李艾黎，張 欣，李 穎，楊佳杰，馬向陽(yáng)，賈新棟，杜 鵬

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

益生菌作為一類(lèi)可對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益影響的微生物，可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境來(lái)改善精神健康狀況、降低膽固醇、改善人體胰島素水平、調(diào)節(jié)免疫因子、輔助過(guò)敏治療等[1-4]。常用的益生菌如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等憑借其安全可靠、性能優(yōu)良的生理特性備受消費(fèi)者關(guān)注和青睞，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)。預(yù)計(jì)2020年益生菌膳食補(bǔ)充劑和益生菌非處方藥的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到850億 元[5]。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)益生菌與腸道屏障的生理狀態(tài)以及病理性改變密切相關(guān)，有關(guān)益生菌保護(hù)和調(diào)節(jié)宿主腸道屏障的作用機(jī)制不斷被揭示。如Jang等發(fā)現(xiàn)短乳桿菌G-101可顯著下調(diào)結(jié)腸炎小鼠腸道內(nèi)細(xì)胞炎性因子細(xì)胞白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能[6]。Yi Hongbo等觀察到羅伊氏乳桿菌LR1通過(guò)恢復(fù)仔豬腸道緊密連接蛋白表達(dá)，修復(fù)致病性大腸桿菌破壞的腸上皮屏障[7]。miRNA（microRNA）是一種廣泛參與細(xì)胞生理及病理活動(dòng)的非編碼小RNA分子，主要通過(guò)特異性的堿基配對(duì)與靶基因mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA在腸道組織中表達(dá)極為豐富，不僅是腸道生長(zhǎng)、發(fā)育和黏膜屏障的重要調(diào)控環(huán)節(jié)，而且在腸道免疫耐受和防御病原微生物感染方面也發(fā)揮重要作用[8]。最新的體外細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，益生菌保護(hù)或恢復(fù)腸黏膜屏障功能的作用亦與調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)密切相關(guān)。本文就miRNA參與益生菌保護(hù)腸道屏障和腸道穩(wěn)態(tài)的相關(guān)研究進(jìn)行文獻(xiàn)收集和整理，擬從miRNA的作用機(jī)制及其在腸道疾病中的差異表達(dá)、益生菌調(diào)節(jié)腸道屏障功能和miRNA參與益生菌調(diào)節(jié)腸道屏障這3 個(gè)主要方面展開(kāi)綜述，旨在從miRNA角度分析益生菌對(duì)腸道上皮屏障功能的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制。

1 miRNA與腸道屏障

1.1 miRNA的生成及作用

miRNA是一類(lèi)約由19～22 個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，具有高度的保守性和組織器官特異性，參與腸道上皮細(xì)胞的增殖、分化以及腸道免疫功能[9]。miRNA編碼基因在細(xì)胞核內(nèi)被核酸內(nèi)切酶裂解，形成含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體Pre-miRNA，隨后該前體從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并在內(nèi)切酶作用下形成短的雙鏈RNA，雙鏈中的前導(dǎo)鏈結(jié)合RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體產(chǎn)生具有生物活性的成熟miRNA。miRNA通過(guò)結(jié)合靶基因促進(jìn)靶基因的mRNA降解并抑制其蛋白的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[10]。具體機(jī)制與靶基因結(jié)合程度有關(guān)，如果miRNA與靶mRNA匹配完全，則該復(fù)合體降解mRNA；若兩者序列部分匹配，如miRNA的5’端2～8 個(gè)被稱(chēng)為種子序列的核苷酸與靶mRNA完全匹配，則通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯來(lái)沉默特定基因。此外，某些miRNA能夠特異結(jié)合于靶基因的富含腺嘌呤/尿嘧啶元件的3’端非翻譯區(qū)，從而指導(dǎo)Ago蛋白與鋅脂蛋白結(jié)合成沉默復(fù)合體區(qū)，進(jìn)而改變相應(yīng)mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解[11-12]。

1.2 miRNA在腸道疾病中的異常表達(dá)

