王悅鵬,吳 濤

(通遼梅花生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 通遼 028024)

色氨酸又名為α-氨基-β-吲哚丙酸,其分子式為C11H12N2O2,共有3種同分異構(gòu)體,分別為D-色氨酸、L-色氨酸以及兩種異構(gòu)體的消旋混合物DL-色氨酸[1]。20世紀(jì)初期,Hopkins首次從酪蛋白中分離獲得色氨酸。色氨酸為白色或微黃色晶體,在堿性條件下可穩(wěn)定存在[2]。常溫下溶于水,微溶于乙醇,不溶于氯仿等有機(jī)試劑[3]。L-色氨酸是8種必需氨基酸之一,人和動(dòng)物只能通過(guò)食物來(lái)攝取L-色氨酸。D-色氨酸主要存在于植物和微生物之中,動(dòng)物中含量極少,而且在人體內(nèi)幾乎不發(fā)生代謝作用,也無(wú)毒性[4]。目前色氨酸廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥以及農(nóng)林等行業(yè)[5]。在食品中添加色氨酸可促進(jìn)蛋白質(zhì)吸收[6],作為飼料添加劑使用時(shí)可令動(dòng)物增重[7]。此外,色氨酸可轉(zhuǎn)化為5-羥色胺,促進(jìn)球蛋白生成,提高機(jī)體免疫力[8]。L-色氨酸年產(chǎn)量超過(guò)5萬(wàn)噸[9],但仍低于潛在的市場(chǎng)需求量[10]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成和蛋白質(zhì)水解[11]。由于生產(chǎn)原料有限、污染問(wèn)題嚴(yán)重以及成本偏高等原因,上述方法已逐漸被微生物法取代。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及微生物法所特有的成本低、環(huán)境友好及高密度發(fā)酵的優(yōu)勢(shì),涉及微生物生產(chǎn)色氨酸的策略已得到廣泛應(yīng)用和研究[12]。

目前,微生物發(fā)酵產(chǎn)色氨酸還存在著合成代謝通路的碳通量較低、色氨酸前體數(shù)量不足、以及調(diào)控機(jī)制復(fù)雜等缺陷[13]。筆者綜述了國(guó)內(nèi)外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的研究現(xiàn)狀,介紹了利用代謝工程手段與發(fā)酵過(guò)程控制的方法提高色氨酸產(chǎn)量的策略,并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望。

1 L-色氨酸生產(chǎn)菌株的改造

L-色氨酸的主要生產(chǎn)菌株為谷氨酸棒桿菌與大腸桿菌。谷氨酸棒桿菌是一種工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸常見(jiàn)的微生物,其安全性強(qiáng)、代謝網(wǎng)絡(luò)易改造、遺傳較為穩(wěn)定[14]。大腸桿菌也是一種廣泛使用的生產(chǎn)宿主,具有良好的遺傳背景,在廉價(jià)培養(yǎng)基中可快速生長(zhǎng),有效地降低了生產(chǎn)成本。L-色氨酸的生產(chǎn)菌株及研究水平如表1所示。

表1 L-色氨酸的生產(chǎn)菌株及其研究水平

1.1 菌種篩選及誘變育種

早期的菌種篩選大多是通過(guò)誘變育種的方法得到競(jìng)爭(zhēng)途徑缺失或反饋調(diào)控缺陷的色氨酸高產(chǎn)菌。1993年,Azuma等[15]通過(guò)重復(fù)隨機(jī)突變篩選出了一株能高產(chǎn)色氨酸的菌種,在發(fā)酵過(guò)程中流加葡萄糖與前體物鄰氨基苯甲酸,色氨酸產(chǎn)量為54.5 g/L。陳立平[16]利用紫外線與硫酸二乙酯聯(lián)合誘變大腸桿菌后,優(yōu)化了培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件,產(chǎn)酸可達(dá)55.1 g/L。許多隨機(jī)誘變菌株均有較高的產(chǎn)酸,具有大規(guī)模生產(chǎn)的可能,但突變很可能在菌株基因組的其他位置發(fā)生,不僅在篩選上較為費(fèi)力,還影響菌株的進(jìn)一步改良。

