王飛飛，吳豪益，林 晨，張 巖，傅玲琳，王彥波,

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091）

細(xì)菌生物膜廣泛存在于各種食品和食品加工表面，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜不僅可以引起食源性疾病爆發(fā)，與食品腐敗也有著顯著的相關(guān)性，嚴(yán)重制約了食品工業(yè)的健康發(fā)展[1]。鑒于此，食源性細(xì)菌生物膜的控制引起了廣泛的關(guān)注。研究表明，細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中，為了適應(yīng)生存環(huán)境，由細(xì)菌自身分泌的多糖、DNA、蛋白質(zhì)等胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的一個(gè)具有三維立體空間結(jié)構(gòu)的生態(tài)群落[2]。在生物膜的保護(hù)下，細(xì)菌能耐受高濃度的抗菌劑和食品防腐劑，顯著增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)[3]。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)在食源性細(xì)菌生物膜形成的各階段起著關(guān)鍵調(diào)控作用，因此，通過特定的方法有效阻斷細(xì)菌Q S 系統(tǒng)即群體淬滅（q u o r u m quenching，QQ），成為一種新型的控制細(xì)菌生物膜的手段，得到了廣泛研究[4]。

1 基于食源性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的生物膜形成

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞接觸到食品或食品加工表面時(shí)，通過鞭毛、菌毛和一些表面蛋白等進(jìn)行細(xì)胞的初始附著，逐漸形成生物膜微菌落，微菌落通過細(xì)胞增殖生長(zhǎng)并產(chǎn)生大量EPS，負(fù)責(zé)細(xì)胞間的黏附并形成細(xì)胞支架，從而維持生物膜的三維結(jié)構(gòu)。細(xì)胞被緊密地包裹在生物膜中，逐漸實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的積累，并通過QS信號(hào)分子進(jìn)行交流。反過來，響應(yīng)種群密度閾值觸發(fā)的QS參與調(diào)節(jié)生物膜形成的各個(gè)階段，從而形成一個(gè)完整的“附著-微菌落形成-成熟-分散”生物膜生命周期[1]（圖1）。

圖1 QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌生物膜生命周期Fig. 1 Regulation of the QS system on the biofilm life cycle

細(xì)菌QS系統(tǒng)依賴于細(xì)胞外化學(xué)信號(hào)分子即自誘導(dǎo)因子的產(chǎn)生、釋放和檢測(cè)。這些信號(hào)分子在環(huán)境中進(jìn)行局部積累，當(dāng)達(dá)到適當(dāng)?shù)拈撝禎舛群?，與受體蛋白相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌特定基因的表達(dá)發(fā)生相應(yīng)變化。在革蘭氏陰性菌中，?；呓z氨酸內(nèi)酯（acylhomoserine lactones，AHLs）信號(hào)分子由一種LuxI型酶合成。在AHLs達(dá)到適當(dāng)?shù)拈撝禎舛群蠹せ頛uxR受體蛋白，使靶效應(yīng)基因得以轉(zhuǎn)錄[5-7]。革蘭氏陽性菌可以產(chǎn)生AIP，并通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，由膜結(jié)合的激酶受體傳感器和細(xì)胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白組成的雙組分以及調(diào)節(jié)效應(yīng)器RNAIII來改變靶基因表達(dá)。AI-2則被認(rèn)為是種間通用的信號(hào)分子，廣泛存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中，而LuxS是合成AI-2的關(guān)鍵酶，LuxS催化S-核糖同型半胱氨酸裂解為同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD），DPD隨后進(jìn)行自發(fā)重排和修飾，形成一種分子混合物，統(tǒng)稱為AI-2[8]。