炎性腸病、腸道腫瘤等腸道疾病存在不同程度的腸道屏障損傷，宿主體內(nèi)異常表達(dá)的miRNA可能是誘因之一。如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者腸道黏膜中激增的Th17細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23等）可造成腸道屏障損傷[13]。Wu Feng等通過(guò)微陣列、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和原位雜交分析發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，在結(jié)腸炎患者結(jié)腸中有11 個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中miR-192表達(dá)水平顯著降低，該miRNA可靶向下調(diào)免疫調(diào)控因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2的表達(dá)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子TNF-α大量產(chǎn)生破壞腸道屏障完整性，從而加重患病癥狀[14]。Xue Xiaochang等發(fā)現(xiàn)IBD患者腸黏膜組織中表達(dá)水平降低的miR-10a可負(fù)反饋調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因，致使IL-23分泌激增[15]。Polytarchou等觀察到IBD患者體內(nèi)過(guò)表達(dá)的miR-214激活了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子STAT3，進(jìn)而促進(jìn)IL-6產(chǎn)生[16]。另外，IBD患者體內(nèi)上調(diào)的miR-223可通過(guò)靶向抑制緊密連接蛋白相關(guān)基因CLDN8表達(dá)，破壞腸道上皮細(xì)胞屏障[17]。

此外，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者腸道癌變細(xì)胞大量快速增殖會(huì)破壞其細(xì)胞組織，進(jìn)而造成嚴(yán)重腸道屏障損傷[18]。迄今已發(fā)現(xiàn)百余個(gè)與CRC密切相關(guān)的miRNA[19]，如Slattery等對(duì)217 例CRC病例分析后發(fā)現(xiàn)，CRC患者腸道內(nèi)的11 個(gè)異?；蚺c37 個(gè)異常表達(dá)的miRNA相關(guān)，特別是miR-150-5p和miR-196b-5p[20]。進(jìn)一步的研究提示，miRNA可通過(guò)影響腫瘤生成通路及其相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。如miRNA-106a、miRNA-92可通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B

（phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[21-22]。而miRNA-145則可通過(guò)擾亂結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-連環(huán)蛋白（wingless integrated/β-catenin，Wnt/β-catenin）信號(hào)通路的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制早期細(xì)胞癌變。此外，miRNA-145還可通過(guò)破壞連環(huán)蛋白δ-1的核穿梭功能，致使β-catenin核轉(zhuǎn)運(yùn)異常而發(fā)揮抑癌作用[23]。

另有實(shí)驗(yàn)利用過(guò)表達(dá)和干擾工具觀察miRNA協(xié)同其靶基因的負(fù)反饋功能，評(píng)估m(xù)iRNA作為生物靶點(diǎn)修復(fù)腸黏膜損傷的潛在作用。如Valeri等發(fā)現(xiàn)沉默miRNA-135b表達(dá)可有效抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖[24]。而給予2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠miR-301a或miR-141抑制劑灌腸治療，可顯著降低Th17細(xì)胞比例以及IL-17表達(dá)，防止炎癥浸潤(rùn)損傷腸道屏障[25-26]。由此可見(jiàn)，加強(qiáng)對(duì)miRNA分子和腸道屏障功能之間關(guān)系的研究，有利于深層次挖掘和揭示影響機(jī)體腸道健康的機(jī)理。

2 益生菌調(diào)節(jié)腸道屏障功能

腸道屏障是機(jī)體抵抗外界有害物質(zhì)的重要保障，與人體健康息息相關(guān)，主要由機(jī)械屏障、免疫屏障與生物屏障構(gòu)成。其中機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接蛋白與菌膜三者構(gòu)成；免疫屏障由細(xì)胞因子、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）與免疫活性細(xì)胞等共同組成；生物屏障由腸道菌群和腸上皮細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生的黏蛋白、活性肽等共同組成[27-29]。益生菌可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫、保護(hù)腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接、改善菌群失調(diào)等途徑增強(qiáng)腸道屏障功能[30]，進(jìn)而維護(hù)腸道健康。