1.2 菌株的代謝工程改造

利用基因工程手段改造色氨酸的代謝途徑已成為提升色氨酸產(chǎn)量的重要研究方向。以大腸桿菌為例,3種芳香族氨基酸的合成都始于磷酸烯醇式丙酮酸與4-磷酸赤蘚糖的縮合,二者在DAHP合酶的催化作用下,生成3-脫氧阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DHAP)。DAHP合酶是關(guān)鍵限速酶,將中心代謝的碳流量導(dǎo)入芳香族氨基酸合成途徑。該酶由3種同功酶組成,其中AroG貢獻(xiàn)80%酶活力、AroF貢獻(xiàn)15%，AroH僅占5%,三者分別受芳香族氨基酸的反饋抑制[17]。DAHP經(jīng)過(guò)3步反應(yīng)生成莽草酸,莽草酸又經(jīng)過(guò)3步反應(yīng)生成分支酸,一部分分支酸在變位酶的催化下可生成酪氨酸和苯丙氨酸的合成前體-預(yù)苯酸。在氨基苯甲酸合酶的催化下分支酸生成鄰氨基苯甲酸,最終轉(zhuǎn)化為色氨酸。預(yù)苯酸又可以產(chǎn)生兩個(gè)分支:在預(yù)苯酸脫氫酶作用下生成對(duì)羥基苯丙酮酸,再生成酪氨酸;另一部分預(yù)苯酸則在預(yù)苯酸脫水酶催化下生成苯丙酮酸,進(jìn)一步生成苯丙氨酸。氨基苯甲酸合酶也是色氨酸生成途徑上重要的限速酶,該酶由trpED基因共同編碼,其活性受到產(chǎn)物色氨酸的反饋抑制[18]。編碼分支酸生成色氨酸這一過(guò)程5種酶的基因組成了色氨酸操縱子,其中TrpR蛋白調(diào)控著色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄翻譯,當(dāng)色氨酸含量達(dá)到閾值時(shí),色氨酸激活阻遏蛋白TrpR,阻遏操縱子轉(zhuǎn)錄[19]。此外,色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄還受到位于結(jié)構(gòu)基因上游衰減子TrpL的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸過(guò)量時(shí),衰減子二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,色氨酸操縱子轉(zhuǎn)錄終止[20]。

L-色氨酸生產(chǎn)菌代謝工程改造的研究主要集中在5個(gè)方面:1) 切斷支路及色氨酸分解代謝;2) 調(diào)控關(guān)鍵酶的表達(dá);3) 增強(qiáng)中心代謝途徑;4) 改造色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng);5) 阻斷副產(chǎn)物代謝途徑。

1.2.1 切斷支路及色氨酸分解代謝

發(fā)酵產(chǎn)色氨酸的過(guò)程受到諸多因素調(diào)節(jié),產(chǎn)生色氨酸的同時(shí)也伴隨著其他芳香族氨基酸的合成。色氨酸的過(guò)量累積會(huì)激活下游的分解途徑,導(dǎo)致菌體產(chǎn)酸較低。切斷芳香族氨基酸支路代謝可以促進(jìn)更多分支酸轉(zhuǎn)化為色氨酸,同時(shí)也可解除對(duì)DHAP合酶的反饋抑制。有學(xué)者阻斷酪氨酸與苯丙氨酸的合成通路后,菌體生長(zhǎng)受到抑制[21]。隨著基因編輯技術(shù)的不斷革新,利用基因編輯修飾的遺傳編碼生物傳感器有助于篩選氨基酸高產(chǎn)突變體[22]。有學(xué)者在酪氨酸與苯丙氨酸合成途徑上構(gòu)建了調(diào)控元件基因,通過(guò)在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑調(diào)控芳香族氨基酸的合成[23]。此外,色氨酸在色氨酸酶的催化作用下可分解為吲哚、氨與丙酮酸,通過(guò)敲除編碼色氨酸酶的基因tnaA可避免色氨酸降解[24]。

