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        脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的生物轉(zhuǎn)化及其隱蔽型毒素的形成研究進(jìn)展

        2020-10-29 06:17:38唐語謙潘藥銀劉晨迪楊繼國(guó)
        食品科學(xué) 2020年19期
        關(guān)鍵詞:環(huán)氧毒素毒性

        唐語謙,潘藥銀,劉晨迪,楊繼國(guó),

        (1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640;2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院,廣東 東莞 523808)

        真菌毒素是真菌在特定條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是目前世界分布最為廣泛、影響較大的真菌毒素之一。其屬B族單端孢霉烯族化合物,俗稱嘔吐毒素,主要由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum)侵染小麥、大麥、玉米等糧食作物產(chǎn)生[1]。在潮濕、溫?zé)岬葰夂驐l件下,DON毒素的產(chǎn)生不可避免,它會(huì)引發(fā)小麥赤霉病等植物病癥,并經(jīng)由谷物或飼料通過食物鏈富集至人體內(nèi),給世界糧食產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,也給人類健康帶來重大威脅[2]。除此之外,DON能夠在植物和微生物作用下轉(zhuǎn)化形成隱蔽型毒素,增加了谷類作物及其副產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

        DON的生物轉(zhuǎn)化主要包括植物轉(zhuǎn)化、微生物降解及動(dòng)物體內(nèi)代謝,不同生物對(duì)DON的作用模式存在一定差異,這影響到其衍生物類型、毒性效果及分布。大量研究表明,生物脫毒具有作用條件溫和、安全環(huán)保、對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)影響較小等優(yōu)點(diǎn)[5],但也應(yīng)注意到經(jīng)植物或微生物代謝轉(zhuǎn)化后毒素衍生物的形成。這些毒素衍生物在常規(guī)提取條件(乙腈-水或甲醇-水)下完全或部分穩(wěn)定,其親水性比毒素單體更強(qiáng),而且缺乏商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品,傳統(tǒng)分析技術(shù)難以檢測(cè),故稱為隱蔽型毒素[6]。

        隨著對(duì)DON的研究逐漸深入,人們發(fā)現(xiàn)隱蔽型毒素可與原型毒素同時(shí)存在,有些甚至比原型毒素的毒性作用更大。在某些情況下,隱蔽型毒素的濃度可能超過加工食品中原型毒素的水平,而且一些隱蔽型毒素會(huì)在體內(nèi)代謝過程中重新轉(zhuǎn)化為DON,給人類和動(dòng)物健康造成潛在風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前已發(fā)現(xiàn)的隱蔽型DON毒素主要有:DON-3-葡萄糖苷(DON-3-glucoside,DON-3-G)、3-乙酰-DON(3-acetyl-DON,3-Ac-DON)、15-乙酰-DON(15-acetyl-DON,15-Ac-DON)、DON-3-葡糖苷酸(DON-3-glucoside acid,DON-3-GlcA)、DON-15-葡糖苷酸(DON-15-glucoside acid,DON-15-GlcA)、3-酮基-DON(3-ketone-DON,3-keto-DON)、3-異構(gòu)-DON(3-epimerization-DON,3-epi-DON)和脫環(huán)氧DON(deepoxy-DON,DOM-1)?,F(xiàn)階段研究較多的是DON-3-G[7],聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)已將DON-3-G歸類為人類及動(dòng)物健康潛在危害物,并將其作為DON類真菌毒素膳食暴露的重要指標(biāo)[8]。但目前世界各國(guó)糧食和飼料安全標(biāo)準(zhǔn)還主要集中于DON的限量,未考慮到隱蔽型毒素的監(jiān)測(cè)與限量。本文簡(jiǎn)要介紹DON及其隱蔽型毒素的分布及危害,各類生物對(duì)DON的轉(zhuǎn)化模式及隱蔽型毒素的形成以及生物脫毒取得的進(jìn)展,以期為DON及其隱蔽型毒素的降解研究提供參考。

        1 DON及其隱蔽型毒素類型及分布

        1.1 DON的隱蔽型毒素類型

        圖1 DON及其隱蔽型毒素[7]Fig. 1 DON and its masked forms[7]