已有研究報(bào)道益生菌通過(guò)影響免疫屏障中的p38絲裂原活化蛋白激酶/核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B（p38-mitogenactivated protein kinase/nuclear factor kappa B，p38 MAPK/NF-κB）信號(hào)通路，降低炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，減少上皮細(xì)胞凋亡，改善炎癥病變。如Kim等證實(shí)雙歧桿菌KCTC 5727抑制了TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活，顯著緩解小鼠急性結(jié)腸炎[31]。Takeda等研究表明，副干酪桿菌06TCa19通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路，下調(diào)IL-8水平，從而有效改善幽門(mén)螺旋桿菌患者胃腸炎癥[32]。Liu Meiling等也發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌ML2018可通過(guò)抑制p38 MAPK/NF-κB炎癥通路，下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6水平，減輕硫酸葡聚糖鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[33]。此外，益生菌對(duì)宿主免疫屏障的調(diào)節(jié)作用還體現(xiàn)在刺激宿主分泌Ig、增強(qiáng)體液免疫方面。如雙歧桿菌OLB6378可上調(diào)血清IgG和腸道IgA表達(dá)水平，增強(qiáng)低出生體重嬰兒的免疫力[34]。同樣地，副干酪乳酸菌MCC1849也可誘導(dǎo)腸道分泌IgA[35]。Kozakova等發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃含李糖乳桿菌LOCK0900、鼠李糖乳桿菌LOCK090833和干酪乳桿菌LOCK0919的混合益生菌后，其血清中特異性IgE降低，總IgA水平提高，同時(shí)明顯改善了小鼠對(duì)花粉的敏感性[3]。

益生菌還可促進(jìn)緊密連接蛋白（包括閉合蛋白（Occludin）、密封蛋白（Claudin）、閉合小環(huán)蛋白（zonula occludens，ZO）-1、2、3）表達(dá)從而保護(hù)腸道機(jī)械屏障完整性。如蔣紅利等發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌Bi-07通過(guò)上調(diào)尿毒癥大鼠腸道緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)腸上皮屏障的完整性[36]。Guo Shuangshuang等報(bào)道嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌可抑制Caco-2細(xì)胞中IL-1b誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)Claudin和Occludin表達(dá)，降低上皮細(xì)胞通透性，保護(hù)腸道屏障[37]。Wang Jing等研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZLP001通過(guò)恢復(fù)Claudin和ZO-1表達(dá)提高斷奶仔豬腸防御肽pBD2、PG1-5和pBD2的生成，下調(diào)炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，從而改善腸道屏障功能[38]。另外，益生菌可通過(guò)修復(fù)病原菌誘導(dǎo)的緊密連接蛋白內(nèi)吞，改善腸道屏障功能。如Jariwala等研究表明，鼠李糖乳桿菌修復(fù)了大腸桿菌O26:H11誘導(dǎo)的緊密連接蛋白內(nèi)吞，并將緊密連接蛋白重新分布到細(xì)胞邊界，改善致病菌造成的腸道上皮功能障礙[39]。

益生菌調(diào)節(jié)腸道屏障功能的作用還體現(xiàn)在增加有益菌豐度、減少有害菌比列、維護(hù)菌群平衡、保護(hù)生物屏障等方面。多項(xiàng)給予腸易激綜合征患者或DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠益生菌治療的研究表明，益生菌可明顯增加腸道菌群中有益菌（如雙歧桿菌和乳酸桿菌屬）豐度，降低有害菌（如芽孢桿菌和嗜膽菌）比例，修復(fù)失衡菌群并減少患者體內(nèi)炎癥標(biāo)志物，促進(jìn)腸道黏膜功能恢復(fù)，使腸道炎癥得到顯著改善[40-42]。這些研究表明，應(yīng)用益生菌在防治屏障功能受損相關(guān)的腸道疾病中取得良好效果。

3 miRNA參與益生菌調(diào)節(jié)腸道屏障

3.1 腸道菌群影響宿主miRNA的表達(dá)