1.2.2 調(diào)控關(guān)鍵酶的表達(dá)

除切斷支路代謝外,調(diào)控關(guān)鍵酶的表達(dá)也可提高色氨酸產(chǎn)量。色氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶DAHP合酶受到3種芳香族氨基酸的反饋抑制,減弱反饋抑制有利于色氨酸的生成。有學(xué)者提出了一種將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與生物傳感器引導(dǎo)的體內(nèi)篩選(CGSS)相結(jié)合的方法,用于蛋白質(zhì)工程和途徑優(yōu)化以篩選抗反饋調(diào)節(jié)的DAHP合酶,在補(bǔ)料發(fā)酵中色氨酸產(chǎn)量增加38.5%[25]。色氨酸操縱子上的結(jié)構(gòu)基因trpE也受到色氨酸的反饋調(diào)節(jié),解除色氨酸的反饋抑制可顯著提高色氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率[26]。還有學(xué)者對(duì)色氨酸合酶進(jìn)行分子修飾,突變其關(guān)鍵氨基酸殘基,促進(jìn)了色氨酸生成[27]。磷酸甘油酸脫氫酶(由serA基因編碼)參與絲氨酸的合成,絲氨酸對(duì)于色氨酸生產(chǎn)至關(guān)重要,將解除反饋抑制的serA插入到DAHP合酶基因座中,經(jīng)補(bǔ)料發(fā)酵可獲得40 g/L色氨酸[28]。多功能酶TrpC受到鄰氨基苯甲酸非競(jìng)爭(zhēng)性地前饋抑制,突變TrpC上鄰氨基苯甲酸的結(jié)合位點(diǎn)可使色氨酸產(chǎn)量大幅提升[29]。蔡霞等[30]將DAHP合酶、氨基苯甲酸合酶、色氨酸合成酶共表達(dá),色氨酸產(chǎn)量提高了178.6%。

此外,TyrR和TrpR調(diào)控著色氨酸生物合成與轉(zhuǎn)運(yùn)基因的轉(zhuǎn)錄。TyrR屬于全局調(diào)控蛋白,涉及到色氨酸代謝途徑中多個(gè)酶的轉(zhuǎn)錄,其中包括對(duì)于DAHP合酶的轉(zhuǎn)錄阻遏[31]。為解除轉(zhuǎn)錄阻遏作用,通常敲除TyrR和TrpR編碼基因,實(shí)現(xiàn)色氨酸產(chǎn)量的提升[32]。

1.2.3 增強(qiáng)中心代謝途徑

在中心代謝途徑中,磷酸烯醇式丙酮酸與4-磷酸赤蘚糖決定了色氨酸生物合成前體的水平。改造中心代謝途徑,是提高色氨酸合成途徑碳通量的重要手段之一。葡萄糖經(jīng)過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS系統(tǒng))進(jìn)入糖酵解途徑中,為菌體提供ATP與還原力[33],但轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的過(guò)程中消耗了大量的磷酸烯醇式丙酮酸,影響了色氨酸積累。有學(xué)者嘗試用其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)代替PTS系統(tǒng)以增加磷酸烯醇式丙酮酸,但菌體生長(zhǎng)受到抑制[3,34]。Flores等[35]敲除PTS系統(tǒng)后篩選到了生長(zhǎng)未受影響的突變株,實(shí)現(xiàn)了碳通量的重新定向。此外,還可以調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸到中心代謝途徑的碳通量以促進(jìn)色氨酸生成。在糖酵解途徑中,磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化作用下生成丙酮酸,進(jìn)入TCA循環(huán);在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化下生成草酰乙酸[36]。在糖異生途徑中,丙酮酸又可在磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的催化下實(shí)現(xiàn)磷酸烯醇式丙酮酸再生。Yi等[37]敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶并過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因,增加了莽草酸途徑碳通量,菌株產(chǎn)酸明顯提高。Meza等[38]通過(guò)阻斷PTS系統(tǒng)與丙酮酸激酶實(shí)現(xiàn)了中心碳流量的重新定向。還有學(xué)者失活貯碳調(diào)節(jié)因子CsrA或過(guò)表達(dá)負(fù)調(diào)控蛋白CsrB以增加磷酸烯醇式丙酮酸[39]。

