李 可，李 燕，康超娣，相啟森，趙電波，白艷紅

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點實驗室，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

冷等離子體，也叫非熱平衡等離子體、非熱等離子體、大氣冷等離子體和冷大氣等離子體。冷等離子體是部分或全部電離的氣體。在冷等離子體中，電子溫度遠(yuǎn)高于全體氣體溫度和恒定離子溫度，氣體接近環(huán)境溫度（30～60 ℃）[1]。大氣壓氣體放電是產(chǎn)生冷等離子體的常用方法，氣體放電類型主要包括電暈放電、介質(zhì)阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）、常壓等離子體射流（atmospheric pressure plasma jet，APPJ）、薄層介質(zhì)屏障放電和射頻放電[2]等，產(chǎn)生的冷等離子體包含大量的反應(yīng)性活性物質(zhì)，包括羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、超氧陰離子、臭氧、一氧化氮、亞硝酸鹽、過氧亞硝酸鹽等[3]。

冷等離子體技術(shù)是一種新型的非熱加工殺菌技術(shù)。在肉類生產(chǎn)與加工中，冷等離子體技術(shù)主要率先應(yīng)用在肉類殺菌，即直接使用冷等離子體或制備等離子體活化水進(jìn)行肉類食源性致病菌或腐敗菌滅活研究[4-5]。近幾年來，國內(nèi)外研究者也逐步探究冷等離子體對肉與肉制品護(hù)色[6]和品質(zhì)的影響。有研究認(rèn)為該技術(shù)是“綠色”的亞硝酸生成方法，可替代直接添加的亞硝酸鹽或芹菜粉，其使肉制品中殘留的亞硝酸鹽含量顯著降低，口感在可接受范圍[7]。Yong[5]、Bauer[8]和喬維維[9]等研究表明，冷等離子體處理能夠有效殺滅肉與肉制品表面的微生物，同時對肉與肉制品的色澤、硫代巴比妥酸值、汁液流失率、嫩度等無顯著影響。目前關(guān)于冷等離子體對肉與肉制品成分影響的研究主要關(guān)注脂肪變化方面，對其他成分性質(zhì)影響，尤其是肌肉蛋白方面研究報道仍然較少。

肌肉蛋白質(zhì)是肉制品主要的結(jié)構(gòu)和功能性成分，其中肌原纖維蛋白質(zhì)占總蛋白的50%～55%，是賦予肉制品良好功能特性的重要蛋白質(zhì)。肌原纖維蛋白的功能性質(zhì)可通過肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出來。肌原纖維蛋白功能性質(zhì)受溫度、pH值、提取方法、處理條件、離子強(qiáng)度等因素影響[10]。冷等離子體應(yīng)用于肉與肉制品的殺菌中可能同時會對肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。最近，Ekezie等[11]通過APPJ修飾對蝦肌原纖維蛋白，結(jié)果表明蝦肌原纖維蛋白pH值和溶解度下降，粒徑和濁度顯著增加，并且二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Sharifian等[12]研究表明，在DBD處理牛肉里脊肌原纖維蛋白一定時間后，牛肉保水性和乳化特性有一定提升，并且促進(jìn)了羰基的氧化。然而，關(guān)于冷等離子體對雞肉肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)、流變學(xué)特性及結(jié)構(gòu)影響鮮見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)冷等離子體制備活化水能夠有效抑制雞肉假單胞菌生長，并未對雞肉顏色、質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)產(chǎn)生明顯影響[4,13]。因此，本研究期望通過APPJ直接作用于雞肉肌原纖維蛋白，評估其對肌原纖維蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)變化和流變特性的影響，為等離子體技術(shù)在肉品加工中的潛在應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉購自鄭州市丹尼斯超市，在購買后30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移到實驗室。剔除雞胸肉中的結(jié)締組織及多余脂肪，分袋真空包裝雞胸肉，每袋200 g，-20 ℃貯存，2 周內(nèi)完成實驗。

乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid，EGTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甘氨酸（glycine，Gly）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）和三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-PL200等離子表面處理機(jī) 深圳市東信高科技自動化設(shè)備有限公司；Discovery流變儀 美國TA儀器公司；高速攪拌器 德國IKA公司；XHF-D高速分散器（內(nèi)切式勻漿機(jī)） 寧波新芝生物科技股份有限公司；AvantiJ-26S XPI大容量高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Nano-ZS90激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司；F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；Vertex70傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 雞胸肉肌原纖維蛋白的提取

參考Zhao Yingying等[14]方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。將貯藏的雞胸肉于4 ℃解凍12 h，剔除可見結(jié)締組織和多余脂肪，切成1～2 cm3小塊，3 000 r/min絞碎15 s，重復(fù)4 次。0～4 ℃條件下提取肌原纖維蛋白。均勻絞碎的雞胸肉與分離緩沖液（10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2、10 mmol/L EGTA，pH 7.0）以料液比1∶4均勻混合，6 000 r/min下均質(zhì)4 次，每次15 s；混合物用20 目篩網(wǎng)（孔徑0.9 mm）過濾后，2 000×g離心20 min，收集沉淀物質(zhì)，相同的步驟再重復(fù)兩次，得到肌原纖維蛋白沉淀。將沉淀物按1∶4（m/V）的比例均勻分散在0.1 mol/L NaCl溶液中，2 000×g離心20 min，重復(fù)相同步驟兩次，得到純化的肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度測定采用雙縮脲方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。用緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）定容蛋白質(zhì)量濃度至10 mg/mL，肌原纖維蛋白于4 ℃保存。

1.3.2 等離子體射流處理肌原纖維蛋白

采用APPJ裝置產(chǎn)生冷等離子體，處理肌原纖維蛋白溶液，設(shè)備采用高工作電壓和高頻正弦波逆變器（5 kV、40 kHz），放電功率為750 W，以低壓空氣（0.18 MPa）為載體氣體，氣體流速30 L/min，噴嘴與蛋白樣品面之間的距離約為3 cm，將50 mL樣品放置于塑料燒杯（高16.0 cm、直徑5.5 cm）（圖1），處理時間為0、10、20、30、40 s。為防止樣品溫度過高并且保證冷等離子體活性成分在樣品中分布均勻，在樣品處理的過程中，每隔10 s，在冰水浴中攪拌30 s，樣品于4 ℃保存，在48 h內(nèi)進(jìn)一步分析。

圖1 APPJ處理肌原纖維蛋白示意圖Fig. 1 Schematic diagram of APPJ used to treat MP

1.3.3 pH值的測定

將處理好的肌原纖維蛋白樣品溶液從4 ℃冰箱中取出，采用PHS-3C pH計測定處理前后樣品溶液的pH值。將pH計電極浸入肌原纖維蛋白溶液中，記錄pH值。每個樣品至少測定3 次，記錄平均值。

1.3.4 濁度的測定

采用Benjakul等[15]的方法測定1 mg/mL肌原纖維蛋白的濁度，采用TU-1810紫外-可見分光光度計測定樣品的吸光度，用660 nm波長處吸光度來反映樣品濁度。

1.3.5 粒徑的測定

取1 mL l mg/mL肌原纖維蛋白于比色皿中，使用Nano-ZS90激光粒度儀測量樣品的粒徑，通過馬爾文標(biāo)準(zhǔn)操作程序軟件自動獲取粒徑，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.6 溶解度的測定

在4 ℃下，將1 mg/mL肌原纖維蛋白以10 000 r/min離心15 min，取1 mL的樣品上清液與4 mL的雙縮脲混合均勻，避光30 min，在540 nm波長處測定吸光度。溶解度用上清液蛋白質(zhì)量濃度與樣品中蛋白質(zhì)量濃度的比例表示。

1.3.7 動態(tài)流變特性的測定

選擇溫度掃描模式，樣品均勻涂布于測試平臺，用硅膠油密封，防止樣品中的水分蒸發(fā)。測試的具體參數(shù)設(shè)定為：頻率0.1 Hz、應(yīng)變0.5%、夾縫間距0.4 mm、起始溫度25 ℃、升溫速率2 ℃/min、終止溫度85 ℃、降溫速率10 ℃/min。測定儲能模量（G’）和損耗模量（G’）。