腸道微生物主要由共生菌、條件致病菌以及病原菌組成，在調(diào)節(jié)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝、拮抗病原菌定植、維持腸道屏障功能等方面發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是連接基因、環(huán)境和免疫系統(tǒng)的重要紐帶[43-44]。最近研究表明，腸道微生物群可通過(guò)調(diào)控宿主miRNA表達(dá)來(lái)影響宿主腸道健康。如Peck等研究發(fā)現(xiàn)，在共生菌的影響下，腸道上皮細(xì)胞存在19 個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中miR-375與上皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)[45]。Nakata等比較了普通小鼠和無(wú)菌小鼠腸上皮細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)共生菌誘導(dǎo)的miR-21-5p在腸道上皮細(xì)胞中顯著過(guò)表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該miRNA可靶向作用于核糖基化因子4調(diào)節(jié)緊密連接蛋白（Claudin和Occludin）表達(dá)繼而影響腸上皮通透性[46]。與此類(lèi)似，Natasha等研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠相比，在無(wú)菌小鼠的盲腸中有16 種miRNA差異表達(dá)，這些miRNA的靶點(diǎn)均參與調(diào)節(jié)腸道屏障功能[47]。Liang Guanxiang等研究發(fā)現(xiàn)定植于牛腸道內(nèi)的雙歧桿菌或乳酸菌的數(shù)量與miR-15/16、miR-29和miR-196的表達(dá)水平呈正相關(guān)，對(duì)淋巴組織和免疫細(xì)胞的發(fā)育有重要意義[48]。此外，一些病原菌降低機(jī)體免疫力使宿主患病也與影響miRNA表達(dá)有關(guān)。如Xue Xiaochang等發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組小鼠相比，大腸桿菌感染使小鼠腸道內(nèi)miR-107表達(dá)降低，導(dǎo)致該miRNA靶向抑制的炎性因子IL-23 p19大量生成，破壞腸道穩(wěn)態(tài)[49]。Archambaud等報(bào)道李斯特菌通過(guò)下調(diào)小鼠腸道m(xù)iRNA（miR-192、miR-200b和miR-215）和抗炎因子IL-2、IL-10表達(dá)，上調(diào)促炎因子IL-22水平，降低小鼠免疫力從而導(dǎo)致小鼠感染[50]。與此相似，幽門(mén)螺桿菌和土拉弗菌可通過(guò)干擾正常miRNA表達(dá)引發(fā)宿主感染[17,51]。

此外，共生菌代謝低聚糖產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（如乙酸、丙酸、丁酸等）也可通過(guò)調(diào)控腸道組織miRNA表達(dá)影響腸道屏障穩(wěn)態(tài)。丁酸是重要短鏈脂肪酸之一，不僅為上皮細(xì)胞提供能量，還有抗癌功效[52]。以往研究表明丁酸鹽能抑制組蛋白脫羧酶誘導(dǎo)的蛋白乙?；黾蛹?xì)胞周期阻滯的關(guān)鍵調(diào)控因子p21的轉(zhuǎn)錄，從而限制癌細(xì)胞增殖[53]。新近研究發(fā)現(xiàn)miRNA也參與丁酸鹽的抗癌作用，如丁酸能抑制miR-106b表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞周期抑制蛋白p21轉(zhuǎn)錄、減少腫瘤細(xì)胞增殖[54]。另一研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉通過(guò)上調(diào)HT-29細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞中miR-203表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-203還可靶向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白NEDD9的3’端非翻譯區(qū)，下調(diào)NEDD9表達(dá)，抑制癌癥惡化[55]。Nielsen等也發(fā)現(xiàn)給大鼠喂食抗性淀粉（低聚糖）后，促癌基因miR-17的表達(dá)減少，糞便中的丁酸鹽含量增加[56]。上述證據(jù)提示，腸道菌群種類(lèi)及其代謝產(chǎn)物可通過(guò)影響miRNA表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)宿主腸道屏障功能。事實(shí)上，益生菌作為腸道微生物中的一部分，其對(duì)腸道屏障的調(diào)節(jié)作用也是通過(guò)介導(dǎo)miRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的（表1）。