        DON最早由日本學(xué)者Yoshizawa等[9]于1973年從鐮刀菌感染的大麥粒中分離得到,化學(xué)名稱為3,7,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮(化學(xué)式為C15H20O6),分子質(zhì)量為296.32 Da,無色針狀晶體,可溶于水和極性有機(jī)溶劑[10]。DON化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,一般的食品加工不能破壞其結(jié)構(gòu),堿性條件下或高壓處理才可破壞部分毒素,且可在環(huán)境和食物鏈中長(zhǎng)期存在,已被歐盟致癌物分類標(biāo)準(zhǔn)定為三級(jí)致癌物。DON的隱蔽型毒素主要分為三類:第一類是共軛結(jié)合物,主要有DON-3-G、3-Ac-DON、15-Ac-DON、DON-3-GlcA、DON-15-GlcA;第二類是氧化還原產(chǎn)物,主要有3-keto-DON、3-epi-DON;第三類是脫環(huán)氧化合物,主要是DOM-1。DON及其隱蔽型毒素的結(jié)構(gòu)式如圖1[7]。

        1.2 DON及其隱蔽型毒素的分布

        DON對(duì)糧食作物及以其為基礎(chǔ)的飼料和食品的污染是一個(gè)全球性問題。在我國(guó),污染主要發(fā)生在長(zhǎng)江中下游溫暖潮濕地區(qū)。近年來,由于全球變暖和農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的變化,逐漸蔓延到中國(guó)西北等高緯度地區(qū),如東北、山東等以種植小麥為主的地區(qū)也常出現(xiàn)DON暴露量超標(biāo)的情況[11-15]。在美洲,巴西、美國(guó)等地常檢測(cè)出DON及其隱蔽型毒素,歐洲、非洲以及沿海等地區(qū)均有相關(guān)檢測(cè)報(bào)道[16-21]。近幾年全球部分國(guó)家和地區(qū)的毒素檢出情況見表1[14-21]。

        DON的隱蔽型毒素以DON-3-G為主,它通常與DON原型及衍生型3-Ac-DON、15-Ac-DON共存于小麥、大麥、玉米等糧食作物及其副產(chǎn)品中[12-17],在釀造啤酒過程中,作為原料的大麥特別容易受到毒素污染。Jeroen等[22]在47 個(gè)國(guó)家的406 種啤酒中發(fā)現(xiàn)DON和DON-3-G的質(zhì)量濃度總和為10~475 μg/L,在27 種精釀啤酒中,污染物濃度超過了歐洲科學(xué)委員會(huì)設(shè)定的1 μg/(kgmb·d)的每日耐受攝入量。分析谷物及其副產(chǎn)品的DON水平是從源頭監(jiān)測(cè)毒素污染的有效途徑,而其代謝產(chǎn)物也可作為DON暴露的有效生物標(biāo)志物[23]。Maria等[24]在大部分英國(guó)兒童和青少年尿液中檢測(cè)到游離DON和DON-GlcA,33%~63%的兒童和5%~46%的青少年的膳食DON暴露水平超過暫定每日最大耐受攝入量,此外,Deng Chunli等[25]也在中國(guó)河南省的居民尿液樣本中檢測(cè)到低水平的游離DOM-1。以上研究表明,人群中DON及其隱蔽型毒素已經(jīng)廣泛存在,并對(duì)食品安全和人體代謝構(gòu)成了風(fēng)險(xiǎn)。

