周佳，莫夢(mèng)軍，劉蘇來(lái)，厲鷗，宋穎輝，彭創(chuàng)

（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科/湖南省膽道疾病防治臨床醫(yī)療技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410005）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種外分泌胰腺的炎癥性疾病，與組織損傷和壞死有關(guān)。目前，AP的全球發(fā)病率為34/100000，且在全世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。近年來(lái)，由于胰腺炎的準(zhǔn)確診斷和合理治療，以及重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）患者的有效護(hù)理，AP相關(guān)病死率從1.6%下降到0.8%[1]。然而AP高發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和長(zhǎng)期并發(fā)癥仍然困擾著醫(yī)學(xué)界，給社會(huì)和醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)額外的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以對(duì)AP的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防迫在眉睫；自噬在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生理和病理作用已被報(bào)道[2-4]。最近研究[5-7]表明，受損的自噬通量介導(dǎo)腺泡細(xì)胞空泡的形成和胰蛋白酶原的激活，導(dǎo)致AP的發(fā)生。因此自噬受損在AP的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，胰腺腺泡細(xì)胞自噬紊亂與AP的發(fā)生有關(guān)，自噬失調(diào)促進(jìn)了AP的發(fā)展，這提示提高自噬效率的藥理學(xué)方法可能對(duì)治療AP具有重要意義。

1 自噬及其分子機(jī)制

自噬是細(xì)胞清除胞質(zhì)中受損、缺陷或無(wú)用的細(xì)胞器、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并回收其成分以滿足生物新陳代謝的營(yíng)養(yǎng)和能量需要的主要分解代謝過(guò)程[8]。在研究細(xì)胞內(nèi)吞的過(guò)程中，細(xì)胞外的物質(zhì)首先進(jìn)入吞噬小泡，然后吞噬小泡與溶酶體融合，產(chǎn)生一個(gè)被稱為吞噬-溶酶體的復(fù)合體，目標(biāo)物在此復(fù)合體中降解[9]。而細(xì)胞內(nèi)成分的降解過(guò)程則難以分析，Clark[10]首次通過(guò)觀察新生小鼠腎小管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)除了溶酶體外，還有形狀不規(guī)則的液泡，其中含有非晶態(tài)物質(zhì)，偶爾也有線粒體，這是人們首次發(fā)現(xiàn)自噬的存在。1963年，De Duve[11]通過(guò)對(duì)溶酶體或液泡中細(xì)胞質(zhì)成分的降解過(guò)程的觀察，發(fā)現(xiàn)并正式命名了“自噬”。自噬是一個(gè)多步驟、溶酶體驅(qū)動(dòng)的降解過(guò)程，是一種在自噬相關(guān)基因（ATG）調(diào)控下通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)成分的高度保守、嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞過(guò)程[12]。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同，可將自噬分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[13-15]，一般情況下所說(shuō)的自噬主要是指大自噬。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，自噬主要分為5個(gè)階段[15-16]，包括：(1) 吞噬細(xì)胞膜的誘導(dǎo)和成核；(2) 自噬體的延伸；(3) 自噬體關(guān)閉成熟；(4) 自噬體溶酶體融合；(5) 分解產(chǎn)物的降解。

自噬的形態(tài)學(xué)特征是隔離囊泡的形成，稱為自噬小體，而大部分自噬相關(guān)蛋白在囊泡形成的階段起作用[17]。研究[18-19]最初在酵母中發(fā)現(xiàn)了自噬機(jī)制的分子組成，之后在高等真核生物中發(fā)現(xiàn)了許多具有同源性的蛋白質(zhì)。自噬相關(guān)基因（ATG）[20]在哺乳動(dòng)物中有11個(gè)同源基因，其中有8個(gè)參與了兩個(gè)獨(dú)立又聯(lián)系的結(jié)合反應(yīng)[21]。哺乳動(dòng)物自噬的分子機(jī)制，尤其是分子、膜和信號(hào)級(jí)聯(lián)如何協(xié)同調(diào)控各個(gè)階段的具體機(jī)制尚不明確。Mercer等[22]分析了自噬的調(diào)控機(jī)制，從分子的角度對(duì)哺乳動(dòng)物自噬體生物學(xué)變化過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。

