房彬,張竹君,李少鵬,夏婷
(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457)
碳點(diǎn) (carbon dots,CDs)是一類(lèi)粒徑小于10 nm,由C、H、O等元素構(gòu)成的新型熒光納米顆粒。2004年,這種熒光碳納米顆粒在單壁碳納米管的合成中被首次發(fā)現(xiàn)[1]。與傳統(tǒng)的量子點(diǎn)相比,碳點(diǎn)不僅具有紫外-可見(jiàn)光吸收、光致發(fā)光、上轉(zhuǎn)換熒光等優(yōu)質(zhì)的光學(xué)特性,還具有高生物相容性、抗光漂白、化學(xué)惰性和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),其在傳感器、細(xì)胞成像、藥物傳送等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[2-3],不斷地受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,成為熒光納米材料研究的熱點(diǎn)。隨著可持續(xù)發(fā)展、綠色合成理念的不斷實(shí)施,制備碳點(diǎn)所需的原料選擇不再局限于檸檬酸、葡萄糖等小分子物質(zhì)和炭黑、石墨等碳質(zhì)材料,越來(lái)越多的食品來(lái)源的物質(zhì)也被應(yīng)用其中。食品來(lái)源的物質(zhì)不僅富含葡萄糖、纖維素、多糖等有機(jī)分子,還含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等含氮、硫元素的天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可以在無(wú)額外表面修飾的情況下提高碳點(diǎn)的熒光產(chǎn)率。另外,以食品制備形成的碳點(diǎn)還具有更高的生物相容性、低細(xì)胞毒性和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),在生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本文就食品來(lái)源碳點(diǎn)的合成特性及其生物應(yīng)用進(jìn)行綜述。
研究發(fā)現(xiàn)可以利用任何含碳材料制備碳點(diǎn),因此合成碳點(diǎn)的原料具有廣泛的選擇性[4]。果蔬、動(dòng)物、加工食品及其廢棄物中均含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,這些物質(zhì)不僅可以為碳點(diǎn)的合成提供天然的碳源,而且所富含的氨基也可以填補(bǔ)碳點(diǎn)表面缺失,從而提高碳點(diǎn)量子產(chǎn)率(quantum yield,QY)。另外,食品來(lái)源的物質(zhì)還具有環(huán)境相融性高、毒性低、成本低、易獲取、可再生等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前食品來(lái)源的碳點(diǎn)主要通過(guò)自下而上法制備,主要包括水熱合成法、微波輻射法、熱分解法等。水熱合成法是制備食品源碳點(diǎn)最常用的方法,一般將原料與水等溶劑混合、密封在高壓反應(yīng)釜內(nèi),在高溫高壓條件下進(jìn)行反應(yīng),再經(jīng)純化等步驟得到熒光碳點(diǎn)[6]。微波合成法是一種省時(shí)、高效、直接的碳點(diǎn)制備方法,可以在短時(shí)間內(nèi)碳化合成前體物,但可能會(huì)造成碳點(diǎn)粒徑大小不夠均一[5,7]。而熱解法是將天然產(chǎn)物高溫加熱形成碳化物質(zhì),并從中分離和提純得到熒光碳點(diǎn)顆粒[8]。除此之外,還有化學(xué)氧化法、萃取法和分子聚集法等用于食品來(lái)源碳點(diǎn)的合成。以下將對(duì)不同食品來(lái)源的碳點(diǎn)合成特性分類(lèi)介紹,詳見(jiàn)表1。
表1 不同食品來(lái)源的碳點(diǎn)合成Table 1 Synthesis of carbon dots from different food sources
