江蘭，趙江林，*，何小慧，吳志偉，周敏，林永翅，趙鋼

（1.成都大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106；2.西昌市正中食品有限公司，四川西昌615000）

苦蕎[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn]是一種著名的特色雜糧作物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)（9.3%～11.7%）、脂肪（1.7%～2.6%）、淀粉（71.6%～72.6%）等營(yíng)養(yǎng)成分，并且含其他禾谷類作物所沒有的生物黃酮類功能成分[1-3]。近年來，隨著人們生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，苦蕎加工制品越來越深受消費(fèi)者的青睞，其市場(chǎng)前景廣闊，開發(fā)潛力巨大[4]。黃酮類物質(zhì)是植物中一類具有重要生理活性的次生代謝物，與植物防御反應(yīng)密切相關(guān)，具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、降血糖和降血壓等多種生理活性[5-12]。因此，提高苦蕎中黃酮類化合物的含量具有重要意義。

眾多研究表明，在適宜條件下，生物誘導(dǎo)子可促進(jìn)酚酸類、黃酮類、萜類、生物堿，以及皂甙類等化合物的合成，其被認(rèn)為是提高植物次生代謝物含量的有效途徑，已被廣泛應(yīng)用于提高植物次生代謝物合成積累的研究中[13-14]。劉冉等[15]研究發(fā)現(xiàn)100 mg/L殼聚糖溶液能提高紅松幼苗中多酚物質(zhì)含量；金海紅等[16]認(rèn)為酵母細(xì)胞壁多糖能促進(jìn)杭白菊中黃酮類物質(zhì)的合成積累；張國(guó)利等[17]研究發(fā)現(xiàn)3種真菌多糖誘導(dǎo)子均能促進(jìn)桑黃胞內(nèi)黃酮類成分的積累。海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取的一種天然多糖，海藻酸鈉及其水解物對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育與次生代謝物的合成積累具有一定調(diào)節(jié)作用[18-22]。目前，尚未見關(guān)于海藻酸鈉誘導(dǎo)苦蕎黃酮類物質(zhì)合成積累的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選用不同濃度的海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎種子進(jìn)行誘導(dǎo)處理，著重研究海藻酸鈉對(duì)苦蕎芽黃酮類物質(zhì)合成積累的影響規(guī)律，為提高苦蕎芽品質(zhì)提供一種新的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蕎1號(hào)：由成都大學(xué)-農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

海藻酸鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；蘆?。核拇ㄊ【S克奇生物科技有限公司；槲皮素：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無水甲醇、氯化鈉、冰乙酸、三氯化鋁、乙酸鉀（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；RXZ-300B人工氣候箱：寧波東南儀器有限公司；ESJ210-4B電子分析天平：龍騰電子有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；島津LC-20A型高效液相色譜：日本Shimadzu；Biotek Synerey HTX多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；H2050R冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DGG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海藻酸鈉溶液誘導(dǎo)處理及萌發(fā)方法

采用胚根生長(zhǎng)抑制法[23]，選取大小均一、黑色飽滿健康的苦蕎籽粒（西蕎1號(hào)），經(jīng)清洗、消毒、晾干，置于等量不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、300、400 μg/mL）的海藻酸鈉溶液中浸泡12 h，以去離子水為對(duì)照組。將浸泡后的苦蕎籽粒置于鋪有2層紗布1層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于70%～75%濕度人工氣候箱中25℃恒溫培養(yǎng)（12 h光照，12 h黑暗）。待培養(yǎng)至10 d后收獲，測(cè)定其發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮重、干重，并將收獲的苦蕎芽烘干至恒重，打粉，冷凍保存于-20℃冰箱，待分析測(cè)定。每個(gè)處理做3次重復(fù)。

發(fā)芽率/%=（第10天種子總發(fā)芽數(shù)/試驗(yàn)總種子數(shù)）×100

1.2.2 海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽黃酮含量的測(cè)定

稱取苦蕎芽粉末50 mg，加入5 mL、70%的甲醇，40℃超聲處理30 min，過濾，收集上清液作為樣品提取液備用。

1）采用三氯化鋁比色法[24]在420 nm下測(cè)定樣品提取液的總黃酮含量。以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系曲線的回歸方程：Y=18.576 X-0.001，R2=0.999 6。根據(jù)回歸方程計(jì)算苦蕎芽提取物中的總黃酮含量。