4-磷酸赤蘚糖是戊糖磷酸途徑的中間產(chǎn)物,由7-磷酸景天庚酮糖和3-磷酸甘油醛在轉(zhuǎn)醛酶的催化下生成。研究人員通過(guò)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)醛酶(talB)和轉(zhuǎn)酮酶(tktA)以提高胞內(nèi)4-磷酸赤蘚糖的濃度[40-41]。Shen等[42]過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合成酶與轉(zhuǎn)酮酶,又阻斷了菌株內(nèi)色氨酸分解代謝途徑并解除色氨酸生成的轉(zhuǎn)錄阻遏,最終產(chǎn)酸可達(dá)40.2 g/L。路麗君[43]過(guò)表達(dá)了CsrB與轉(zhuǎn)酮酶來(lái)調(diào)節(jié)碳通量,產(chǎn)酸提高了15.7%。Ikeda[44]通過(guò)共表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶基因與色氨酸合成關(guān)鍵酶基因,色氨酸產(chǎn)量達(dá)到58 g/L,是目前谷氨酸棒桿菌的最佳產(chǎn)酸水平。

傳統(tǒng)的基因敲除主要采用Red同源重組的技術(shù),隨著CRISPR技術(shù)的不斷革新,越來(lái)越多地應(yīng)用于在氨基酸菌株開(kāi)發(fā)中[45]。有學(xué)者利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌W3110的中心代謝途徑進(jìn)行了改造,修飾了與磷酸烯醇式丙酮酸代謝的相關(guān)基因,以增加前體磷酸烯醇式丙酮酸的供應(yīng)。與此同時(shí),上調(diào)了菌株檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和TCA循環(huán),有效地促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng),最終色氨酸產(chǎn)量可達(dá)49 g/L[46]。

1.2.4 改造色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造主要針對(duì)產(chǎn)物排出和底物吸收，避免中間體因排泄受到損失,從而達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的[47]。細(xì)胞內(nèi)色氨酸的濃度直接影響色氨酸關(guān)鍵酶的活性,大量產(chǎn)物在胞內(nèi)積累會(huì)加劇產(chǎn)物抑制效應(yīng),因此色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造對(duì)提升菌體產(chǎn)酸尤為重要。在大腸桿菌中有3種滲透酶負(fù)責(zé)色氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn):AroP,Mtr和TnaB[48]。AroP為芳香族氨基酸通用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,對(duì)苯丙氨酸和酪氨酸有更高的親和性,而Mtr和TnaB則負(fù)責(zé)特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)色氨酸[49]。在谷氨酸棒桿菌中,僅有AroP負(fù)責(zé)芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。在基因工程菌構(gòu)建過(guò)程中通常將氨基酸滲透酶敲除,以避免色氨酸重新同化[50]。