        2 各類生物對(duì)DON的轉(zhuǎn)化途徑

        不同生物對(duì)DON的轉(zhuǎn)化模式存在一定差異,這影響到其形成的隱蔽型毒素類型、分布及毒性作用(圖1):1)DON及共軛結(jié)合物(DON-3-G、3-Ac-DON、15-Ac-DON)常共存于小麥、大麥等植物中,一方面是由于鐮刀菌會(huì)天然產(chǎn)生少量的3-Ac-DON、15-Ac-DON[26];另一方面被鐮刀菌感染的植物通過自身防御機(jī)制形成DON功能化共軛形式,改變了DON的水溶性和毒性作用[27],其中C3位羥基葡糖苷化和乙?;侵参锓烙鶛C(jī)制的解毒作用,而C15位羥基乙?;蛊渚哂懈叩亩拘?;2)DON-3-G、Ac-DONs在哺乳動(dòng)物的消化道中經(jīng)腸道微生物作用又重新水解釋放DON,同樣存在一定毒性作用的影響[28-29];3)脫環(huán)氧化合物DOM-1及氧化還原產(chǎn)物(3-keto-DON、3-epi-DON)主要是在農(nóng)田土壤或動(dòng)物胃腸道的微生物降解DON過程中形成,微生物還通過不同代謝機(jī)制改變毒素結(jié)構(gòu),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素的生物降解;4)DON在人體內(nèi)代謝后隨尿液排除過程中,大部分以其原型或葡糖苷酸結(jié)合物(DON-GlcA)的形式存在,主要是DON-3-GlcA、DON-15-GlcA,葡萄糖醛酸化是哺乳動(dòng)物中主要的II期結(jié)合途徑,在DON解毒和生物轉(zhuǎn)化中起重要作用[30]。小部分DON可以通過人體腸道微生物群解毒成脫環(huán)氧DOM-1,并隨尿液排出體外[25,31]。

        表1 近幾年全球部分國(guó)家和地區(qū)DON及其隱蔽型毒素檢出情況Table 1 Detection rates of DON and its masked forms in some countries and regions in recent years

        2.1 植物對(duì)DON的改性

        2.1.1 C3位葡萄糖苷化

        DON-3-G是植物對(duì)DON最常見的修飾形式之一,抗赤霉病的小麥[32]、水稻[33]、擬南芥[34]等植物中存在一種UGTs,它能催化內(nèi)源性葡萄糖分子與DON C3位的羥基結(jié)合形成DON-3-G[35],DON向DON-3-G轉(zhuǎn)化程度受多種因素影響。Ovando-Martinez等[32]發(fā)現(xiàn)春小麥的種類及地域都極大地影響著其DON與DON-3-G的含量及DON糖基化的效率,這與植物抗性程度有關(guān)。目前,研究人員引入U(xiǎn)GTs的基因片段以增強(qiáng)植物對(duì)鐮刀菌的抗性,Li Xin等[36]將HvUGT13248導(dǎo)入小麥中成功表達(dá),該轉(zhuǎn)基因小麥不僅可以抑制DON的積累,同時(shí)可有效地使DON轉(zhuǎn)化成DON-3-G。

        2.1.2 C3位乙?;?/p>

        DON共軛結(jié)合物的形成并不局限于糖基轉(zhuǎn)化,還可通過攜帶Tri基因的植物與乙?;Y(jié)合轉(zhuǎn)化為3-Ac-DON。其中Tri101是一個(gè)編碼單端孢霉烯-3-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶關(guān)鍵的調(diào)控基因,可在大麥和小麥中穩(wěn)定表達(dá)和遺傳[37]。Okubara等[38]實(shí)現(xiàn)FsTRI101在玉米UBI啟動(dòng)子控制下在小麥中成功表達(dá),其胚乳提取物中檢測(cè)到Tri101編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,賦予了小麥一定的DON耐受性并使其具有更高水平的鐮刀菌抗性。為了進(jìn)一步研究谷類作物對(duì)3-Ac-DON是否有足夠的抗性,Ohsato等[39]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)和遺傳Tri101的轉(zhuǎn)基因水稻植株,對(duì)比野生型水稻根部生長(zhǎng)狀況,發(fā)現(xiàn)3-Ac-DON對(duì)表現(xiàn)出乙?;芰Φ霓D(zhuǎn)基因作物沒有毒性。

        不同植物對(duì)鐮刀菌侵染易感性存在差異,且受母體毒素DON不同濃度的影響,將DON轉(zhuǎn)化為DON-3-G、3-Ac-DON的能力有所不同。然而,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使植物表達(dá)恰當(dāng)?shù)腢GTs或3-乙?;D(zhuǎn)移酶,以提高植物對(duì)鐮刀菌抗性、降低DON毒素積累是有爭(zhēng)議的。因?yàn)橐阴;吞腔Y(jié)合的DON共軛化合物可以通過內(nèi)源性微生物菌落或酶在哺乳動(dòng)物的消化過程中分裂,不能保證其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[28-29]。