表1 益生菌調(diào)節(jié)miRNA保護(hù)腸道屏障Table 1 Probiotics regulate miRNA expression to protect intestinal barrier

3.2 miRNA參與益生菌調(diào)節(jié)腸道免疫屏障

腸道依賴于天然免疫和適應(yīng)性免疫來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。天然免疫是通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞識(shí)別病原體并呈遞給T細(xì)胞來(lái)啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，同時(shí)通過(guò)合成炎性因子和抗炎因子引發(fā)免疫反應(yīng)[70]。特異性免疫分為細(xì)胞免疫和體液免疫。其中體液免疫是以Ig起主要作用的免疫應(yīng)答反應(yīng)[71]。益生菌對(duì)腸道天然免疫和適應(yīng)性免疫均可產(chǎn)生有益影響。

3.2.1 miRNA參與調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路

宿主腸道上皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞上存在的一系列模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），可識(shí)別分布于致病菌表面的致病相關(guān)分子模式。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種重要的PRRs。當(dāng)TLR4的胞外區(qū)域與刺激物結(jié)合后，其胞內(nèi)區(qū)與髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）結(jié)合，從而使IL-1受體相關(guān)激酶1（IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）磷酸化，進(jìn)而結(jié)合TNF受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6），導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1（transforming growth factor kinase 1，TAK-1）及TAK-1結(jié)合蛋白（TAK binding proteins，TAB）募集并形成復(fù)合物，并啟動(dòng)下游信號(hào)通路：1）TRAF6通過(guò)磷酸化激活MAPK，繼而活化P38 MAPK信號(hào)通路；2）TAK-1誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子抑制因子（inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB）蛋白抑制劑磷酸化，使IκB與NF-κB復(fù)合物解離，導(dǎo)致NF-κB向細(xì)胞核移位，激活NF-κB信號(hào)通路[72]。上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程被稱(chēng)為T(mén)LR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路，該通路是機(jī)體發(fā)揮先天免疫作用的重要途徑，過(guò)度活躍的TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路將常導(dǎo)致炎性因子大量產(chǎn)生，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[73-74]。

炎癥反應(yīng)激活TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路，同時(shí)誘導(dǎo)特異性miRNA表達(dá)；而上調(diào)的miRNA可通過(guò)靶向沉默TLR4/MyD88下游關(guān)鍵蛋白，如IRAKl和TRAF6表達(dá)，減弱NF-κB信號(hào)活化，抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生[74-75]。如Zhang Quanbo等發(fā)現(xiàn)miR-146a缺失使得痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型小鼠的TRAF6、IRAK1上調(diào)，并增加IL-1、TNF-α水平[76]。此外，miR-146、miR-155、miR-21、miR-9、miR-148、miR-27a也可靶向作用于TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路，參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)（表2）。上述成果提示，miRNA仿佛強(qiáng)大的“剎車(chē)片”，協(xié)同其靶基因參與負(fù)向調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，從而可能成為緩解和終止炎癥反應(yīng)的治療靶點(diǎn)。

表2 參與調(diào)節(jié)TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路的miRNATable 2 MiRNA involved in TLR4/p38 MAPK/NF-κB signaling pathway