與自噬的調(diào)控密切相關(guān)的物質(zhì)，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)分為絲氨酸/蘇氨酸復(fù)合物（ULK1/2）、III類磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K/PI3K）復(fù)合物（PIK3C3/VPS34，Beclin 1）、III類磷脂酰肌3-激酶效應(yīng)器（PtdIns3P）、WIPI蛋白質(zhì)和兩種泛素類復(fù)合物（ATG12-ATG5-ATG16L1，LC3/ATG8）以及跨膜自噬相關(guān)蛋白ATG9[23]。自噬的過(guò)程是由自噬相關(guān)蛋白（ATG）的分級(jí)招募復(fù)合物介導(dǎo)，起始受unc-51樣激酶（ULK1；酵母中為ATG1）介導(dǎo)，作用于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），然后形成另一個(gè)包含III類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物（PIK3C3/VPS34和Beclin1蛋白），作為吞噬泡核心。

吞噬泡招募的WIPI2蛋白，與類似泛素E3的復(fù)合體ATG12-ATG5-ATG16L1相連接[24]，吞噬泡形成過(guò)程的最主要特征是通過(guò)ULK復(fù)合體和AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）的途徑的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。在自噬誘導(dǎo)過(guò)程中，mTOR與ULK1復(fù)合物解離，導(dǎo)致其去磷酸化，從而激活自噬[25]。AMPK通過(guò)直接或間接使ULK1磷酸化的方式來(lái)激活自噬[24]（圖1）ULK1活性的關(guān)鍵靶點(diǎn)受III類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物（PI3K）調(diào)控，包括Beclin-1（ATG6）和VPS34[26]。自噬調(diào)控的條途徑包括mTOR途徑，Atg 6/Beclin-1 調(diào)控途徑以及兩個(gè)泛素樣結(jié)合過(guò)程途徑[27-28]。自噬的主要調(diào)節(jié)因子是雷帕霉素，mTOR作為自噬誘導(dǎo)的上游機(jī)制靶點(diǎn)，感知細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活，直接抑制自噬。雷帕霉素是mTOR的特異性抑制劑，沉默或抑制mTOR激酶的活性可以增強(qiáng)自噬作用已達(dá)到調(diào)控自噬的目的，為疾病的治療提供新的策略。

2 自噬在AP 中的作用

圖1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬的基本過(guò)程和相關(guān)途徑Figure 1 Basic process and relevant pathways of autophagy in the mammalian cells

胰腺腺泡細(xì)胞的主要生理功能是合成、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和分泌消化酶。它依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、線粒體和內(nèi)溶酶體自噬系統(tǒng)在內(nèi)的腺泡細(xì)胞器的正常功能。近年來(lái)的研究[29]表明，這些細(xì)胞器的功能在胰腺炎中紊亂，并為AP的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。目前已經(jīng)明確，溶酶體和胰蛋白酶原部分在細(xì)胞器中共區(qū)域化，是一個(gè)腺泡細(xì)胞自噬的過(guò)程[5,30-32]。在胰腺炎早期觸發(fā)這種自噬反應(yīng)的確切機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為病理性鈣信號(hào)是自噬發(fā)生前的關(guān)鍵事件[5,30]，也可能是抑制酶原異常積累的腺泡細(xì)胞分泌的機(jī)制。自噬通過(guò)維持高蛋白質(zhì)合成率和防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、DNA損傷在胰腺腺泡細(xì)胞中發(fā)揮重要生理作用[33]。反之，自噬受損會(huì)使胰腺功能的逐漸喪失，從而導(dǎo)致胰腺炎的發(fā)展[33]。Biczo等[9]在多種AP動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙和自噬受損在AP的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。因此，異常自噬在胰腺炎中發(fā)揮重要作用。