研究表明，QS系統(tǒng)信號(hào)分子的合成在食源性細(xì)菌生物膜形成中起著重要作用。首先是負(fù)責(zé)編碼AHLs信號(hào)分子合成酶的luxI型基因，洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia）具有兩套QS系統(tǒng)cepIR和cciIR，其中，基因cepI和cciI分別編碼合成C6-HSL和C8-HSL信號(hào)分子的LuxI型信號(hào)分子合成酶。研究發(fā)現(xiàn)Burkholderia cenocepaciaK56-2的cepI和B. cenocepaciaJ2315的cepI和cciI突變株在生物膜形成方面存在缺陷[9-10]。同樣地，編碼合成AHLs信號(hào)分子的luxI型基因ahyI和swrI突變分別導(dǎo)致嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）形成缺乏微菌落的未成熟生物膜[11]。此外，luxS基因缺失會(huì)影響AI-2的合成從而影響弧菌屬（Vibriospp.）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）生物膜的形成[12-13]。AIP和調(diào)節(jié)效應(yīng)器RNAIII生成能力缺失影響金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生物膜形成[14]。由此可見，不管是革蘭氏陰性菌還是陽性菌，信號(hào)分子合成酶基因的缺失或突變都可以通過阻礙信號(hào)分子合成，從而影響信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而影響生物膜形成。

近年來，研究進(jìn)一步闡明了QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌生物膜形成的分子機(jī)制。在生物膜形成的初始階段，QS系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)黏附素和鞭毛等相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)菌與表面的附著能力。研究發(fā)現(xiàn)，luxR基因缺失導(dǎo)致波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）鞭毛馬達(dá)基因pomA表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致生物膜形成能力受損[15]；S. aureus的luxS突變體通過改變r(jià)fb基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)依賴于多糖黏附素的生物膜形成[16]。此外，QS系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)EPS的分泌來調(diào)控生物膜的成熟。泰蘭伯克霍爾德氏菌（Burkholderia thailandensis）luxR的同源基因btaR1突變體通過降低EPS中的巖藻糖含量，從而形成喪失穹頂結(jié)構(gòu)的生物膜[17]；Pseudomonas aeruginosa的3 個(gè)QS系統(tǒng)（las、rhl和pqs）均可通過調(diào)節(jié)EPS中eDNA的釋放，從而影響生物膜結(jié)構(gòu)[18]；pqsQS系統(tǒng)還能通過調(diào)控前噬菌體進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，引起eDNA釋放，影響生物膜形成[18]；此外，生物膜約30%的EPS蛋白來自膜泡（membrane vesicle，MV），而MV的產(chǎn)生受las和pqsQS系統(tǒng)調(diào)控[19]；同樣地，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QS系統(tǒng)oppA、oppF、comX、comP和comA的基因突變，也能導(dǎo)致EPS中eDNA的釋放缺陷，從而影響生物膜形成[20]。QS系統(tǒng)在生物膜的分散階段也起著重要的調(diào)控作用。在生物膜成熟后期，創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）的LuxR同源蛋白SmcR通過誘導(dǎo)莢膜多糖基因簇的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生莢膜多糖，其親水性促進(jìn)了生物膜結(jié)構(gòu)的分散[21]；S. aureus的agrQS系統(tǒng)通過控制psm基因的表達(dá)產(chǎn)生表面活性劑從而促進(jìn)生物膜分散以及生物膜的傳播定植[22]。

2 基于食源性細(xì)菌群體淬滅的生物膜控制

目前，食品工業(yè)仍在使用常規(guī)的細(xì)菌生物膜控制手段，包括良好的生產(chǎn)衛(wèi)生、合理生產(chǎn)線的運(yùn)行以及有效使用清潔消毒劑等[1]。隨著生物膜對(duì)常規(guī)消毒劑的抵抗力日益增強(qiáng)，為了滿足食品加工系統(tǒng)對(duì)食品安全的要求，需要一種更有效、更環(huán)保的控制手段。QS淬滅劑是一類在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下，以QS系統(tǒng)為作用靶點(diǎn)，通過干擾、阻斷細(xì)菌QS系統(tǒng)從而達(dá)到有效控制生物膜的新型化合物；因此，基于QQ的生物膜控制還可以最大限度地減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。根據(jù)QS調(diào)控細(xì)菌生物膜形成的分子機(jī)制，目前QQ機(jī)制主要有以下幾種：抑制信號(hào)分子的合成、信號(hào)分子酶解失活、與信號(hào)分子受體結(jié)合（比如阻斷信號(hào)分子-受體復(fù)合物的形成）[23-24]。