近年來(lái)，研究者對(duì)益生菌免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的解析已深入至分子水平，有關(guān)miRNA參與益生菌調(diào)控腸道屏障和腸道穩(wěn)態(tài)的作用被不斷揭示。多數(shù)研究認(rèn)為，益生菌可通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)來(lái)影響TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路，抑制促炎因子（TNF-α、IL-8、IL-6）合成，促進(jìn)抗炎因子IL-10分泌，從而增強(qiáng)腸道免疫屏障功能（圖1）。如G i a h i 等報(bào)道，熱滅活的鼠李糖乳桿菌G G、德氏乳桿菌保加利亞亞種分別與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理的樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，均可抑制TLR4 mRNA表達(dá)，其中鼠李糖乳桿菌GG可影響miR-146表達(dá)并抑制NF-κB信號(hào)通路，德氏乳桿菌保加利亞亞種可通過(guò)調(diào)控miR-155表達(dá)抑制p38 MAPK信號(hào)通路，從而緩解炎癥反應(yīng)[57]。Sabharwal等也觀察到大腸桿菌Nissle 1917與腸上皮細(xì)胞T84共培養(yǎng)時(shí)可調(diào)節(jié)miR-146表達(dá)，并抑制炎性因子IL-8和趨化因子CXCLI的產(chǎn)生[58]。Chen Qiaoling等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)植物乳桿菌ZO-1喂養(yǎng)后，沙門(mén)氏菌感染的雞腸道內(nèi)miR-193、miR-375表達(dá)發(fā)生變化，這兩個(gè)miRNA的靶基因可靶向NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，進(jìn)而降低炎性因子TNF-α分泌，減輕感染癥狀[60]。與此類(lèi)似，熱致死副干酪乳桿菌NCC2461與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)可抑制miR-27a表達(dá)，上調(diào)抗炎因子IL-10水平[59]。值得注意的是，Taibi等提出益生菌調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)具有時(shí)間依賴性[61]，如雙歧桿菌MIMBb75干預(yù)結(jié)腸炎小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的miR-148可通過(guò)靶向TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路減少內(nèi)皮PAS1蛋白基因表達(dá)及TNF-α的合成。并且，miR-148表達(dá)在益生菌干預(yù)宿主2～13 d內(nèi)顯著上調(diào)，14 d后miR-148的表達(dá)水平不再變化。但這種調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡釋。

圖1 益生菌調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)影響TLR4/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路[73]Fig. 1 Regulation of miRNA expression by probiotics affects TLR4/p38 MAPK/NF-κB signaling pathway[73]

3.2.2 miRNA參與調(diào)節(jié)Ig分泌

Ig能特異性識(shí)別并結(jié)合外來(lái)分子，阻斷有害物質(zhì)入侵，在體液免疫過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。Ig由Ig重鏈（Ig heavy chain，IGH）和Ig輕鏈（Ig light chain，IGL）構(gòu)成，根據(jù)恒定區(qū)的不同，IGH可分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等5 類(lèi)，而IGL有κ鏈和λ鏈等2 種類(lèi)型[82]。新近研究顯示，miRNA可參與特異性免疫反應(yīng)影響Ig分泌。如Chen Zhe等報(bào)道在變應(yīng)性鼻炎小鼠體內(nèi)低表達(dá)的miR-466a-3p可靶向轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3從而抑制Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄影響IgE分泌[83]。Fang Lei等發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘患者體內(nèi)IgE含量與miRNA-21-5p表達(dá)水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21-5p通過(guò)下調(diào)磷酸酶表達(dá)水平及張力蛋白同源物PTEN轉(zhuǎn)錄，刺激氣道平滑肌細(xì)胞重塑，造成病情加重[84]。Younger等研究表明高表達(dá)的miR-423可以降低Ig超家族成員1的水平，影響免疫細(xì)胞間的相互作用[85]。有關(guān)益生菌調(diào)節(jié)miRNA與體液免疫的作用機(jī)制仍然不清楚，但已有研究者從分子水平探索，并且取得了一定進(jìn)展。如Kreuzer-Redmer等發(fā)現(xiàn)，給斷奶后給仔豬喂食富含糞腸球菌NCIM 10415的食物后，可上調(diào)仔豬腸道內(nèi)miRNA-423表達(dá)，抑制IGL合成增強(qiáng)體液免疫，從而減輕斷奶造成的腹瀉[63]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，乳球蛋白過(guò)敏小鼠灌胃嗜酸乳桿菌后，腸道m(xù)iR-155、miR-21表達(dá)量下降，同時(shí)抑制了特異性IgE和炎性因子IL-6、TNF-α分泌，牛乳過(guò)敏癥狀得到緩解[62]。