蔬菜水果不僅為人體健康提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)也可為碳點(diǎn)合成提供前體物,例如:卷心菜、蘑菇、番茄、橙子等。制備果蔬來(lái)源碳點(diǎn)最常用的方法是水熱合成法。Chaudhary等[9]以香蕉為唯一原料,采用水熱合成法在150℃反應(yīng)4 h合成碳點(diǎn)顆粒,其粒徑分布在0.5 nm~2.5 nm范圍內(nèi),QY為32%,可在紫外線照射下發(fā)出藍(lán)色熒光。紫外-可見(jiàn)吸收光譜(ultraviolet visible,UV-vis)顯示,該碳點(diǎn)產(chǎn)生兩個(gè)明顯的吸收峰,分別在284 nm和330 nm處,對(duì)應(yīng)于C=O的n-π*躍遷和C=C的π-π*躍遷。除水熱合成法外,微波輻射法也可用于制備果蔬來(lái)源的熒光碳點(diǎn)。Gu等[10]以蓮藕為碳源合成天然氮摻雜的熒光碳點(diǎn),其可在365 nm激發(fā)光照射下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,平均粒徑約為9.41 nm,QY高達(dá)19%。傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,F(xiàn)T-IR)和 X射線光譜(X-ray photoelectron spectrometer,XPS)顯示,該碳點(diǎn)主要由C、N、O 3種元素組成,其相對(duì)含量分別為61.81%、5.23%和32.96%,表面含有-COOH、-OH和-NH2等基團(tuán)。
動(dòng)物及其衍生物中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等天然物質(zhì),是人類(lèi)生活中不可或缺的天然產(chǎn)物之一。制備動(dòng)物來(lái)源碳點(diǎn)常用的方法是水熱合成法、熱解法和微波合成法。Zhao等[11]以新鮮豬肉為碳源,通過(guò)水熱合成法制備形成一種發(fā)藍(lán)色熒光的碳點(diǎn)顆粒,平均粒徑約為3.5 nm,QY為17.3%。熒光光譜顯示隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加,發(fā)射峰出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象,結(jié)果表明該碳點(diǎn)具有激發(fā)依賴(lài)性的光致發(fā)光特性。Wang等[12]以雞蛋的蛋清和蛋黃為原料,通過(guò)等離子體誘導(dǎo)的熱解法合成兩種熒光碳點(diǎn),分別為CDpew和CDpey。兩種碳點(diǎn)在紫外線照射下均發(fā)藍(lán)色熒光,CDpew其平均粒徑為3.39 nm,QY約為6%;CDpey其平均粒徑約為2.15 nm,QY約為8%。UV-vis光譜顯示,兩種碳點(diǎn)在275 nm處均表現(xiàn)出明顯的吸收。此外,熒光光譜顯示在360 nm的激光激發(fā)下,兩種碳點(diǎn)在420 nm處均熒光強(qiáng)度最高。綜合以上研究表明,與果蔬來(lái)源的碳點(diǎn)合成相比,以動(dòng)物為原料合成的熒光碳點(diǎn)數(shù)量較少。
許多加工食物也可以作為合成碳點(diǎn)的天然前體物,例如牛奶、咖啡、啤酒、豆?jié){等。Wang等[13]通過(guò)水熱合成法制備牛奶來(lái)源的碳點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得碳點(diǎn)在紫外線照射下發(fā)藍(lán)綠色熒光,粒徑分布范圍為2 nm~4 nm,QY約為12%。通過(guò)FT-IR和XPS分析,碳點(diǎn)表面具有羧基、羥基等多個(gè)官能團(tuán)和少量含氮基團(tuán),可能是牛奶在水熱處理過(guò)程中降解所形成。隨著碳點(diǎn)前體物的深入研究,研究人員發(fā)現(xiàn)在食物制作和高溫烘焙過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生熒光碳點(diǎn)。常用萃取法對(duì)食物自身或者加工過(guò)程中產(chǎn)生的熒光碳點(diǎn)進(jìn)行提取。該方法先將碳點(diǎn)溶解于有機(jī)溶劑中,再使用萃取劑或者凝膠層進(jìn)行分離純化,最后得到純化的碳點(diǎn)顆粒[5]。Wang等[14]通過(guò)萃取法從青島啤酒中提取出了一種藍(lán)色熒光碳點(diǎn)。研究結(jié)果顯示,該碳點(diǎn)粒徑約為2.5nm,QY約為7.39%。從透射電鏡圖(transmission electron microscopy,TEM)中可以觀察到碳點(diǎn)內(nèi)有間距為0.302 nm的晶格條紋。
