張 偉，陳笑迎，吳金燦，賈曉鈺，王 鑫

（1.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院，河北 滄州 061100；2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300450）

黃曲霉毒素(AFT)是一類化學結(jié)構(gòu)類似的化合物，主要分子型包含B1，B2，M1，M2，G1，G2 等，是已知化學物質(zhì)中致癌、致畸、致突變最強的一類物質(zhì)[1-2]。黃曲霉毒素B1(AFB1)以毒性和致癌性最強作為黃曲霉毒素的代表物，污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油及其食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴重[3-4]。黃曲霉毒素B1 的急性毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍，慢性毒性可誘發(fā)癌變，致癌能力為二甲基亞硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900 倍[4]。

目前檢測食品和飼料中AFB1 含量的方法可以概括為三類：生物鑒定法、儀器分析法和免疫層析法[5]。生物鑒定法是通過生物體實驗來驗證樣品的毒性部位和毒性機理，為判斷AFB1 是否存在提供佐證。但生物鑒定法的專一性不強，靈敏度較低，一般只能作為化學分析方法的證實試驗。而且，此方法的費用較高，所需時間較長，也需要有特殊的操作技巧。儀器分析法多用薄層色譜法和高效液相色譜法來檢測AFB1[4]，測定結(jié)果準確，所以應用也比較廣泛，但缺點是所需的儀器設(shè)備多，操作繁瑣，所需時間長[5]。免疫層析法是一種固相標記免疫測定技術(shù)，其中以固定有檢測線和質(zhì)控線的條狀纖維層析材料（硝酸纖維素膜）為固定相，以測試液為流動相。原理是將標記抗體固定于硝酸纖維素（NC）膜上，檢測時利用毛細管作用，樣品沿膜向前移動，當移動至固定有標記抗體的區(qū)域時，樣品中相應的抗原與該抗體發(fā)生特異性反應，在檢測區(qū)域顯示一定的顏色[6-8]，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。免疫層析法獨有的特點是單份測定、方便快捷、特異性強、靈敏度高、結(jié)果準確，不需要大型儀器設(shè)備、幾分鐘內(nèi)就可以通過肉眼觀察到實驗結(jié)果，并且能夠保存，因此也越來越受到相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注[9-11]。

利用免疫層析技術(shù)競爭法的原理，在現(xiàn)有膠體金檢測卡的基礎(chǔ)上[12]，用一種新的材料膠體碳代替膠體金，建立一種簡便、快速、準確的免疫檢測方法，研究影響其性能的各個條件，使膠體碳試紙條更靈敏，更具有實用價值和經(jīng)濟意義。

1 材料與方法

1.1 材料

納米碳粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PVC 底板、結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、硝酸纖維膜：上海金標生物科技有限公司；吐溫-20：上海生工生物工程有限公司；黃曲霉毒素B1 牛血清白蛋白偶聯(lián)物：南京都英生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：美國sigma 公司分裝；羊抗鼠IgG、黃曲霉毒素B1 單克隆抗體：山東綠都生物科技有限公司。

1.2 設(shè)備及儀器

旋渦混合儀：上海一恒科學儀器有限公司；BIODOT 點膜噴金儀：上海西寶生物科技有限公司；電熱鼓風干燥箱：上海實研電爐有限公司；冷凍離心機：美國Thermo Electron；H-600 透射電鏡：日本日立公司；超聲儀器：上海生析超聲波儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1膠體碳的制備

利用粒徑為20 nm、30 nm 和50 nm 的碳粉分別制備濃度為0.02 g/L、0.05 g/L、0.10 g/L、0.20 g/L的膠體碳。方法：稱取相應質(zhì)量的碳粉溶解于超純水中，超聲至碳粉完全溶解，液體均勻。

1.3.2抗體的標記

需要確定加入的K2CO3和AFB1 單克隆抗體的最佳量。

AFB1 單克隆抗體的最佳標記量：試驗采用氯化鈉沉淀法確定AFB1 單克隆抗體的最佳標記量：分別取已準備好0.5 μg/mL 的AFB1 單克隆抗體0 μL、0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL 加入1 mL 膠體碳溶液中，3 h 后各加入0.1 mL 濃度為100 mg/mL氯化鈉溶液，混勻后靜置24 h。膠體碳容易發(fā)生沉聚，能保持膠體碳不發(fā)生沉聚的最小AFB1 單克隆抗體為最佳標記量[13-14]。

K2CO3最佳加入量的確定：取5 支離心管分別加1 mL 膠體碳，用1% 的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0[15]，再分別加入0 μL、1 μL、2 μL、3 μL、4 μL K2CO3溶液，最后加入AFB1 單克隆抗體的最佳量，碳標抗體經(jīng)濃縮在NC 膜上與抗原結(jié)合，通過膠體碳試紙條的出線情況來確定K2CO3的最佳用量。T線與C 線應都顯色，T 線顯色顏色比較深，C 線顯色顏色比較淺。