選擇25 ℃條件下進(jìn)行角頻率掃描，頻率掃描范圍為0.1～100 rad/s，應(yīng)變?yōu)?.5%。測定G’和G’。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）檢測在還原和非還原條件下肌原纖維蛋白質(zhì)的組分，根據(jù)Laemmli[16]的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?，在還原條件下，4 mg/mL的肌原纖維蛋白與緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）Gly、10% SDS、3.33% DTT和2%溴酚藍(lán)）以體積比1∶1均勻混合，混合物在100 ℃沸水浴中加熱5 min，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和4%濃縮膠，上樣量為10 μL。在非還原條件下，緩沖液中不包含DTT。電泳電壓：濃縮膠60 V、分離膠110 V。用考馬斯亮藍(lán)R250染色1 h，然后用脫色液脫色40 min。

1.3.9 表面疏水性的測定

參考Haskard等[17]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，用ANS為探針測定肌原纖維蛋白樣品的表面疏水性（S0-ANS），激發(fā)波長為386 nm，發(fā)射波長為466 nm。肌原纖維蛋白樣品質(zhì)量濃度調(diào)整到0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL，40 μL的ANS（8 mmol/L）與5 mL的蛋白溶液混合，室溫反應(yīng)20 min，然后根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度與相應(yīng)的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的初始斜率以S0-ANS表征。

1.3.10 自由巰基含量的測定

參照Ellman[18]的方法。稀釋肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度至2 mg/mL，取1 mL的蛋白溶液與4 mL的混合溶液（含10 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）混合，在混合物中加入100 μL 10 mmol/L的DTNB，混合物在4 ℃反應(yīng)1 h，用分光光度計在412 nm波長處測定吸光度，以摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算自由巰基含量。

1.3.11 FTIR分析

參考Li Ke等[19]的方法。經(jīng)等離子體處理后肌原纖維蛋白懸浮液冷凍干燥24 h。取1 mg樣品與150 mg溴化鉀混合，用瑪瑙材料制備的儀器研磨混合物。粉末放入直徑為1 cm的圓盤里，在一定的壓力下保持1 min壓片制樣，重復(fù)掃描64 次，分辨率4 cm-1，記錄4 000～400 cm-1區(qū)域的所有FTIR圖。利用Peak Fit軟件對酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)峰擬合獲得了二級結(jié)構(gòu)的信息。計算二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)卷曲的相對含量。每個樣品重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan’s多重比較檢驗法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 APPJ處理肌原纖維蛋白pH值、溶解度和濁度的變化

表1 APPJ處理肌原纖維蛋白的pH值、濁度和溶解度的變化Table 1 Changes in pH, turbidity and solubility of APPJ-treated MP

如表1所示，APPJ處理肌原纖維蛋白樣品后顯著降低pH值（P＜0.05）。APPJ處理40 s后，樣品pH值由6.75降至6.56。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)相對于對照組，APPJ處理去離子水制備的等離子體活化水理化性質(zhì)發(fā)生明顯改變，pH值顯著降低；溶液的氧化還原電位升高，同時H2O2、NO3-和NO2-的濃度增加[13]。這些理化性質(zhì)變化也可能發(fā)生在APPJ處理肌原纖維蛋白溶液中，活性物質(zhì)與液體基質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可以為肌原纖維蛋白營造酸性環(huán)境[20]。Traylor等[21]研究發(fā)現(xiàn)，冷等離子體作用液體物質(zhì)，溶液pH值的變化不僅同水分子與過氧化氫的作用產(chǎn)生酸性H3O+離子相關(guān)，與氮類物質(zhì)形成亞硝酸（HNO2）和硝酸（HNO3）也相關(guān)。Sharifian等[12]研究發(fā)現(xiàn)，等離子體處理牛肉肌原纖維蛋白懸浮液20 min后，其pH值由5.8下降到5.2，本研究中pH值下降的程度沒有該結(jié)果高，這可能是由于肌原纖維蛋白本身和所使用的緩沖液減少了pH值下降程度。