2）參考王靜波等[25]的試驗(yàn)方法，采用反向高效液相色譜法測(cè)定苦蕎芽中蘆丁和槲皮素的含量。色譜條件為色譜柱：Diamonsil-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為A：1%冰乙酸溶液，B：純甲醇；洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫35℃。分別以蘆丁和槲皮素溶液濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系曲線：Y=21 583 389.282 4X+288 644.574 9，R2=0.994 1；得到槲皮素質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系曲線：Y=10 208 431.250 0X+195 254.400 0，R2=0.998 7。根據(jù)各物質(zhì)的回歸方程，即得各樣品的蘆丁和槲皮素的濃度。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS19.0和Microsoft Office Excel 2010等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎種子發(fā)芽率的影響

圖1為不同濃度海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎發(fā)芽率的影響。

圖1 不同濃度海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of sodium alginate at different concentrations on the seed germination rate of tartary buckwheat

由圖1可知，在一定供試濃度（50μg/mL～200μg/mL）范圍內(nèi)，與空白對(duì)照組相比，隨著海藻酸鈉溶液濃度的增加，苦蕎種子的發(fā)芽率呈逐漸增加趨勢(shì)。在其供試濃度為200 μg/mL時(shí)，苦蕎種子的發(fā)芽率達(dá)到最大值91.33%，為對(duì)照組80.00%的1.14倍。當(dāng)海藻酸鈉溶液的處理濃度進(jìn)一步增大時(shí)（300μg/mL和400μg/mL），苦蕎種子的發(fā)芽率略呈下降趨勢(shì)，其主要原因可能為在適宜濃度范圍內(nèi)，海藻酸鈉溶液能有效誘導(dǎo)苦蕎種子內(nèi)α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的合成，進(jìn)而促進(jìn)苦蕎種子的萌發(fā)；當(dāng)采用更高濃度的海藻酸鈉溶液進(jìn)行誘導(dǎo)處理時(shí)，其對(duì)苦蕎種子內(nèi)相關(guān)水解酶無明顯增強(qiáng)活性，甚至還具有一定的抑制作用。這與他人報(bào)道的關(guān)于海藻酸鈉溶液對(duì)玉米和水稻種子的萌發(fā)生長(zhǎng)誘導(dǎo)效應(yīng)基本一致[26]。

2.2 海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽生長(zhǎng)的影響

圖2和圖3分別描述了海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和生物量（鮮重、干重）的影響。

結(jié)果表明，經(jīng)海藻酸鈉溶液誘導(dǎo)處理后，苦蕎芽的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)均比對(duì)照組有所提高，苦蕎芽的根長(zhǎng)介于5.06 cm～6.05 cm之間，芽長(zhǎng)介于3.38 cm～4.00 cm之間。對(duì)于苦蕎芽的生物量而言，苦蕎芽的生物量隨著海藻酸鈉溶液濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在200 μg/mL濃度處理下能顯著提高苦蕎芽的鮮重和干重，分別為6.30 g/100株和0.91 g/100株，為對(duì)照組的1.34倍（4.70 g/100株）和1.10倍（0.83 g/100株）。相關(guān)研究表明，低濃度的海藻酸鈉溶液能提高大豆、玉米、水稻的株高和生物量，而高濃度的海藻酸鈉溶液對(duì)其生長(zhǎng)則呈現(xiàn)出一定的抑制作用，其主要原因可能是適宜濃度的誘導(dǎo)子能改善幼苗的光合作用性能，能提高植物產(chǎn)物的積累量；當(dāng)誘導(dǎo)子濃度較高時(shí)會(huì)誘導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)而造成細(xì)胞生長(zhǎng)受阻[26-29]。

圖2 不同濃度海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different sodium alginate concentrations on the root and bud length of tartary buckwheat sprout

圖3 不同濃度海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽生物量的影響Fig.3 Effects of sodium alginate at different concentrations on the sprout biomass of tartary buckwheat