2.1 AP 中自噬體的積累

在30年前，研究者[34]從人類AP標(biāo)本中首次觀察到自噬性液泡的積累和大量腺泡細(xì)胞的破壞。細(xì)胞質(zhì)空泡化是胰腺炎組織損傷的早期表現(xiàn)，與腺泡細(xì)胞中酶原顆粒的改變和自噬體的形成有關(guān)[34]。過(guò)去幾年內(nèi)，越來(lái)越多的證據(jù)表明這種病理空泡化反映了自噬體的積累[32,35]。在溶酶體中自噬物質(zhì)被降解之前，自噬體依賴溶酶體相關(guān)膜蛋白2（LAMP-2）與溶酶體融合形成自噬溶酶體[36]。自噬流的阻斷表現(xiàn)為自噬蛋白降解減少和溶酶體標(biāo)記物的積累（如Rab7和LAMP-2）。自噬蛋白降解減少與腺泡細(xì)胞中LC3的積累增加、溶酶體清除效率低下等有關(guān)。然而，研究數(shù)據(jù)顯示，導(dǎo)致胰腺炎病理表現(xiàn)的并不是自噬本身，而是其損傷[5-6]，這在前文已有論述。自噬流受損和自噬體在腺泡細(xì)胞中的積累導(dǎo)致腺泡細(xì)胞空泡化和腺泡內(nèi)胰蛋白酶積累，這是AP的關(guān)鍵病理反應(yīng)。

2.2 自噬與溶酶體

自噬開始于自噬物質(zhì)的隔離，然后與溶酶體融合形成自噬-溶酶體復(fù)合體，最終被溶酶體水解酶降解[37]。由此可見(jiàn)，自噬是一個(gè)溶酶體介導(dǎo)的過(guò)程，細(xì)胞通過(guò)這個(gè)過(guò)程降解和回收胞內(nèi)物質(zhì)。自噬的進(jìn)展取決于溶酶體的功能，即溶酶體與自噬體的正確融合和高效的溶酶體蛋白水解活性。生理激活的自噬既需要誘導(dǎo)自噬體形成，也需要溶酶體降解介導(dǎo)的高效自噬流[36]。LAMP-2是一種普遍存在的溶酶體膜蛋白，在正常的人胰腺組織中高表達(dá)[38]，在自噬過(guò)程的后期，溶酶體與自噬體的適當(dāng)融合需要LAMP-2[39]，有實(shí)驗(yàn)[40]通過(guò)敲除LAMP-2蛋白抑制自噬體-溶酶體融合，阻止自噬體的轉(zhuǎn)化來(lái)觸發(fā)自噬體的積累。Fortunato等[41]通過(guò)對(duì)酒精性AP大鼠注射脂多糖試驗(yàn)證實(shí)急性壞死性胰腺炎（ANP）會(huì)導(dǎo)致LAMP-2的耗盡，腺泡細(xì)胞內(nèi)大量空泡積累。筆者認(rèn)為胰腺炎的腺泡細(xì)胞空泡化是由LAMP-2的耗竭介導(dǎo)的，而LAMP-2的耗竭反過(guò)來(lái)又促進(jìn)了自噬體的積累[40]，因此溶酶體蛋白LAMP-2的缺失可能通過(guò)影響自噬在AP的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。自噬體的積累可能涉及溶酶體系統(tǒng)的普遍衰竭，這強(qiáng)調(diào)了溶酶體缺陷對(duì)胰腺炎中自噬的影響。

2.3 自噬與線粒體

自噬的過(guò)程需要多種細(xì)胞器的參與，線粒體通過(guò)產(chǎn)生ATP參與各項(xiàng)生理活動(dòng)[42]，線粒體功能障礙導(dǎo)致自噬受損、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致AP[43]。線粒體膜通透性是引起細(xì)胞凋亡和壞死的普遍機(jī)制，它是由線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPT）的持續(xù)開放介導(dǎo)的，MPT是一種穿過(guò)內(nèi)外線粒體膜的多蛋白非特異性通道[44-45]，主要為線粒體常駐蛋白親環(huán)素D（CypD）組織，可被遺傳、分子或藥物抑制，阻斷MPT的開放可防止線粒體衰竭和壞死。在MPT“開放”狀態(tài)，其允許外界溶質(zhì)（包括水）無(wú)限度地進(jìn)入線粒體基質(zhì)，使線粒體去極化，從而抑制線粒體合成ATP，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失和壞死。值得注意的是，AP中線粒體去極化顯著激活自噬，特別是線粒體自噬[46]，而線粒體功能障礙后無(wú)法合成ATP，進(jìn)一步促進(jìn)自噬誘導(dǎo)。MPT與AP有直接關(guān)系，若通過(guò)基因沉默來(lái)抑制不同AP中腺泡細(xì)胞中的MPT相關(guān)蛋白后，相應(yīng)的炎癥、自噬水平、免疫應(yīng)答水平會(huì)下降[47]。線粒體和溶酶體功能障礙相互增強(qiáng)，共同造成的自噬流受損，進(jìn)而導(dǎo)致AP（圖2）。