蛋白質(zhì)溶解度是水和蛋白質(zhì)之間通過偶極-偶極和離子-偶極力相互作用的結(jié)果[12]，是蛋白質(zhì)變性和聚集的直接反映。由表1可知，與未處理組對比，APPJ處理肌原纖維蛋白的溶解度顯著降低（P＜0.05）；處理40 s后，肌原纖維蛋白的溶解度下降到30.14%。蛋白質(zhì)溶解度下降的主要原因可能是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在APPJ處理肌原纖維蛋白時，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，蛋白鏈展開，最初被掩埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和活性巰基被暴露出來，增強(qiáng)疏水基團(tuán)相互作用，氧化活性物質(zhì)可能會氧化活性巰基生成二硫鍵。上述原因可能造成蛋白質(zhì)親水性能力減弱，蛋白質(zhì)聚集后會發(fā)生凝聚沉淀，導(dǎo)致溶解性降低。Chen Lin等[22]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度H2O2處理的類灰白肉和正常豬肉肌原纖維蛋白溶解度隨著H2O2濃度的增加而降低。此外，肌原纖維蛋白的濁度也隨APPJ處理時間延長而增加，結(jié)果印證了APPJ處理肌原纖維蛋白溶解度的降低。濁度的增加可能是由于肌原纖維蛋白分子的展開和聚合，通過雙酪氨酸、活性羰基-NH2相互作用和二硫鍵進(jìn)行聚合，使單體蛋白質(zhì)變成更大的蛋白質(zhì)[23]。

2.2 APPJ處理肌原纖維蛋白粒徑的變化

圖2 APPJ處理肌原纖維蛋白的粒徑變化Fig. 2 Changes in particle size of MP treated by APPJ

圖2反映APPJ處理后肌原纖維蛋白溶液粒徑變化。未處理和APPJ處理肌原纖維蛋白的粒徑在680.15 nm和759.00 nm之間，所有APPJ處理樣品的粒徑顯著高于未處理組（P＜0.05）?？赡苁怯捎趦蓚€原因造成樣品粒徑增加：一方面，APPJ產(chǎn)生的高能量離子轟擊肌原纖維蛋白，導(dǎo)致其活性位點的暴露；另一方面，氧化的活性物質(zhì)可能誘導(dǎo)肌原纖維蛋白氧化，并且促進(jìn)疏水相互作用和分子間二硫鍵的形成。Ji Hui等[24]的研究結(jié)果表明DBD等離子體處理的花生蛋白樣品在4 min后，其平均粒度增加，可能是活性物質(zhì)的作用增強(qiáng)了水膠束與蛋白質(zhì)分子的附著，導(dǎo)致聚集體形成。

2.3 動態(tài)流變特性分析結(jié)果

圖3 APPJ處理肌原纖維蛋白在升溫過程中G’的變化Fig. 3 Changes in storage modulus (G’) of APPJ-treated MP as a function of heating temperature

圖4 APPJ處理肌原纖維蛋白在角頻率變化過程中的G’和G″的變化Fig. 4 Changes in G’ and G″ of APPJ-treated MP as a function of angular frequency