        2.2 微生物對(duì)DON的降解

        2.2.1 霉菌

        目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于霉菌生物轉(zhuǎn)化DON及相應(yīng)的隱蔽型毒素形成的研究較少且結(jié)構(gòu)尚未明確。He Chenghua等[40]以DON毒素為唯一碳源從土壤中分離到一株可以轉(zhuǎn)化DON的塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株NJA-1,14 d后可轉(zhuǎn)化94.4%的DON,其作用機(jī)制初步猜測(cè)是C8酮基水合作用,或環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)形成兩個(gè)羥基。吳娛等[41]發(fā)現(xiàn)DON經(jīng)米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株As-W.6發(fā)酵后也能實(shí)現(xiàn)較高降解率,降解產(chǎn)物分子質(zhì)量減少了13.9 Da,產(chǎn)物未明。糖基化修飾在微生物對(duì)DON的代謝中很少見。但Tian Ye等[42]發(fā)現(xiàn)木霉(Trichoderma)可以將DON轉(zhuǎn)化為DON-3-G,推測(cè)這是木霉在與鐮刀菌競(jìng)爭(zhēng)過程中產(chǎn)生了和植物類似的自我保護(hù)機(jī)制。

        2.2.2 細(xì)菌

        2.2.2.1 脫環(huán)氧作用

        已有研究表明DON毒素脫環(huán)氧代謝是其主要解毒代謝機(jī)制,大多由動(dòng)物的瘤胃和腸道微生物完成,研究者陸續(xù)從雞腸、鯰魚消化物等中篩選出具有降解DON為DOM-1能力的細(xì)菌菌群[43-44],有梭菌屬(Clostridiumsp.)菌株WJ06和伊格爾茲氏菌屬(Eggerthellasp.)菌株DII-9、真桿菌屬(Eubacteriumsp.)[27]。Fuchs等[45]從牛瘤胃中分離出一株厭氧優(yōu)桿菌屬細(xì)菌BBSH 797,已被開發(fā)為動(dòng)物飼料中DON脫毒的商業(yè)產(chǎn)品Mycofix。Awad等[46]測(cè)試了這種微生物飼料添加劑在肉雞中的體內(nèi)功效,證明它能減輕DON對(duì)小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的毒性作用。但已報(bào)道的具有脫環(huán)氧作用的細(xì)菌大多是絕對(duì)厭氧的,實(shí)際應(yīng)用中其功效會(huì)受到一定的影響。

        2.2.2.2 C3位氧化

        DON分子C3位的羥基能夠被多種微生物氧化成為酮基,形成產(chǎn)物3-keto-DON,其分子質(zhì)量相比DON減少了2 Da(圖2[47])。Shima等[48]分離自日本農(nóng)田土壤中的根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium rhizobium)菌株E3-39,其分泌的胞外酶將DON氧化形成3-keto-DON。隨后,從中國(guó)、加拿大等國(guó)家的土壤中也陸續(xù)分離到具有DON氧化活性的細(xì)菌,這些菌株均屬于德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)[48-49]。最近,He Weijie等[50]從小麥赤霉病流行的農(nóng)田土壤中分離到一株同樣具有C3位氧化活性的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)菌株S3-4,他們利用BAC文庫(kù)篩選克隆得到了SphingomonasS3-4中參與催化C3位氧化的關(guān)鍵酶AKR18A1,該酶屬于醛酮還原酶超家族。

        圖2 DON的氧化[47]Fig. 2 Oxidation of DON[47]

        2.2.2.3 C3位差向異構(gòu)化

        大量研究推測(cè),C3位差向異構(gòu)化過程由兩步反應(yīng)組成:第一步是DON先經(jīng)關(guān)鍵酶氧化C3位的—OH(R構(gòu)象)生成3-keto-DON;第二步是3-keto-DON由酮還原C3位的=O成S構(gòu)象的—OH,從而完成由DON向3-epi-DON的差向異構(gòu)化(圖3[51])。