2.1 抑制信號(hào)分子的合成

在信號(hào)分子合成階段，抑制信號(hào)分子合成過程酶的活性、抑制信號(hào)分子前體物質(zhì)的合成、添加前體物質(zhì)類似物等都可以起到抑制信號(hào)分子合成的作用。AHL是由LuxI家族蛋白將一個(gè)酰基載體蛋白的脂肪?；苌镛D(zhuǎn)移到S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）的氨基上而形成的。因此，SAM或脂肪酸生物合成抑制劑可用作AHL信號(hào)產(chǎn)生的抑制劑；另外，腺苷同型半胱氨酸和5-甲基硫代腺苷等各種SAM類似物通過競(jìng)爭(zhēng)SAM催化位點(diǎn)也可以抑制AHL信號(hào)的產(chǎn)生[8]。Christensen等[25]利用高通量酶聯(lián)體外篩選技術(shù)得到一系列AHL合成酶的潛在抑制劑，其中化合物1～3（化合物篩選結(jié)果見Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=720554，accession no. AID 720554）可以顯著抑制鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei）BmaI1和鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）YspI的AHL信號(hào)分子合成活性。肉桂醛可以與信號(hào)分子合成酶LasI和RhlI的底物結(jié)合位點(diǎn)相互作用，抑制P. aeruginosaQS系統(tǒng)關(guān)鍵下游基因lasB、rhlA和pqsA的表達(dá)，從而影響生物膜形成[26]。同樣地，真菌次生代謝物氨丁酸可以通過抑制信號(hào)分子合成酶AgrB的活性來抑制不同革蘭氏陽性菌AIP的生物合成[27]。此外，有研究表明與LuxS催化位點(diǎn)同源的小分子肽5411（MHTLEHLFAGFM）和5906（MLFAGFM）通過與LuxS特異性結(jié)合從而抑制遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）AI-2的產(chǎn)生，進(jìn)而使生物膜得到控制[28]。

2.2 信號(hào)分子的酶解

合成的QS信號(hào)分子可以通過酶進(jìn)行降解，以防止其積累和隨后的QS系統(tǒng)激活。這些酶通過降解產(chǎn)生的信號(hào)分子，進(jìn)而控制生物膜形成。目前，關(guān)于酶解QS信號(hào)分子的研究主要集中在AHL信號(hào)分子。AHL內(nèi)酯酶和?；阜謩e水解AHL分子的高絲氨酸內(nèi)酯（homoserine lactone，HSL）環(huán)和?；鶄?cè)鏈的酰胺鍵從而直接降解AHL信號(hào)分子[29]，AHL分子氧化還原酶可以將信號(hào)分子中的羰基還原成羥基從而使其失活[8]。從鼠尾菌Muricauda oleariaTh120中分離出來的內(nèi)酯酶MomL具有同等降解長(zhǎng)鏈和短鏈AHL的能力[30]，但是其對(duì)生物膜形成的影響有待驗(yàn)證。蠟狀芽孢桿菌VT96（Bacillus cereusVT96）產(chǎn)生的AHL內(nèi)酯酶AiiA可直接控制P. aeruginosaPAO1中胞外多糖的產(chǎn)生及生物膜的形成[31]。芽孢桿菌產(chǎn)生的AHL內(nèi)酯酶AiiAAI96通過酶解威隆氣單胞菌LP-11（Aeromonas veroniiLP-11）產(chǎn)生的AHL，從而降低其蛋白酶活性和細(xì)胞泳動(dòng)性[32]。丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）能產(chǎn)生AHL?；窰acA和HacB，P. syringaeHacA和HacB缺失株的生物膜形成能力明顯增強(qiáng)[33]，說明HacA和HacB能夠破壞AHL分子的酰胺鍵從而控制生物膜形成。目前，還鮮有涉及AHL信號(hào)分子氧化還原酶在控制生物膜形成中的研究，此外，AIP和AI-2信號(hào)分子的降解酶有待挖掘。雖然這些酶的酶解作用是降解信號(hào)分子的主要途徑，但這些酶普遍活性偏低、專一性不夠高、活性受環(huán)境影響大，因此，在信號(hào)分子降解酶的篩選優(yōu)化以及分子改造方面需要進(jìn)一步研究。