一些食物廢棄物例如:絲瓜皮、咖啡豆殼、雞蛋殼等,也可作為綠色合成碳點(diǎn)的優(yōu)秀前體物。該合成碳點(diǎn)的來(lái)源不僅材料易得、投入資金少、經(jīng)濟(jì)成本低,而且還能減少環(huán)境的污染,綠色環(huán)保[15]?;瘜W(xué)氧化法也是制備食品源碳點(diǎn)的方法之一。該方法先將天然產(chǎn)物進(jìn)行碳化,再添加氧化劑對(duì)其氧化處理,最后分離、純化得到純凈的碳點(diǎn)[5,8]。Jiao等[16]以芒果皮為碳源通過(guò)化學(xué)氧化法合成一種粒徑約為3 nm,QY約為8.5%的藍(lán)色熒光碳點(diǎn)。FT-IR光譜顯示,碳點(diǎn)表面含有O-H、NH、C-H、C-N、C-O、C-S等化學(xué)鍵,證明其表面存在大量的羧基、羰基、氨基等官能團(tuán)。近期研究發(fā)現(xiàn)利用分子聚集法制備碳點(diǎn)時(shí),不需要外界能量輸入或者使用復(fù)雜的裝置,可以有效地避免破壞天然產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),為綠色環(huán)保合成碳點(diǎn)提供了新策略[5]。Wang等[17]以咖啡豆外殼為原料通過(guò)分子聚集法合成一種發(fā)藍(lán)色熒光的碳點(diǎn)顆粒,其粒徑分布在1 nm~5 nm范圍內(nèi)。通過(guò)該方法制備咖啡豆外殼來(lái)源的碳點(diǎn)可以有效的保護(hù)其中酚類(lèi)化合物較強(qiáng)的抗氧化能力。根據(jù)DPPH法測(cè)定碳點(diǎn)的抗氧化能力,當(dāng)碳點(diǎn)的濃度為0.16 mg/mL時(shí),其清除自由基的能力可以達(dá)到85%。結(jié)果表明通過(guò)該方法制備的碳點(diǎn)可以有效地保護(hù)其中酚類(lèi)化合物的抗氧化能力。
食品來(lái)源的碳點(diǎn)因其優(yōu)良的光學(xué)特性、耐光漂白性、高水溶性、低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ臒晒饧{米材料。目前文獻(xiàn)報(bào)道其在離子檢測(cè)、生物傳感器、生物成像、藥物運(yùn)輸、熒光繪圖等領(lǐng)域均有應(yīng)用[14,29-31]。以下主要介紹食品來(lái)源碳點(diǎn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。
2.1.1 在生物、醫(yī)學(xué)檢測(cè)上的應(yīng)用
目前,在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中對(duì)氨基酸、酶、蛋白質(zhì)等分子檢測(cè)常用免疫法、化學(xué)法、儀器測(cè)定法等方法。這些傳統(tǒng)方法雖已應(yīng)用于臨床,但其還是存在耗時(shí)較長(zhǎng)、儀器復(fù)雜等缺陷[8]。以食品為原料合成的熒光碳點(diǎn)其表面含有羥基、羧基、氨基等官能團(tuán),可作為生物傳感器的熒光探針對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)。該方法不僅檢測(cè)效果顯著,而且資金投入少,具有較強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿?。Lu等[18]利用西瓜汁制備碳點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)該碳點(diǎn)表面的羥基、胺基和羧基基團(tuán)與Fe3+之間發(fā)生強(qiáng)配位相互作用破壞輻射躍遷,從而使熒光猝滅;而在CDs/Fe3+體系中加入半胱氨酸后,導(dǎo)致了Fe3+離子從碳點(diǎn)表面分離,從而使熒光得以恢復(fù),表現(xiàn)出“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”熒光變化的特性。根據(jù)該特性對(duì)半胱氨酸進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示其線性范圍為 0~250 μmol/L,最低檢出限為 0.27 μmol/L。研究表明西瓜汁來(lái)源碳點(diǎn)的熒光傳感器可用于半胱氨酸的檢測(cè)。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)蘑菇來(lái)源的碳點(diǎn)與HA和HAase之間表現(xiàn)出“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”熒光變化。依據(jù)該變化對(duì)溶液中的HA和HAase進(jìn)行檢測(cè),HA的檢測(cè)范圍為 50 pmol/L~50 μmol/L,最低限為 0.03 nmol/L;HAase的檢測(cè)范圍為0.2 U/mL~10 000 U/mL,最低限為0.1 U/mL。此外,該方法還可以用于人類(lèi)尿液中HAase的檢測(cè),結(jié)果顯示其回收率在97.7%~105.0%,尿液中的其他成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響。研究表明該方法能夠?qū)Aase進(jìn)行特異、靈敏地檢測(cè)。因此,食品來(lái)源的碳點(diǎn)不僅獲取方便、成本低廉,而且可作為一種熒光探針對(duì)人體中的生物指標(biāo)進(jìn)行靈敏高效地檢測(cè),具有很好的應(yīng)用前景。
2.1.2 在食品添加劑檢測(cè)上的應(yīng)用