G’表示凝膠結(jié)構(gòu)中由彈性變形量變化而引起的能量變化，G″表示加熱過程中黏性的變化，可以反映肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的折疊和聚集。本實驗研究了肌原纖維蛋白溫度和角頻率的流變圖。溫度掃描的動態(tài)流變G’曲線變化如圖3所示，所有處理組G’曲線變化趨勢一致，肌原纖維蛋白樣品表現(xiàn)出黏蛋白溶膠向黏彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)化的典型流變特性[25]。在25～45 ℃之間，處理組的G’趨于平緩模式。當(dāng)溫度上升到46～51 ℃時，G’呈線性升高，這是凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的初始階段，部分肌球蛋白變性，此時肌球蛋白頭部通過二聚作用開始交聯(lián)，形成彈性的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在溫度升高到51～57 ℃時，G’急劇下降，肌球蛋白尾部變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生重組，之前低溫下形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，溫度為57～85 ℃時，G’第二次上升，由于共價二硫鍵和疏水相互作用而形成永久性不可逆交聯(lián)的肌球蛋白絲，此時樣品體系已形成良好的三維凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在加熱過程中，不同處理時間APPJ肌原纖維蛋白的彈性之間差異明顯。APPJ處理時間為40 s的肌原纖維蛋白的G’最大，未處理的肌原纖維蛋白的彈性最小。結(jié)果表明，APPJ改善了肌原纖維蛋白的彈性，這可能是由于等離子體活化水中過氧化氫和羥自由基等物質(zhì)[13]，使肌原纖維蛋白發(fā)生氧化，從而改善其彈性。另外，凝膠彈性的增強(qiáng)可能與肌原纖維蛋白質(zhì)交聯(lián)模式的改變有關(guān)。在加熱APPJ處理的肌原纖維蛋白形成凝膠過程中，氧化物質(zhì)的存在可能氧化肌球蛋白尾部二硫鍵交聯(lián)，肌球蛋白尾部的二硫鍵的交聯(lián)比非氧化條件下的肌球蛋白頭和頭交聯(lián)更加穩(wěn)定[26]，促進(jìn)肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。Xiong Youling L.等[27]的研究表明羥自由基氧化系統(tǒng)能增強(qiáng)肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。另外，胡忠良等[28]研究不同濃度H2O2氧化體系對肌原纖維蛋白的凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)H2O2濃度低于0.10 mmol/L時，隨著氧化劑濃度升高，蛋白質(zhì)的凝膠特性得到改善。

角頻率掃描中，根據(jù)G’和G″曲線可以把樣品分為4 個等級的分散體系，分別為稀溶液、濃溶液、弱凝膠和強(qiáng)凝膠[29]。稀溶液在角頻率掃描區(qū)域G″一直高于G’。濃溶液G’和G″兩條曲線在角頻率掃描區(qū)域的中間位置相交，這個現(xiàn)象揭示隨著溶液濃度的提高，在一定的角頻率下，樣品的表現(xiàn)行為接近固體[30]。弱凝膠在整個角頻率掃描區(qū)域，G’高于G″，兩條升溫曲線的趨勢一致，兩條曲線幾乎平行。強(qiáng)凝膠與弱凝膠相似，G’的升溫曲線在G″曲線的上方，其中G’的曲線的初始斜率為0，G″曲線在角頻率的中間區(qū)域有最小值[31]。不同APPJ處理時間的肌原纖維蛋白凝膠黏彈性的變化曲線如圖4所示，在角頻率掃描區(qū)域，G’曲線的初始斜率為0，G″曲線在角頻率的中間區(qū)域有最小值，樣品狀態(tài)符合強(qiáng)凝膠體系。每個處理組中高角頻率區(qū)的G’大于低角頻率區(qū)的G’，在角頻率掃描過程中，肌原纖維蛋白的G’與APPJ處理時間成正比，依次為40 s＞30 s＞20 s＞10 s＞0 s。整個角頻率掃描區(qū)域，G″曲線變化趨勢和G’一致。G’和G″曲線對比，G’＞G″，APPJ處理肌原纖維蛋白增強(qiáng)了其加熱過程中的黏彈性。

2.4 SDS-PAGE分析結(jié)果

如圖5所示，SDS-PAGE反映肌原纖維蛋白的組成變化。未處理組和APPJ處理的肌原纖維蛋白主要條帶包括肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和原肌球蛋白，分別對應(yīng)的分子質(zhì)量為200、43 kDa 和35 kDa。在還原和非還原條件下，相對于未處理組，隨著APPJ處理時間的延長，APPJ處理組蛋白的條帶沒有明顯的改變。本實驗結(jié)果說明APPJ處理肌原纖維蛋白沒有改變其分子質(zhì)量，或者降解肌原纖維蛋白分子。Ekezie等[32]研究APPJ處理對蝦肌動球蛋白，在還原和非還原條件下，APPJ處理沒有降解或改變肌動球蛋白的組成。DBD處理花生蛋白時，隨著處理時間的延長，花生蛋白的一級結(jié)構(gòu)沒有被破壞，并且花生蛋白質(zhì)沒有與糖類以及其他蛋白質(zhì)等分子之間形成共價鍵[24]。Liao Xinyu等[33]的研究也表明，貯存過程中低溫等離子體活化水冰塊沒有加速基圍蝦肌動球蛋白分子的降解。