        圖3 DON差向異構(gòu)化[51]Fig. 3 Epimerization of DON[51]

        目前具有差向異構(gòu)化能力的細(xì)菌已有不少報(bào)道,主要有類諾卡氏菌(Nocardioidessp.)、德沃斯式菌屬(Devosiasp.)和嗜熱菌科的一個(gè)新屬Paradevosia shaoguanensis,但是對(duì)關(guān)鍵酶的分離純化及特性研究較少[27]。

        分離自農(nóng)田土壤的類諾卡氏菌屬(Nocardioidessp.)菌株WSN05-2,是第一個(gè)被報(bào)道具有DON異構(gòu)化活性的菌株[52]。之后,Sato等[53]從土壤樣品中分離出的13 株有氧DON降解細(xì)菌能將DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON,其中9 種屬于革蘭氏陽性的諾卡氏菌屬,4 種屬于革蘭氏陰性的德沃斯式菌屬,表明實(shí)現(xiàn)差向異構(gòu)的降解菌至少分布在兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育限制屬中。

        目前針對(duì)德沃斯式菌屬的酶促差向異構(gòu)化的研究更為深入,德沃斯式菌同屬的不同菌株表現(xiàn)出來差向異構(gòu)化的能力存在差異,這與菌株是否表達(dá)參與DON氧化及3-keto-DON還原的關(guān)鍵酶有關(guān)。Hassan等[54]將DON與7 種Devosia屬菌株一起孵育,發(fā)現(xiàn)只有D. mutans17-2-E-8能將DON差向異構(gòu)化為3-epi-DON,其他菌株沒有顯示出差向異構(gòu)化DON的能力,但這幾種Devosia菌株均能不同程度地將3-keto-DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON。隨后,同課題組的Carere等[55]從D. mutans17-2-E-8中克隆了參與催化DON氧化形成3-keto-DON的基因,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá),進(jìn)一步測(cè)試了表達(dá)的降解酶DepA活性及其轉(zhuǎn)化DON的能力,發(fā)現(xiàn)該酶屬于吡咯喹啉醌依賴的乙醇脫氫酶,接著用同樣方法分離出參與異構(gòu)化第二步反應(yīng)的關(guān)鍵酶DepB,該酶屬于醛酮還原酶超家族[54]。最近,Wang Gang等[56]報(bào)道D.insulaeA16對(duì)DON及其隱蔽型毒素3-Ac-DON和15-Ac-DON的最終產(chǎn)物降解為3-keto-DON,無法催化3-keto-DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON,表明D. insulaeA16缺乏特異性還原3-keto-DON的酶。這也進(jìn)一步證實(shí)了DON差向異構(gòu)化以3-keto-DON作為中間體,通過兩步催化完成DON差向異構(gòu)化(表2)。

        表2 參與DON氧化和差向異構(gòu)化的細(xì)菌及關(guān)鍵酶Table 2 Bacteria and key enzymes involved in oxidation and emipmerization of DON

        2.3 動(dòng)物體內(nèi)對(duì)DON的代謝

        毒物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示,DON被攝入后首先穿過腸道屏障,在消化道中被微生物或在機(jī)體的腸黏膜、肝臟、腎臟等器官中降解成多種代謝產(chǎn)物,主要包括葡糖苷酸結(jié)合物(DON-glucoside acid,DON-GlcA)、DOM-1,進(jìn)而隨尿液及糞便排出體外。不同動(dòng)物對(duì)DON的腸道吸收和代謝過程存在較大差異,這與細(xì)菌在腸道內(nèi)的定位及關(guān)鍵酶有關(guān)[24,59-60]。

        2.3.1 葡萄糖醛酸化

        DON與葡萄糖醛酸在UGTs的催化下發(fā)生共軛作用形成DON-GlcA,主要包括DON-3-GlcA和DON-15-GlcA,且UGTs在肝臟、小腸和腎臟中分布廣泛[61]。Maul等[62]在體外模擬DON葡萄糖醛酸化時(shí),發(fā)現(xiàn)肝臟微粒體也可促進(jìn)DON-GlcA的形成,因?yàn)镈ON-GlcA的脂水分配系數(shù)(lgP值)較低,降低了其穿過細(xì)胞膜或結(jié)合核糖體的效率,進(jìn)而更利于排出體外[63]。有研究顯示,人攝入的DON約91%以DON-GlcA的形式排出體外,并且以DON-15-GlcA為主[24-25,64]。