2.3 與信號(hào)分子受體結(jié)合

根據(jù)QS系統(tǒng)響應(yīng)機(jī)制，達(dá)到閾值濃度的信號(hào)分子與相應(yīng)受體蛋白特異結(jié)合后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而激活細(xì)菌生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響生物膜形成。基于此，一些人工合成或天然化合物可通過與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合位點(diǎn)，也可以通過非競(jìng)爭(zhēng)性的方式與受體結(jié)合，阻斷信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而達(dá)到控制生物膜的目的。

目前，關(guān)于AHL信號(hào)分子的競(jìng)爭(zhēng)性受體，研究主要集中于其?；鶄?cè)鏈或內(nèi)酯部分的修飾，以及其中心酰胺結(jié)構(gòu)的改變，用以開發(fā)分子類似物，以達(dá)到控制生物膜形成的目的[34]。研究表明，采用環(huán)戊基或環(huán)己酮環(huán)取代內(nèi)酯環(huán)得到的AHL類似物（C9-CPA和C10-CPA）可以顯著影響粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）和P. aeruginosa的生物膜形成[35-36]。在酰基側(cè)鏈修飾芳香基團(tuán)而得到的AHL類似物（苯丙酰高絲氨酸內(nèi)酯和苯氧乙酰高絲氨酸內(nèi)酯）則可以抑制P. aeruginosa生物膜的形成[37]。此外，鄰氨基苯甲酸甲酯能與C4-HSL競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LuxR受體，進(jìn)一步抑制luxI和luxR基因表達(dá)，從而影響溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）生物膜形成[38]。薄荷醇可以通過與LasR和PqsR受體相互作用分別抑制las和pqsQS系統(tǒng)-調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄，從而干擾P. aeruginosa的生物膜形成[39]。

對(duì)于AI-2型QS系統(tǒng)，AI-2和DPD類似物都可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制信號(hào)分子與受體結(jié)合，從而阻斷QS通路。DPD衍生物包括Ac2-DPD、烷基-DPD和DPD碳酸鹽，以及DPD結(jié)構(gòu)類似物如5-羥基-2,3-戊烷二酮和4-羥基-5-甲基-3-(2H)-呋喃酮都可以干擾AI-2型QS系統(tǒng)；一些含二醇化合物（包括鄰苯三酚）、硼酸和砜已被證明可以有效拮抗AI-2與周質(zhì)受體LuxP的結(jié)合[8,40]；惡唑硼酸鹽（含負(fù)電荷硼原子的雜環(huán)水合物）和吩噻嗪也能干擾AI-2型QS系統(tǒng)[41-42]，但是這些化合物在生物膜控制方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。在生物膜控制方面，熊果酸、異丁基-DPD、異丁基-DPD與慶大霉素聯(lián)用、苯基-DPD以及苯基-DPD與慶大霉素聯(lián)用能抑制大腸桿菌（Escherichia coli）和P. aeruginosa生物膜的形成，并能清除預(yù)先形成的生物膜[43-44]。此外，信號(hào)類似物4-甲氧羰基苯基硼酸和SAM腺苷衍生物L(fēng)MC-21在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí)，可降低鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）的生物膜總量[45]。

對(duì)于AIP型QS系統(tǒng)，包括截短類似物（Tr-AIP-I、Tr-AIP-II和Tr-AIP-IV）和N-乙酰化的類似物Tr-(Ala)-AIP-I在內(nèi)的AIP信號(hào)的類似物對(duì)Staphylococcus spp.的QS系統(tǒng)均有抑制作用[46]。另外，發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）產(chǎn)生的環(huán)縮肽磺酰胺A和B，以及羅伊氏乳桿菌RC-14產(chǎn)生的環(huán)二肽L-Tyr-L-Pro和L-Phe-L-Pro能干擾agr QS系統(tǒng)[47-48]。然而，目前關(guān)于這些化合物在生物膜控制中的研究很少。在生物膜控制方面，研究最廣泛的AIP型QS系統(tǒng)抑制肽是RNAIII抑制肽，該抑制肽及其類似物和非肽類似物金縷梅單寧能干擾RAP/TRAP QS系統(tǒng)[49-51]。進(jìn)一步的研究表明，金縷梅單寧可以通過與QS受體TraP結(jié)合，改變S. aureus細(xì)胞壁合成和eDNA的釋放，從而影響生物膜的形成及其抗生素敏感性[52]。