2.3 海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽總黃酮含量的影響

圖4為不同濃度海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽總黃酮合成積累的影響。

圖4 不同濃度海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of sodium alginate at different concentrations on the total flavonoid content of tartary buckwheat sprouts

由圖4可知，海藻酸鈉溶液能顯著提高苦蕎芽總黃酮的含量，且與其供試濃度緊密相關(guān)。在供試濃度200 μg/mL～300 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，苦蕎芽總黃酮含量增加最為明顯。其中，當(dāng)供試濃度為200 μg/mL時(shí)，苦蕎芽總黃酮含量達(dá)到最大值54.69 mg/g，為對(duì)照組49.38 mg/g的1.12倍。隨著海藻酸鈉溶液處理濃度的進(jìn)一步增大（400 μg/mL），這種促進(jìn)苦蕎芽黃酮類成分積累的誘導(dǎo)效應(yīng)有所減弱。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因一方面可能是苦蕎芽中積累的代謝物反饋抑制了該合成途徑的關(guān)鍵酶——苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL），使合成受阻；另一方面也可能是由于產(chǎn)生的其他代謝物與海藻酸鈉共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合植物細(xì)胞位點(diǎn)，使得誘導(dǎo)信號(hào)不被識(shí)別或傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致海藻酸鈉溶液的誘導(dǎo)作用減弱[18，30-31]。

2.4 海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽蘆丁和槲皮素的影響

蘆丁、槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)品及苦蕎芽提取物樣品的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）圖分別如圖 5（A）和圖 5（B）所示。

圖5 蘆丁、槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)品及苦蕎芽提取物的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC analysis profiles of the mixture of rutin and quercetin（standards）and the extraction of tartary buckwheat sprouts

在該分析條件下，苦蕎芽樣品中的2種主要黃酮類成分（蘆丁和槲皮素）的分離效果較好。經(jīng)海藻酸鈉溶液誘導(dǎo)處理后，苦蕎芽中蘆丁和槲皮素的含量得以明顯提升。

海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽蘆丁及槲皮素含量的影響見圖6。

圖6 海藻酸鈉溶液對(duì)苦蕎芽蘆丁及槲皮素含量的影響Fig.6 Effects of sodium alginate solutions on the rutin and quercetin content of tartary buckwheat sprouts

由圖6可以看出，在供試濃度（50 μg/mL～400 μg/mL）范圍內(nèi)，苦蕎芽中蘆丁和槲皮素的含量均較對(duì)照組有所增加。其中，在供試濃度為200 μg/mL時(shí)，苦蕎芽中的蘆丁及槲皮素含量達(dá)到最大值，分別為43.77 mg/g和5.28 mg/g，是對(duì)照組中蘆丁含量（39.45 mg/g）的1.11倍和槲皮素含量（3.25 mg/g）的1.62倍。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在適宜濃度海藻酸鈉溶液（50 μg/mL ～200 μg/mL）的誘導(dǎo)作用下，苦蕎種子的發(fā)芽率、生物量及黃酮類物質(zhì)的含量均較對(duì)照組有所增加，但隨著海藻酸鈉溶液濃度的進(jìn)一步增加，苦蕎芽的生長(zhǎng)受到一定抑制，黃酮類物質(zhì)的含量也有所降低。

通過試驗(yàn)得出：1）海藻酸鈉溶液有助于提高苦蕎種子發(fā)芽率、生物量及黃酮類物質(zhì)的合成積累。2）海藻酸鈉溶液的最佳誘導(dǎo)濃度為200 μg/mL。在該處理?xiàng)l件下，苦蕎種子的發(fā)芽率為對(duì)照組的1.14倍、鮮重為對(duì)照組的1.34倍、干重是對(duì)照組的1.14倍、總黃酮含量比對(duì)照組提高10.75%、蘆丁含量較對(duì)照組提高10.95%、槲皮素含量比對(duì)照組提高62.46%。本研究為促進(jìn)苦蕎種子萌發(fā)生長(zhǎng)、黃酮類物質(zhì)的合成積累，以及高品質(zhì)苦蕎芽的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。