        2.3.2 脫環(huán)氧作用

        在2.2.2.1節(jié)細(xì)菌脫環(huán)氧作用中已經(jīng)介紹DOM-1主要是在家禽和反芻動(dòng)物的腸道微生物催化下脫環(huán)氧形成的,而人和單胃動(dòng)物(豬和嚙齒動(dòng)物)只在小腸結(jié)腸區(qū)具有高分布脫環(huán)氧菌群,很大比例的DON穿過小腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)而被迅速吸收,而只有小部分的DON到達(dá)結(jié)腸后被細(xì)菌代謝成DOM-1[65]。例如豬攝入DON后,僅有約20%代謝為DOM-1通過糞便排出[66]。

        3 不同轉(zhuǎn)化途徑對(duì)DON隱蔽型毒素毒性的影響

        DON污染農(nóng)作物及糧食制品后,會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng),主要癥狀為頭昏、腹瀉、惡心、厭食、嘔吐以及白細(xì)胞缺乏癥[67]。這是由于DON與核糖體的結(jié)合抑制了蛋白質(zhì)合成的延伸,同時(shí)伴隨著核內(nèi)毒素應(yīng)激的發(fā)生,導(dǎo)致參與信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵細(xì)胞激酶的活化,從而產(chǎn)生毒性作用[2]。DON經(jīng)不同轉(zhuǎn)化途徑后形成不同隱蔽型毒素,其毒性也發(fā)生了不同的改變(圖4和表3)[47,68-72]。

        對(duì)于DON-3-G,葡萄糖苷造成一定空間位阻,導(dǎo)致其難以進(jìn)入核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心的A位口袋,無法引起核糖體毒素應(yīng)激,故而降低DON毒性作用[68]。研究發(fā)現(xiàn)3-Ac-DON、15-Ac-DON對(duì)腸屏障完整性會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響,增殖細(xì)胞的細(xì)胞毒性從小到大可排列為3-Ac-DON≤DON<15-Ac-DON[70],故C3位羥基乙?;徽J(rèn)為是植物防御機(jī)制的解毒作用,而C15位羥基被乙?;芗せ罱z裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑使其具有更高的毒性[73]。共軛結(jié)合型的隱蔽型毒素由于引入結(jié)合物,形成了空間位阻,一定程度降低了DON毒性作用(15-Ac-DON除外)。但DON-3-G、Ac-DONs在哺乳動(dòng)物的消化道中經(jīng)腸道微生物作用又重新水解釋放DON,同樣存在一定毒性作用的影響[74]。

        表4 DON的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 4 The structure of DON

        表3 DON及其隱蔽型毒素的毒性分析Table 3 Toxicity of DON and its masked forms

        DON分子結(jié)構(gòu)中C3位的羥基和C12和C13位的環(huán)氧基團(tuán)是主要的致毒性基團(tuán),從農(nóng)田土壤或動(dòng)物胃腸道篩選得到具有DON降解作用的細(xì)菌,作用機(jī)制就集中在這兩個(gè)致毒基團(tuán)上[2]。脫環(huán)氧形成的DOM-1、C3位的-OH氧化、差向異構(gòu)化得到的3-keto-DON和3-epi-DON是目前研究過程發(fā)現(xiàn)毒性作用較小的毒素衍生物。由于環(huán)氧基團(tuán)的損失,DOM-1僅形成兩個(gè)氫鍵,導(dǎo)致與核糖體的結(jié)合較不穩(wěn)定,且不會(huì)激活MAPK途徑,不同類型的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DOM-1對(duì)多種細(xì)胞毒性極低,幾乎無毒[72]。大量研究證明3-keto-DON免疫抑制毒性是DON的1/10,而3-epi-DON是一種接無毒的代謝物[47,71]。分子模擬顯示C3位羥基的氫原子與環(huán)氧基團(tuán)的氧原子之間的距離減小,有助于增加3-epi-DON的穩(wěn)定性,并影響其與核糖體的結(jié)合能力,對(duì)于降低DON毒性有著至關(guān)重要的作用[69]。