1.3.3標記抗體的純化

標記后的抗體以離心速度5 000 r/min，離心溫度4 ℃，離心時間30 min，進行低溫高速離心純化。離心后將管底可以流動的黑色沉淀轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，再加入400～500 μL 的重懸工作液，充分混合，使膠體碳顆粒分布均勻，具體加入量視沉淀情況而定。其中重懸工作液為1%海藻糖（蛋白保護劑）、0.5%BSA（穩(wěn)定劑）、0.1% 吐溫-20（表面活性劑）的磷酸緩沖（PBS）溶液。

1.3.4結(jié)合墊的水化、封閉處理及噴碳

結(jié)合墊材料選用Ahlstrom8964 玻璃纖維膜，使用前要進行水化、封閉處理，其目的是減少標記后的抗體在結(jié)合墊上的殘留。處理液為0.01 mol/L PBS緩沖液，內(nèi)含1%BSA 和5%蔗糖。首先選擇合適大小的結(jié)合墊條，然后放入結(jié)合墊處理液中充分浸濕，拿出，在37 ℃條件下的烘箱中干燥2 h，將重懸好的膠體碳用移液槍均勻地噴在處理好的結(jié)合墊上，使膠體碳能更好的吸附，再放入干燥箱中干燥約10 min 后拿出，觀察試紙條的出線結(jié)果。

1.3.5檢測線（T 線）抗原和質(zhì)控線（C 線）羊抗鼠IgG最佳包被濃度的選擇

T 線使用的抗原的黃曲霉毒素B1 牛血清白蛋白偶聯(lián)物（AFB1-BSA），用碳酸鹽緩沖（CBS）液將包被抗原稀釋5 個梯度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mg/mL；同樣用CBS 緩沖液將羊抗鼠IgG 分別做1:2、1:5、1:10、1:20、1:40 倍稀釋，用稀釋好的抗原和二抗在NC 膜上劃線，兩線相距5 mm，37 ℃干燥30 min，然后與處理好的膠體碳結(jié)合墊等材料組裝成試劑條，用PBS 溶液點樣，觀察顯色程度，C 線顏色不宜太深，否則檢測樣品時顯色不明顯，需產(chǎn)生足夠強的顯色信號同時不宜過淺，T 線選擇顯色較深的濃度，最后選擇顯色情況最好的濃度作為最佳包被濃度。

1.3.6試紙條的使用方法及結(jié)果判定

用滴管吸取待測樣品在試紙條的樣品墊處點樣，點樣量為2～3 滴，5～10 min 后觀察顯色情況。若是陰性結(jié)果（見圖1 中a），則在檢測區(qū)有兩條黑色條帶，T、C 線都顯色；若是陽性結(jié)果（見圖1 中b），則在檢測區(qū)域有一條黑色條帶，T 線不顯色，C 線顯色；若點樣后，C 線不顯色，結(jié)果都視為無效（見圖1中c）。

圖1 反應結(jié)果顯示與判斷示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體碳粒徑對試紙條的影響

通過觀察膠體碳溶液的顏色和均勻度。良好的膠體碳溶液應該整體均勻，顏色為黑色或者較黑色稍淺，且在室溫下放置幾天后顏色、均勻度基本不變。若制備的膠體碳放置幾天后底部出現(xiàn)沉淀，上層澄清或有漂浮物，表明制備的膠體碳不成功。由透射電鏡圖（圖2）看出相同濃度的20、30、50 nm 的膠體碳粒徑逐漸增大，粒徑為50 nm 的膠體碳容易聚集在一起，所以在放置幾天后易形成沉淀。而20、30 nm 的膠體碳相比較而言，30 nm 的分布更均勻，顯示膠體碳顆粒的外部形態(tài)比較規(guī)則，大部分顆粒呈現(xiàn)均勻分散的圓形，有利于結(jié)合抗體的形成，同時有助于自身以及碳標抗體的穩(wěn)定。

圖2 不同粒徑膠體碳的透射電鏡圖

2.2 AFB1 單克隆抗體最佳標記量的確定

根據(jù)氯化鈉沉淀法，加入1.00 μL、0.50 μg/mL的AFB1 單克隆抗體時膠體碳溶液沒有發(fā)生聚沉，而加入0 和0.50 μL 蛋白的膠體碳底部都產(chǎn)生了沉淀。在1.00 μL 的基礎(chǔ)上再加10%，即1.10 μL 為最佳蛋白標記量。

2.3 K2CO3 最佳加入量的確定

膠體碳在加入相同濃度不同量的K2CO3溶液后，基本無變化。而碳標抗體經(jīng)濃縮在NC 膜上與抗原結(jié)合后，結(jié)果顯示加入1.0 μL K2CO3制成的AFB1 膠體碳試紙條顯色最好（見圖3）。

圖3 碳酸鉀最佳加入量的確定

2.4 T 線抗原和C 線羊抗鼠IgG 最佳包被濃度的選擇

通過將稀釋好的抗原和二抗與其它材料制成的試紙條的顯色情況（見圖4），可以看出，C 線顯色情況最好的是3 號試紙條，即最佳二抗稀釋倍數(shù)為1:10。對于T 線，1、2、3 號顯色情況相差不多，相比之下，3 號檢測線略微深一些，所以最佳抗原濃度為0.20 mg/mL。