3.3 miRNA參與益生菌調(diào)節(jié)腸道機(jī)械屏障

機(jī)械屏障主要由單層柱狀上皮細(xì)胞及細(xì)胞間連接復(fù)合物構(gòu)成，柱狀上皮細(xì)胞使腸腔與固有層分離，在對(duì)抗毒素和腸道病原體方面發(fā)揮積極的作用。細(xì)胞間連接復(fù)合物將上皮細(xì)胞緊密結(jié)合在一起，包括緊密連接、黏著連接、橋粒和縫隙連接[86]。以下就益生菌通過(guò)介導(dǎo)miRNA表達(dá)調(diào)控腸道上皮細(xì)胞凋亡和緊密連接蛋白兩個(gè)方面論述益生菌對(duì)腸道機(jī)械屏障的保護(hù)作用。

3.3.1 miRNA參與調(diào)控上皮細(xì)胞凋亡

上皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡之間保持著良好的平衡，是一個(gè)不斷自我替代的細(xì)胞屏障，保護(hù)自身不受病原體侵襲。當(dāng)大量病原菌在機(jī)體腸道內(nèi)增殖時(shí)，不僅引發(fā)腸上皮細(xì)胞的異常凋亡并造成嚴(yán)重腸道屏障損傷，還會(huì)加速病原菌進(jìn)入腸組織引發(fā)炎癥、導(dǎo)致癌變，可見(jiàn)控制腸上皮細(xì)胞的凋亡對(duì)維持腸道屏障的穩(wěn)態(tài)和功能至關(guān)重要。目前研究人員普遍認(rèn)為，線粒體途徑是主要的細(xì)胞凋亡調(diào)控通路，B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白是典型的線粒體途徑凋亡調(diào)控基因，由抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-xl基因和促進(jìn)凋亡的Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）兩大類(lèi)組成。線粒體在接受到凋亡信號(hào)后，刺激Bax轉(zhuǎn)錄，釋放細(xì)胞色素c，募集下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）9基因，進(jìn)而活化Caspase3，導(dǎo)致凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑放大最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[87]。

miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可通過(guò)調(diào)控凋亡基因表達(dá)影響上皮細(xì)胞凋亡。如Bian Zhen[88]和Ramsay[89]等發(fā)現(xiàn)，在小鼠DSS結(jié)腸炎模型中高表達(dá)的miR-150可以靶向上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子基因c-Myb（Bcl-xl、Bcl-2的前導(dǎo)因子）合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。XU Haixiang等在探究miR-21參與葛根素對(duì)心肌損傷（低氧再灌注導(dǎo)致）的修復(fù)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-21表達(dá)，可下調(diào)Bax和Caspase3轉(zhuǎn)錄水平，從而減少心肌細(xì)胞死亡，改善心肌缺血損傷[90]。此外，某些miRNA能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖期抑制細(xì)胞凋亡，如Chen等研究表明miR-200b過(guò)表達(dá)能夠增加細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖期，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞增殖[91]。

新的研究發(fā)現(xiàn)益生菌可通過(guò)介導(dǎo)miRNA表達(dá)，抑制c-Myb、Bax、Caspase3轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)Bcl-2合成，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用（圖2）。如Rodriguez-Nogales等研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Nissle 1917通過(guò)低表達(dá)miR-150，下調(diào)c-Myb轉(zhuǎn)錄水平，抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，改善DSS小鼠炎癥[42]。Zununi等研究發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌可下調(diào)miR-21、miR-200和Bcl-xl表達(dá)，增加Caspase3含量，并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡[66]。值得注意的是，益生菌影響miRNA表達(dá)具有菌株特異性。如研究人員在比較發(fā)酵乳桿菌和唾液鏈球菌對(duì)DSS小鼠治療差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有發(fā)酵乳桿菌具有影響miR-150表達(dá)、減少DSS小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡的能力[64]。Kalani等報(bào)道，LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，經(jīng)嗜酸乳桿菌處理后，細(xì)胞內(nèi)miR-21合成增加，而細(xì)胞凋亡減少[65]。以上結(jié)果提示益生菌調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 益生菌調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)抑制腸上皮細(xì)胞凋亡[87]Fig. 2 Probiotics regulate miRNA expression and inhibit apoptosis of intestinal epithelial cells[87]