圖2 AP 中線粒體和溶酶體功能異常相互增強(qiáng)，促進(jìn)自噬受損Figure 2 Interaction enhanced dysfunction of the mitochondrion and lysosome promoting autophagy damage in AP

2.4 高遷移率族蛋白HMGB1 參與AP 的自噬

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白它調(diào)節(jié)和促進(jìn)多種DNA活動(dòng)，如轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和修復(fù)。有研究[48]報(bào)道小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)HMGB1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)后，HMGB1蛋白A-box的C 23、C 45 位點(diǎn)以二硫橋的形式直接與自噬因子BECN1結(jié)合，推動(dòng)BECN1與凋亡抑制因子Bcl-2分離，通過(guò)促進(jìn)BECN1和III 型磷酸肌醇3 激酶（PI3K Class III）/Vsp34結(jié)合，激活自噬。此外，HMGB1與RAGE結(jié)合可以激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）。激活的ERK可以激活死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK），使BECN1磷酸化，促使BECN1與Bcl-2分離，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平[49]。在AP 的患者和動(dòng)物模型中，血清HMGB1水平顯著升高，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[50-51]，抑制HMGB1的釋放或細(xì)胞因子活性可對(duì)胰腺炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ彤a(chǎn)生保護(hù)作用[52]。在胰腺細(xì)胞核中，HMGB1在許多基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用，這些基因?qū)ψ允蛇^(guò)程至關(guān)重要[53-54]。AP中HMBG1參與ANP相關(guān)的自噬[55-56]。有研究[57]通過(guò)對(duì)大鼠ANP模型的HMGB1檢測(cè)，顯示HMGB1最初在細(xì)胞核中增加，可能導(dǎo)致自噬的啟動(dòng)，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，與BECN1相互作用，增強(qiáng)自噬，最后HMGB1釋放到血液中，導(dǎo)致A N P 惡化。因此，細(xì)胞HMGB1的水平與AP的自噬有著密切的關(guān)系，可以通過(guò)檢測(cè)并其表達(dá)水平來(lái)評(píng)估AP的嚴(yán)重程度進(jìn)而采取針對(duì)性的治療方式以延緩AP進(jìn)展，而其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 阻斷異常自噬水平在轉(zhuǎn)變SAP 進(jìn)展期的應(yīng)用