圖5 APPJ處理肌原纖維蛋白的SDS-PAGE譜圖Fig. 5 SDS-PAGE of MP treated by APPJ

2.5 APPJ處理肌原纖維蛋白表面疏水性變化

疏水基團(tuán)對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定起著重要作用。非極性氨基酸殘基側(cè)鏈間的疏水作用是導(dǎo)致特定蛋白質(zhì)分子折疊成三級結(jié)構(gòu)的主要原因。由于ANS對微環(huán)境的敏感性，ANS熒光探針法是檢測蛋白質(zhì)表面疏水性的常用方法。S0-ANS的變化可以表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，如三級結(jié)構(gòu)的變化[34]。

圖6 APPJ處理肌原纖維蛋白的表面疏水性變化Fig. 6 Changes in surface hydrophobicity in MP treated by APPJ

如圖6所示，APPJ處理樣品的S0-ANS顯著增加（P＜0.05），表明APPJ對樣品S0-ANS有顯著影響。這可能是APPJ誘導(dǎo)肌原纖維蛋白分子鏈展開和拉伸，導(dǎo)致以前位于肌原纖維蛋白分子內(nèi)部和非極性環(huán)境的疏水基團(tuán)的暴露。因此，ANS探針更容易與之前包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)結(jié)合，增加S0-ANS。肌原纖維蛋白的疏水作用增強(qiáng)可能導(dǎo)致2.1節(jié)中溶解度的降低，蛋白質(zhì)的水溶性能力降低，蛋白質(zhì)聚集。這與先前的研究一致，APPJ處理對蝦肌原纖維蛋白有利于S0-ANS的增加[11]。但是與Ji Hui等[24]的研究結(jié)果相反，可能是由于產(chǎn)生等離子體的設(shè)備和載氣的不同，或者是由于作用的蛋白樣品不同。

2.6 APPJ處理肌原纖維蛋白自由巰基含量的變化

圖7 APPJ處理肌原纖維蛋白的自由巰基含量變化Fig. 7 Changes in free sulfhydryl content of APPJ-treated MP

巰基是表達(dá)蛋白質(zhì)功能的重要活性基團(tuán)，肌原纖維蛋白中肌球蛋白含有豐富的活性巰基，包含3 種活性巰基：SH1、SH2和SHa，前兩種分布在肌球蛋白頭部，與肌球蛋白ATP酶活性密切相關(guān)；最后一種位于輕酶解肌球蛋白，影響肌球蛋白重鏈的氧化及肌球蛋白二聚體形成。圖7反映APPJ處理的肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化，相比未處理組，隨著APPJ處理時間的延長，肌原纖維蛋白的活性巰基含量先增加后降低，但處理組肌原纖維蛋白的活性巰基含量分別顯著高于對照組（P＜0.05）。2.4節(jié)SDS-PAGE結(jié)果中，處理組的肌原纖維蛋白組分和分子質(zhì)量沒有變化，表明APPJ處理肌原纖維蛋白沒有改變SHa的活性。

自由巰基含量的變化揭示APPJ對肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)有一定的影響，在一定程度上可能打開肌原纖維蛋白鏈，以前位于蛋白質(zhì)的分子內(nèi)部的巰基暴露在分子的表面，結(jié)果導(dǎo)致活性巰基的含量顯著增加（P＜0.05）。APPJ處理時間進(jìn)一步延長時，自由巰基含量顯著降低（P＜0.05），可能是由于APPJ處理肌原纖維蛋白產(chǎn)生的活性氧化物（O3和H2O2）的存在，氧化活性巰基生成二硫鍵。Zhang Tao等[35]研究報道，采用不同濃度的臭氧水處理花鰱，肌原纖維蛋白的活性巰基含量先上升后下降?？赡苁怯捎诔粞跹趸钚詭€基形成二硫鍵。另外一種原因是，主要含有巰基成分的半胱氨酸對H2O2極敏感，可能是由于活性巰基經(jīng)過氧化生成次磺酸和亞磺酸[36]。Chen Xing等[37]研究表明，巰基含量變化也是由于H2O2氧化的結(jié)果，導(dǎo)致一些復(fù)雜的反應(yīng)發(fā)生，生成多種含硫產(chǎn)物。