3.3.2 miRNA參與調(diào)控緊密連接蛋白

miRNA已被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響腸道機(jī)械屏障。Ye Dongmei[92]和Zhang Bin[93]等報(bào)道，在腸道上皮細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的miR-122與Occludin mRNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)其降解，損害腸道屏障功能導(dǎo)致腸通透性增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-122通過(guò)降低上皮生長(zhǎng)因子受體轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)Occludin表達(dá)水平。Caballero-Garrido等發(fā)現(xiàn)大腦動(dòng)脈閉塞小鼠經(jīng)注射miR-155抑制劑后，其靶蛋白R(shí)heb被上調(diào)，ZO-1的表達(dá)增加，血流梗死區(qū)域和微血管緊密連接的完整性得到改善[94]。極性蛋白復(fù)合體（polarity protein complex，PAR)由PAR-3、PAR-6與非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）等組成，該極性蛋白復(fù)合體與緊密連接蛋白的形成和功能維持密切相關(guān)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過(guò)靶向PAR進(jìn)而調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)。如Krissansen等發(fā)現(xiàn)IBD患者體內(nèi)高表達(dá)的miR-595通過(guò)靶向抑制神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)，減少PAR-6合成，造成緊密連接成分缺失，提示miR-595可破壞上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白完整性，加重IBD癥狀[95]。

研究表明益生菌可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA，促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)，保護(hù)腸道屏障完整性（圖3）。Veltman等報(bào)道大腸桿菌Nissle 1917與上皮細(xì)胞T84共培養(yǎng)時(shí)，可上調(diào)miR-203、miR-595、miR-483表達(dá)，這些miRNA分別靶向緊密連接蛋白ZO-2、PAR復(fù)合體PAR-3、PAR復(fù)合體PAR-6，從而促進(jìn)緊密連接蛋白生成[67]。Zhao Haiyang等發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌可上調(diào)酒精暴露下小鼠肝臟和Caco-2細(xì)胞中的miR-122a，促進(jìn)Occludin表達(dá)[68]。Rodriguez-Nogales等研究表明布拉酵母菌可上調(diào)miR-155表達(dá)，促進(jìn)Claudin和ZO-1合成，改善DSS小鼠腸道通透性[69]。以上結(jié)果提示益生菌可能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)維護(hù)腸道上皮屏障功能。

圖3 益生菌影響miRNA表達(dá)促進(jìn)緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄[67]Fig. 3 Probiotics regulate miRNA expression and promote tight junction protein transcription[67]

4 結(jié) 語(yǔ)

腸道屏障是機(jī)體抵抗外界有害物質(zhì)的重要防線之一，屏障功能受損將嚴(yán)重影響宿主腸道健康，并誘發(fā)各種腸道疾病。益生菌能夠保護(hù)腸道屏障的結(jié)構(gòu)和功能，目前，在分子水平解析益生菌對(duì)腸道屏障的調(diào)節(jié)作用，是了解益生菌對(duì)腸道益生機(jī)制的新途徑。miRNA是一類(lèi)非編碼RNA，在腸道組織中表達(dá)豐富，可通過(guò)與mRNA靶標(biāo)結(jié)合發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的功能。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)益生菌可通過(guò)影響miRNA表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道免疫，減少腸道上皮細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)保護(hù)腸道屏障。但miRNA受益生菌調(diào)控的機(jī)制、特定功能的miRNA對(duì)應(yīng)具體哪個(gè)或哪些菌株，這些問(wèn)題還需要進(jìn)一步的深入研究和探討。研究益生菌調(diào)控miRNA的分子機(jī)制，加深益生菌促進(jìn)健康作用的認(rèn)識(shí)，將會(huì)為保護(hù)腸道健康及預(yù)防各種腸道疾病提供新的策略。