食品添加劑會(huì)使食物變得更加可口、美味,但其含量超標(biāo)也會(huì)對(duì)人體健康造成一定危害。Hang等[32]發(fā)現(xiàn)甘蔗蜜糖來(lái)源的碳點(diǎn)可與食品添加劑日落黃發(fā)生靜電作用,從而引起熒光猝滅。以該碳點(diǎn)為熒光探針,對(duì)食品中日落黃添加劑進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示其檢測(cè)范圍為 0~60 μmol/L,檢測(cè)限為 0.399 μmol/L。研究表明基于該碳點(diǎn)的熒光傳感器可對(duì)食品中的日落黃進(jìn)行高效檢測(cè)。S.Monte-Filho等[33]利用檸檬汁和洋蔥汁制備碳點(diǎn),發(fā)現(xiàn)該碳點(diǎn)可與核黃素之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,從而引起碳點(diǎn)的熒光猝滅。利用該猝滅現(xiàn)象,以碳點(diǎn)為熒光探針,對(duì)復(fù)合維生素/礦物質(zhì)補(bǔ)充劑中核黃素進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示其檢測(cè)范圍為0.10 mg/mL~3.0 mg/mL,最低檢測(cè)下限為1.0 ng/mL。此外,對(duì)3種不同品牌的營(yíng)養(yǎng)劑中核黃素進(jìn)行檢測(cè),其回收率在96.0%~101.4%。研究表明檸檬汁和洋蔥汁來(lái)源的碳點(diǎn)可作為熒光探針用于核黃素的測(cè)定。
在生物成像領(lǐng)域,利用有機(jī)染料對(duì)組織切片進(jìn)行染色是最常用的方法,但有機(jī)染料的劇毒性限制了其在細(xì)胞成像及體內(nèi)成像方面的應(yīng)用[34]。碳點(diǎn)具有穩(wěn)定的光學(xué)特性、高細(xì)胞相容性、低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)食品來(lái)源的碳點(diǎn)粒徑相對(duì)較小,更易于通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞從而進(jìn)行熒光成像。這些優(yōu)點(diǎn)使食品來(lái)源的碳點(diǎn)應(yīng)用于生物成像方面成為可能。
Kasibabu等[35]利用石榴為前體合成一種粒徑約為3.5 nm的熒光碳點(diǎn),并以其為探針利用激光共聚焦細(xì)胞成像儀對(duì)銅綠假單胞菌和燕麥鐮刀菌進(jìn)行成像。結(jié)果顯示該碳點(diǎn)被細(xì)胞所攝取,在405 nm和458 nm的激光激發(fā)下,銅綠假單胞菌細(xì)胞和燕麥鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)分別發(fā)出綠色和紅色熒光。Niu等[36]發(fā)現(xiàn)小白菜來(lái)源的碳點(diǎn)其粒徑約為1.8 nm,且具有較低的細(xì)胞毒性,Hela細(xì)胞在不同濃度(0~2 000 μg/mL)的碳點(diǎn)溶液中培養(yǎng)24 h后細(xì)胞活性保持95%以上。以該碳點(diǎn)為熒光探針,對(duì)大腸桿菌和Hela細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦細(xì)胞成像。結(jié)果顯示在405 nm和488 nm激發(fā)下,碳點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并分別發(fā)出藍(lán)色和綠色熒光。Shen等[37]合成了一種甘薯來(lái)源的熒光碳點(diǎn),并以其為探針利用激光共聚焦細(xì)胞成像儀對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞進(jìn)行成像。兩種細(xì)胞在紫外光(330 nm~388 nm)、藍(lán)光(450 nm~480 nm)和綠光(510 nm~550 nm)激發(fā)下細(xì)胞分別發(fā)出藍(lán)色、綠色和紅色熒光。
目前利用碳點(diǎn)進(jìn)行體外成像的研究較多,除此之外,也有學(xué)者對(duì)碳點(diǎn)的體內(nèi)成像進(jìn)行了研究。Zhang等[17]以咖啡豆外殼來(lái)源的碳點(diǎn)為熒光探針對(duì)用宮頸癌小鼠進(jìn)行動(dòng)物活體成像。結(jié)果顯示注射碳點(diǎn)2 h后即可在腫瘤部位觀察到明顯的熒光信號(hào);24 h后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)多集中在腫瘤和肝臟,其他部位不受影響。此外,宮頸癌小鼠在注射碳點(diǎn)6 d后仍然存活,進(jìn)一步地證明該碳點(diǎn)能夠安全地用于體內(nèi)成像。綜合以上研究提示食品來(lái)源的熒光碳點(diǎn)可安全、有效地應(yīng)用于細(xì)菌和細(xì)胞的體外成像以及小動(dòng)物體內(nèi)成像,在應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域表現(xiàn)出較大的潛力。