3 結(jié) 語

雖然目前已逐漸將QS淬滅劑作為新型的生物膜清除劑，并提出將兩種或兩種以上不同的控制技術(shù)相結(jié)合的方法來控制生物膜形成，比如QS淬滅劑和傳統(tǒng)抗生素聯(lián)用，利用納米技術(shù)對(duì)QS淬滅劑進(jìn)行改造等產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可以顯著增加生物膜消除效率，并在一定程度上避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。隨著對(duì)新鮮食品、即食食品、加工食品的需求增加和對(duì)食品安全性要求的提高，仍有必要開展以下幾方面研究。

目前，大量研究發(fā)現(xiàn)天然植物和微生物提取物可以作為QS淬滅劑，但其淬滅機(jī)制還有待研究確認(rèn)。例如，Choi等[53]發(fā)現(xiàn)山茱萸提取物具有抗QS活性，并顯著抑制P. aeruginosa、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）和A. tumefaciens生物膜的形成。百里香精油、香芹酚和百里酚能顯著抑制P. fluorescens KM121 AHLs的產(chǎn)生，降低細(xì)胞泳動(dòng)性和鞭毛基因的mRNA水平[54]。黑衣草提取物合成的氧化鋅納米顆粒展現(xiàn)出了廣譜AHL型QS抑制能力，并通過降低細(xì)胞群集運(yùn)動(dòng)和EPS產(chǎn)生從而廣譜抑制4 種食物致病菌的生物膜形成，還可以清除預(yù)先形成的生物膜[55]。極端嗜鹽古生菌提取物反式4-(2-羧基-乙烯基)苯甲酸在lasB-gfp、rhlA-gfp和pqsA-gfp生物傳感菌株上顯示出了QS淬滅性能，并且顯著抑制了P. aeruginosa生物膜形成[56]。Prateeksha等[57]發(fā)現(xiàn)地衣內(nèi)生菌提取物可以淬滅QS信號(hào)分子，從而減少P. aeruginosa PAO1胞外多糖和微菌落的形成。解析這些天然提取物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步挖掘其作用靶點(diǎn)，有助于豐富群體淬滅機(jī)制，為QS淬滅劑的產(chǎn)業(yè)化合成提供理論基礎(chǔ)。

目前僅已知一小部分細(xì)菌的QS系統(tǒng)調(diào)控生物膜形成的分子機(jī)制，且細(xì)菌間的QS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然不清晰。闡明各食源性致病菌和特定腐敗菌的QS機(jī)制，以及QS對(duì)其生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制，有利于為特異性篩選QS淬滅劑提供靶點(diǎn)。

由于不同階段的生物膜形成調(diào)控機(jī)制不同，相應(yīng)生物膜控制策略的選擇也不同；因此，研究需致力于確定生物膜階段特異性轉(zhuǎn)錄組，以鑒定參與生物膜發(fā)育不同階段的基因以及各種調(diào)控型RNA，并提供生物膜階段特異性防控靶點(diǎn)，從而達(dá)到更高效的生物膜控制效果。

生物膜中的細(xì)菌基因表達(dá)是異質(zhì)的，并且會(huì)隨著外界環(huán)境的改變分化出不同表型的亞群，而目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都是在靜態(tài)條件下進(jìn)行生物膜研究的，對(duì)這種異質(zhì)基因表達(dá)如何在變化的環(huán)境中促進(jìn)生物膜的靈活性和可塑性的貢獻(xiàn)知之甚少，新興單細(xì)胞分析等技術(shù)的發(fā)展為探索單細(xì)胞生物的多細(xì)胞性提供了可能，對(duì)其進(jìn)行闡明有助于擴(kuò)展生物膜形成調(diào)控理論知識(shí)和開發(fā)生物膜消除的新方法。