        4 DON隱蔽型毒素的檢測(cè)方法

        在以往檢測(cè)農(nóng)作物及其制品中DON含量時(shí),通常忽略了隱蔽型真菌毒素的存在及其危害性。檢測(cè)主要依靠色譜分析,包括薄層色譜、GC、HPLC,輔以免疫親和柱凈化(immunoaffinity chromatography,IAC)、固相萃取等樣品制備方法[4,14-15]。其中HPLC是常用的真菌毒素檢測(cè)方法,但隱蔽型毒素在常規(guī)HPLC檢測(cè)條件下,由于缺乏商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品,假陽性干擾較大[15]。在DON隱蔽型毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)程中,研究人員主要從兩個(gè)方面突破:一方面,利用合成、純化等方法得到隱蔽型毒素標(biāo)品以供檢測(cè),目前已有的標(biāo)準(zhǔn)品有3-Ac-DON、15-Ac-DON、DON-3-G;另一方面,進(jìn)一步采用LC-MS/MS、GC-MS/MS、UPLC-MS/MS等串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)DON隱蔽型毒素的定性和定量檢測(cè)[20-21,24]。

        LC-MS/MS是目前最常用的隱蔽型毒素定量分析方法,借助有效的色譜分離以及特征的碎片離子,可同時(shí)檢測(cè)混合樣品中的不同組分,故而可以對(duì)隱蔽型毒素及其原型、代謝物甚至不同類型的毒素同時(shí)進(jìn)行定量分析[6]。Palacios等[18]運(yùn)用LC-MS/MS第一次在阿根廷不同地區(qū)收獲的小麥中檢測(cè)到DON-3-G和少量的乙酰化衍生物。UPLC是在HPLC基礎(chǔ)上,以1.7 μm的超細(xì)色譜柱填料為核心的新型色譜分離分析技術(shù),可以極大地提高分離效率和分析速率[75]。Deng Chunli等[25]建立了IAC-UPLC-MS/MS檢測(cè)方法,運(yùn)用于河南省居民尿液樣品中DON及其隱蔽型毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,樣品前處理回收率為78.5%~112%,定量限為0.2~2 μg/L,極大地提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。

        5 結(jié) 語

        DON在生物作用下會(huì)轉(zhuǎn)化形成各種隱蔽型毒素,其中植物對(duì)DON的修飾是共軛結(jié)合,微生物主要是脫環(huán)氧作用和氧化還原作用,在動(dòng)物體內(nèi)大部分代謝為葡萄糖醛酸結(jié)合物。這些生物轉(zhuǎn)化往往并不徹底,使中毒癥狀更加復(fù)雜,增加了糧食及其副產(chǎn)品的安全風(fēng)險(xiǎn)。

        為了實(shí)現(xiàn)對(duì)DON的高效生物脫毒,以下方面還需進(jìn)一步研究:1)通過富集高選擇性培養(yǎng)基,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性凝膠電泳細(xì)菌譜和有效的分子技術(shù)增加從復(fù)雜的微生物群篩選微生物的機(jī)會(huì),以脫環(huán)氧和C3位差向異構(gòu)化為方向篩選安全、降解能力強(qiáng)的降解菌;2)使用活性酶也是真菌毒素降解的另一種研究方向,進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)DON降解微生物中發(fā)揮作用的關(guān)鍵酶的提取純化,并通過酶活性研究和分子模擬技術(shù)增強(qiáng)其對(duì)隱蔽型毒素的降解效果;3)進(jìn)一步提高檢測(cè)技術(shù),量化隱蔽型毒素的含量并制定限量標(biāo)準(zhǔn),最大限度地降低污染物對(duì)公眾健康的風(fēng)險(xiǎn);4)生物脫毒的微生物制劑可作為添加劑應(yīng)用于食品和飼料工業(yè),但需嚴(yán)格確保其功效及安全性。

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