隨著對(duì)醫(yī)學(xué)納米技術(shù)的深入研究,近年研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)將藥物和納米材料結(jié)合可以提高藥物在人體吸收、分布、代謝方面的傳遞過(guò)程[2]。食品來(lái)源的碳點(diǎn)具有粒徑小、易溶于水、細(xì)胞相容性高等優(yōu)點(diǎn),可作為納米載體應(yīng)用于藥物傳輸領(lǐng)域。由于腫瘤的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng),與碳點(diǎn)結(jié)合的藥物進(jìn)入人體后,易于定向腫瘤部位并聚集,從而更好地發(fā)揮藥效[38]。
Wang等[14]利用啤酒制備碳點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳點(diǎn)濃度在0~12.5 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有顯著影響,表明該碳點(diǎn)具有低細(xì)胞毒性。以該碳點(diǎn)為藥物載體對(duì)鹽酸阿霉素(doxorubicin,DOX)進(jìn)行藥物遞送,并通過(guò)激光掃描共聚焦成像儀進(jìn)行觀察到隨著時(shí)間的增加,大部分的碳點(diǎn)-DOX復(fù)合物被MCF-7細(xì)胞所攝取,并將DOX轉(zhuǎn)移并釋放到細(xì)胞內(nèi)。研究表明該碳點(diǎn)可作為一種有效的納米載體用于乳腺癌治療。D’souza等[39]合成了一種胡蘿卜來(lái)源的熒光碳點(diǎn),發(fā)現(xiàn)該碳點(diǎn)通過(guò)氫鍵與絲裂霉素藥物有效結(jié)合,但在中等酸性的腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境 (pH 6.80)下碳點(diǎn)-藥物復(fù)合物的氫鍵斷裂,絲裂霉素釋放。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)-絲裂霉素復(fù)合物的細(xì)胞活性(60%)顯著低于裸碳點(diǎn)和純絲裂霉素的細(xì)胞活性(89%,81%),結(jié)果表明該碳點(diǎn)可作為絲裂霉素藥物載體顯著提高絲裂霉素的殺傷作用。因此,食品來(lái)源碳點(diǎn)表面存在的大量官能團(tuán),及其具有的低細(xì)胞毒性,有利于藥物遞送至目標(biāo)部位發(fā)揮藥效。
碳點(diǎn)作為一種新型熒光納米顆粒,具有優(yōu)良的光學(xué)特性、高分散性、高穩(wěn)定性、抗光漂白性等特點(diǎn)。食品來(lái)源的碳點(diǎn)與其他來(lái)源的碳點(diǎn)相比,具有綠色環(huán)保、尺寸較小、細(xì)胞毒性低、安全性高等優(yōu)點(diǎn),在生物領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力,近年日益受到國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注。隨著研究地不斷深入,目前發(fā)現(xiàn)食品來(lái)源的碳點(diǎn)在合成及生物應(yīng)用方面仍有些問(wèn)題有待進(jìn)一步地研究與探討:1)目前碳點(diǎn)的合成選用果蔬、動(dòng)物等可食用的食品,會(huì)造成一定程度的資源浪費(fèi)。今后可側(cè)重研究選擇食物的廢棄物或食品加工過(guò)程中的廢渣或廢料,以便綠色環(huán)保、可持續(xù)地利用食品制備碳點(diǎn);2)目前合成食品來(lái)源碳點(diǎn)的方法需要大量能源投入,因此開(kāi)發(fā)綠色合成方法,使之更加節(jié)能、高效地制備碳點(diǎn),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)食品來(lái)源碳點(diǎn)的大規(guī)模制備,應(yīng)用于實(shí)際,是今后研究的重要方向;3)食品來(lái)源的碳點(diǎn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用多局限在生物傳感器、生物成像、藥物運(yùn)輸?shù)确矫?,能否利用其小分子靶向特點(diǎn),進(jìn)一步應(yīng)用于疾病的診斷、預(yù)防及治療等方面,擴(kuò)大其應(yīng)用范圍,有待于科研工作者進(jìn)一步探究。