圖4 T 線抗原和C 線二抗最佳包被量的確定

3 試紙條的性能測試

3.1 性能測試實驗

3.1.1靈敏度試驗

采用梯度稀釋的方法來檢測靈敏度，用含AFB1 的競爭品質(zhì)量濃度為1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL 的陰性PBS 點樣于同一批試紙條，觀察顯色結(jié)果。

如圖5 所示，ABF1 濃度2 ng/mL 時，T 線條帶顏色很淺但沒有完全消失，而ABF1 濃度為3 ng/mL時，肉眼觀察T 線不顯色C 線顯色，所以該試紙條的檢測限為3 ng/mL。為證明結(jié)果準確性，另外再做兩批次試紙條和同樣的梯度稀釋，得到的結(jié)果相同。

圖5 試紙條靈敏度測試結(jié)果

3.1.2特異性試驗

試紙條的特異性通過檢測AFB1 的結(jié)構(gòu)類似物AFB2、AFG1、AFG2、AFM1 及赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素來確定，檢測3 次不同批次的試紙條。反應結(jié)果如圖6 所示，與對照試紙條比較，可以發(fā)現(xiàn)試紙條檢測AFG1、AFG2 的結(jié)果為陽性，而檢測其它毒素結(jié)果都為陰性。所以結(jié)果說明該試紙條對黃曲霉毒素有良好的特異性[12]。

圖6 試紙條特異性測試結(jié)果

3.1.3重復性試驗

隨機抽取20 條試紙條做陰性實驗，結(jié)果顯示C線均顯示出黑色且顏色深度幾乎無差別；但是有2條試紙條的T 線黑色較淺，其余18 條試紙條T 線顯示出深黑色。再隨機抽取20 條試紙條做陽性實驗，結(jié)果顯示T 線均不顯現(xiàn)；C 線均顯現(xiàn)黑色且顏色深度基本一致。由此可以判斷試紙條的重復性為98%。

3.1.4穩(wěn)定性試驗

將試紙條分別放在4 ℃、室溫37 ℃的條件下保存，一段時間后做陽性檢測和陰性檢測。為保證結(jié)果的準確性，所以要檢測3 批試紙條。從陽性檢測和陰性檢測的結(jié)果來看，4 ℃、室溫條件下保存一個月，37 ℃條件下保存7 天，試紙條均有效，但在37 ℃下保存長時間的試紙條條帶顏色變淺。通常試紙條在37 ℃下保存1 d 相當于4 ℃下保存1.5 個月[13]。據(jù)此推算該試紙條在4 ℃下保存期至少為10 個月。

3.2 樣本添加試驗

對花生油進行AFB1 添加實驗，添加濃度為0 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、5 ng/mL，添 加AFB1 后的樣品分別用競爭ELISA 法和膠體碳試紙條進行檢測。比較兩種方法的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA法中除空白對照組為陰性外，添加組都為陽性。而使用試紙條檢測時，添加濃度低于2 ng/mL 時為陰性；但添加量為2 ng/mL 時，T 線黑色較淺；當添加的濃度≥3 ng/mL 時，結(jié)果為陽性，試紙條的檢測限雖不及ELISA，但足以檢測AFB1 是否超標。

4 結(jié)論

使用現(xiàn)有的不同粒徑的納米碳粉制成不同濃度的膠體碳溶液，膠體碳標記AFB1 單克隆抗體經(jīng)純化后吸附于玻璃纖維素膜上，將T 線和C 線在NC膜上劃好，干燥后與處理好的樣品墊、有碳標抗體的結(jié)合墊、吸水紙組裝成試紙條。

在進行試紙條的工藝優(yōu)化時，發(fā)現(xiàn)膠體碳的最佳粒徑為30 nm、最適濃度為0.20 g/L，0.1 mol/L 的碳酸鉀溶液最佳用量為1.00 μL，濃度0.50 μg/mL的AFB1 單克隆抗體的最佳標記量為1.10 μL，檢測線包被抗原最佳濃度0.20 mg/mL，質(zhì)控線羊抗鼠IgG 稀釋倍數(shù)為1:10，比較適合用于AFB1 膠體碳試紙條的制備。

通過檢測AFB1 膠體碳免疫層析試紙條的各種性能，結(jié)果表明該試紙條的靈敏度為3 ng/mL，該試紙條對黃曲霉毒素有較好的特異性；在重復性試驗中，重復性高達98%且沒有出現(xiàn)假陰性的情況，在4℃條件下可保存至少10 個月。通過AFB1 膠體碳試紙條和ELISA 兩種方法對樣品進行加標試驗可以發(fā)現(xiàn)，膠體碳試紙條的靈敏度不及ELISA，所以這也是免疫層析技術(shù)所要突破的問題。

本課題研究了AFB1 膠體碳試紙條的研制方法，包括試紙條的原料選擇、試紙條的組裝、條件優(yōu)化、性能測試等一系列步驟。得到一條比較合適AFB1 膠體碳試紙條的制備途徑。并且制得的AFB1膠體碳試紙條可以快速準確的判斷出食品中的AFB1 是否符合標準規(guī)定，具有很高的應用價值。