2.7 FTIR分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的酰胺帶具有多種不同的振動模式，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）對外界的感應(yīng)非常敏感，該區(qū)域振動主要包括多肽中N—H基團(tuán)的面內(nèi)彎曲、Cα—C—N彎曲、C＝O基團(tuán)的伸縮振動，以及肽鍵中C—N的伸縮振動，主要用來反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的變化。

圖8 APPJ處理肌原纖維蛋白的FTIR圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectrometer spectra of APPJ-treated MP

表2 APPJ處理肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量變化Table 2 Changes in secondary structure content of APPJ-treated MP

由圖8和表2可見，與未處理組相比，APPJ處理的肌原纖維蛋白，有序的二級結(jié)構(gòu)比例減少，α-螺旋相對含量從47.92%逐漸下降到26.21%。而β-折疊相對含量先顯著增加，然后又降低，處理40 s后，與未處理組無顯著差異（P＞0.05）。β-轉(zhuǎn)角相對含量從19.99%逐步增加到35.75%，無規(guī)卷曲相對含量從11.68%增加到22.97%。肽鏈中的全部肽鍵都可形成氫鍵，每個肽鍵都有由N—H和C＝O的極性產(chǎn)生的偶極距，α-螺旋靠肽鍵間氫鍵維持穩(wěn)定，α-螺旋中所有氫鍵都沿螺旋軸指向同一方向；β-折疊靠肽鍵的C＝O和位于同一肽鏈或相鄰肽鏈N—H之間形成的鍵間氫鍵維持；在APPJ處理肌原纖維蛋白的過程中，可能造成肌原纖維蛋白的鏈打開，氫鍵能力減弱。隨著APPJ處理時間延長，二級結(jié)構(gòu)的比例分布發(fā)生改變。二級結(jié)構(gòu)中無序結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）含量增加，有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋和β-折疊）含量減少。Misra等[38]使用FTIR探究常壓冷等離子體對小麥面粉的二級結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)在短時間內(nèi)常壓冷等離子體處理的小麥面粉中平行和反平行β-折疊含量減少，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量上升；Dong Shuang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在不同壓強(qiáng)和處理時間，常壓冷等離子體輕微的影響了玉米醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)；Sharifian等[12]報道了DBD的等離子體顯著影響了牛肉里脊肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量。等離子體處理10 min的牛肉肌原纖維蛋白α-螺旋含量下降，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，結(jié)構(gòu)的可變動性增強(qiáng)。處理20 min后，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量增加，表明肌原纖維蛋白發(fā)生聚集。綜上所述，APPJ作用于肌原纖維蛋白，會影響肌原纖維蛋白的解折疊與聚集程度，應(yīng)注意APPJ直接放電時間。

3 結(jié) 論

APPJ處理肌原纖維蛋白會改變其理化性質(zhì)。雞肉肌原纖維蛋白的pH值和溶解度降低，濁度和粒徑增加。因此，利用APPJ直接處理肉類蛋白時，應(yīng)控制放電時間，減少肌原纖維蛋白溶解性和pH值下降程度。APPJ促進(jìn)肌原纖維蛋白鏈展開，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)鏈內(nèi)部的疏水基團(tuán)和自由巰基暴露，表面疏水性顯著增加，自由巰基含量先增加后降低。二級結(jié)構(gòu)中氫鍵能力減弱，二級結(jié)構(gòu)的比例分布改變，二級結(jié)構(gòu)中無序結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）含量增加，有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋）含量減少。在還原和非還原條件下，蛋白質(zhì)的組成成分和分子質(zhì)量沒有發(fā)生改變。動態(tài)流變結(jié)果表明APPJ處理能夠增強(qiáng)蛋白的動態(tài)流變學(xué)特性。這些變化都會影響肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)功能及肌肉蛋白的品質(zhì)，利用APPJ處理肉類蛋白時，應(yīng)注意放電處理時間。本實驗結(jié)果為冷等離子體技術(shù)在肉制品加工中的應(yīng)用提供了一定的理論參考依據(jù)。