自噬流受損是AP早期的一個(gè)特征，自噬通量的積累可以通過(guò)激活氧化應(yīng)激和核因子κB（NF-κB）通路從而加重疾病的過(guò)程。AP的自噬為一種異常自噬，隨著自噬程度的增加，炎癥水平增加，導(dǎo)致病情加重。前期研究已經(jīng)證明了自噬在胰腺炎發(fā)展中的重要作用，然而從自噬的角度對(duì)AP 病情的改善上的探討還較少。自噬的信號(hào)通路是自噬過(guò)程的重要微觀機(jī)制，通過(guò)對(duì)信號(hào)傳遞靶點(diǎn)蛋白的激活或抑制，可對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)。近期一項(xiàng)抑制BRD4（含溴域蛋白4）通過(guò)恢復(fù)受損的自噬通量對(duì)AP 具有保護(hù)作用的研究證實(shí)了自噬通量的調(diào)控對(duì)胰腺炎治療的可行性[58]。另一項(xiàng)利用蛙皮素誘導(dǎo)的大鼠模型顯示，苦參苷II可通過(guò)影響N F-κ B 依賴的自噬對(duì)胰腺炎重癥急性期的大鼠有保護(hù)作用，苦參II通過(guò)抑制NF-κB、TNF-α、SIRT1的表達(dá)和減少SIRT1-脫乙?；腖C3來(lái)降低SAP的自噬活動(dòng)[59]。自噬通量受損和自噬體在腺泡細(xì)胞中的積累介導(dǎo)了AP的兩個(gè)關(guān)鍵病理反應(yīng)：腺泡細(xì)胞空泡化和腺泡內(nèi)胰蛋白酶積累，提高或降低自噬通量，是影響胰腺炎病程發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。研究[60]運(yùn)用Resolvin D1（一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)）保護(hù)胰腺，通過(guò)恢復(fù)自噬通量來(lái)解決實(shí)驗(yàn)性AP的炎癥，Resolvin D1降低了自噬空泡的數(shù)量和自噬相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，使AP模型炎癥程度及炎癥細(xì)胞因子水平降低。同時(shí)有研究利用大黃素對(duì)大鼠AP模型中自噬反應(yīng)的影響，使自噬相關(guān)蛋白基因LC3B、beclin-1和p62的轉(zhuǎn)錄水平降低，自噬空泡的大小和數(shù)量均下降，AP的嚴(yán)重程度得到改善[61]。還有其他研究也證明了自噬通量調(diào)控對(duì)于減緩AP發(fā)展的作用。Piplani等[62]在AP小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了辛伐他汀通過(guò)提高自噬通量以防止胰腺細(xì)胞損傷。通過(guò)調(diào)控自噬通量來(lái)防止胰腺細(xì)胞損傷，進(jìn)而減緩AP的發(fā)展進(jìn)程。Wan等[63]通過(guò)小鼠模型探討AP發(fā)病后調(diào)節(jié)自噬的治療作用的研究中發(fā)現(xiàn)自噬的調(diào)節(jié)可以改變L-精氨酸或蛙皮素加LPS誘導(dǎo)的小鼠AP的進(jìn)展，這進(jìn)一步驗(yàn)證了調(diào)節(jié)自噬對(duì)治療胰腺炎的重要。最新的研究闡述了番茄紅素可通過(guò)防止胰腺腺泡細(xì)胞自噬受損減輕AP的嚴(yán)重程度[64]，番茄紅素通過(guò)自噬作用減弱胰腺炎病理的可能機(jī)制，為胰腺炎的新型治療提供了重要的見(jiàn)解。這些研究結(jié)果表明，自噬受損在AP的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，提高自噬效率可能對(duì)治療AP具有重要意義。

總之，AP的進(jìn)展可以通過(guò)調(diào)控自噬而阻斷，可能為臨床AP治療提供特異性的治療方案。正因?yàn)樽允韶灤〢P的始終，自噬的調(diào)節(jié)如自噬流通量的提高、阻斷異常自噬等可以緩解及縮短AP的進(jìn)程，對(duì)臨床預(yù)防和治療AP的進(jìn)展具有重要意義。

4 思考與展望

在精氨酸、蛙皮素等誘導(dǎo)的多種AP模型中，自噬功能存在明顯異常，因此，自噬可以視為多種因素導(dǎo)致胰腺損傷的的最終共同通路之一。從動(dòng)物模型多角度驗(yàn)證預(yù)防和治療AP，對(duì)傳統(tǒng)的胰腺炎胰蛋白酶中心理論提出了挑戰(zhàn)。在AP 的發(fā)病前，自噬流的異常和細(xì)胞內(nèi)多種機(jī)制的失調(diào)，參與了胰腺細(xì)胞的壞死及胰酶的細(xì)胞內(nèi)激活，腺泡細(xì)胞自噬損傷引起酶原顆粒堆積和AP。在胰酶激活與AP 之間，自噬異常是其中的重要一環(huán)，通過(guò)調(diào)控自噬可以讓胰腺炎小鼠模型的進(jìn)展得到改善，這充分證明了自噬對(duì)于治療胰腺炎的重要性。目前，自噬與胰酶異常激活的調(diào)節(jié)關(guān)系已成為AP研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，已有相關(guān)結(jié)果表明，自噬與氧化應(yīng)激、炎癥及免疫功能障礙等AP 其他發(fā)病機(jī)制間存在重要紐帶關(guān)系[65]。AP中自噬起到了重要的作用，例如信號(hào)傳遞靶點(diǎn)蛋白的激活、自噬流的阻斷，其中自噬流受阻是AP發(fā)展為SAP的重要病理機(jī)制。因此，需要對(duì)自噬分子機(jī)制及信號(hào)通路的進(jìn)一步理解，通過(guò)對(duì)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的調(diào)控來(lái)調(diào)控自噬流，延緩甚至逆轉(zhuǎn)AP的發(fā)展病程，為AP的高效診治提供更多思路。