體內重要的信號轉導系統(tǒng)之一，參與介導細胞生長、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過程。在本研究中，參與MAPK信號通路的絲裂原活化蛋白激酶、Ras蛋白質、Rho家族蛋白質、推定熱休克同源70蛋白質表達均下調，說明草菇受到低溫脅迫時MAPK信號通路受到抑制。

3.5 與活性氧代謝相關的差異蛋白質

受到低溫等非生物脅迫時，細胞內自由基代謝往往被破壞，活性氧自由基大量積累并引發(fā)或加劇脂質過氧化作用，傷害膜系統(tǒng)和體內大分子。過氧化氫酶（catalase，CAT）是植物重要活性氧清除酶。CAT蛋白表達下調可能導致H2O2的累積，從而對草菇細胞造成氧化傷害，推測CAT活性與草菇自溶相關。

3.6 與膜脂代謝相關的差異蛋白質

脂肪酸是生物膜的核心組成部分，參與細胞結構形成、能量產生和儲存，控制蛋白質定位和其他生物學重要分子的生物合成。脂肪酸合成酶α亞基的表達上調可能通過增大細胞膜的通透性以增加白靈菇的代謝產物[32]。FAD結合蛋白質是一種膜結合蛋白質，參與催化不飽和脂肪酸的生物合成，參與生物和非生物脅迫防御反應[33-34]。膜脂不飽和脂肪酸含量升高能提高植物的耐寒性[35]。數(shù)據(jù)顯示脂肪酸合成酶α亞基和FAD結合蛋白質表達上調，說明草菇可能通過提高合成不飽和脂肪酸的能力來增加耐寒性，但細胞膜通透性增大被認為是因為低溫對植物的傷害，脂肪酸合成酶α亞基可能與低溫自溶相關。

脂氧合酶催化多元不飽和脂肪酸的過氧化反應，生成脂肪酸過氧化物和大量的活性氧自由基，其作用的底物主要是細胞質膜的多元不飽和脂肪酸，如亞油酸、亞麻酸等。本研究鑒定到亞油酸10R-脂氧合酶的表達上調，表明草菇的膜脂過氧化作用被促進。

3.7 與核糖體代謝相關的差異蛋白質

核糖體代謝通路涉及到的大多數(shù)差異蛋白質表達下調，上調的差異蛋白質包括核糖體蛋白質、40S核糖體蛋白質S4和60S核糖體蛋白質L33及未知蛋白質。核糖體蛋白質不僅能與核糖體RNA組合成新的核糖體，還具有調控基因轉錄、細胞增殖、分化和凋亡等核糖體外功能[36]。推測低溫脅迫對草菇核糖體形成和核糖體體外功能具有一定影響，核糖體蛋白質可能與草菇低溫自溶相關。

4 結 論

本研究利用iTRAQ蛋白質組學技術研究草菇子實體響應4 ℃低溫脅迫的蛋白質表達變化，從蛋白質水平了解草菇低溫自溶的機理。結果表明，64 種上調蛋白質和268 種下調蛋白質響應低溫脅迫，生物信息學分析從宏觀角度反映了草菇自溶后的生物學功能和代謝通路變化，討論部分具體分析了與能量代謝等7 種代謝過程相關差異蛋白質，認為ATP合成酶β亞基、丙酮酸脫氫酶E1α亞基、碳水化合物酯酶家族9蛋白質、與EXG1-exo-beta-1,3-葡聚糖酶相關的蛋白質、TPS、TP、CAT和核糖體蛋白質等差異蛋白質可能與草菇低溫自溶相關，值得進一步研究。