1.2.5 阻斷副產(chǎn)物代謝途徑

在發(fā)酵過(guò)程中,副產(chǎn)物的出現(xiàn)降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率,抑制了菌體生長(zhǎng)與關(guān)鍵酶活性,導(dǎo)致產(chǎn)酸下降[51],使得后續(xù)的產(chǎn)物提取變得困難。由于葡萄糖過(guò)量或菌體呼吸受限,引起了溢流代謝,導(dǎo)致大量乙酸生成。Wang等[52]敲除了磷酸轉(zhuǎn)乙?；?菌株在發(fā)酵前期生長(zhǎng)受限,在發(fā)酵結(jié)束后,菌體的生物量和色氨酸的產(chǎn)量有所提升,乙酸量?jī)H為野生型的20%。Liu等[53]對(duì)磷酸轉(zhuǎn)乙?；高M(jìn)行突變,降低了磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅牡孜镉H和力與催化能力,最終乙酸下降了35%,補(bǔ)料發(fā)酵后產(chǎn)酸達(dá)到44 g/L。研究人員通過(guò)敲除具有乙酸激酶活性的丙酸激酶編碼基因(tdcD)控制乙酸溢流,敲除該基因后,菌株在高糖條件下可保持較好地生長(zhǎng)與產(chǎn)酸,最終色氨酸可達(dá)48.8 g/L[54]。谷氨酸也常作為發(fā)酵副產(chǎn)物出現(xiàn),谷氨酸增加導(dǎo)致谷氨酰胺減少,抑制了鄰氨基苯甲酸的活性。有學(xué)者則通過(guò)過(guò)表達(dá)谷氨酰胺合成酶以降低谷氨酸水平,從而間接地提高色氨酸產(chǎn)量[55]。還有學(xué)者在敲除谷氨酸合成酶編碼基因后,在培養(yǎng)基中補(bǔ)加1 g/L谷氨酸,使產(chǎn)酸量提高了10.92%[56]。

2 色氨酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化

提高微生物發(fā)酵產(chǎn)酸能力不僅要從菌體代謝途徑改造入手,對(duì)下游發(fā)酵工藝的優(yōu)化也尤為重要。通過(guò)對(duì)菌株發(fā)酵過(guò)程的調(diào)控,使其生成產(chǎn)物的能力增強(qiáng),提高對(duì)底物的利用率,副產(chǎn)物積累量也隨之減少。首先是優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,篩選最適宜菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物積累的配方;其次是優(yōu)化發(fā)酵條件,通過(guò)調(diào)控發(fā)酵過(guò)程,使葡萄糖的利用率升高,副產(chǎn)物減少,以此促進(jìn)色氨酸進(jìn)一步積累。

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在發(fā)酵過(guò)程中,碳源提供菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的能量,同時(shí)在產(chǎn)物合成階段提供碳骨架。適宜的碳源不僅有利于菌體生長(zhǎng)，還可以促進(jìn)產(chǎn)物生成。張婷婷[57]在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和淀粉,以葡萄糖為碳源時(shí),菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成都達(dá)到最佳值,當(dāng)初始葡萄糖為30 g/L時(shí),色氨酸產(chǎn)量最高;而蔗糖和淀粉則無(wú)法被菌體利用。

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類:無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源。無(wú)機(jī)氮源在發(fā)酵過(guò)程中被菌體迅速利用,同時(shí)還可以穩(wěn)定和調(diào)節(jié)pH。工業(yè)上常用的有機(jī)氮源多為廉價(jià)的原料,除作為氮源使用外,部分有機(jī)氮源還能提供大量的無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子。張婷婷[57]測(cè)試了多種氮源對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響,加入6 g/L酵母粉和NH4NO3是菌體生物量與色氨酸合成的最佳條件。黃靜等[58]發(fā)現(xiàn)酵母粉可促進(jìn)菌體產(chǎn)酸,但其中的雜質(zhì)會(huì)影響菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸。在培養(yǎng)基中加入2 g/L氨基酸粉和0.5 g/L氯化膽堿可以緩解因短暫的氮源缺乏所導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[59]。楊夢(mèng)晨[60]利用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基中氨基酸與核苷酸成分以替代酵母粉,最終色氨酸產(chǎn)量達(dá)到40.8 g/L,副產(chǎn)物乙酸也有明顯下降。陳勝杰[61]考察了氯化膽堿、棉籽精粉與核苷混合物對(duì)發(fā)酵的影響,加入20 g/L棉籽精粉后,色氨酸產(chǎn)量明顯提高,達(dá)到了40.52 g/L。Xu等[62]利用酸水解細(xì)胞,使用其替代培養(yǎng)基中的酵母提取物,最終色氨酸產(chǎn)量可達(dá)52.3 g/L。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中,發(fā)酵溫度、pH以及溶氧的優(yōu)化對(duì)于產(chǎn)酸的提高也至關(guān)重要。微生物發(fā)酵過(guò)程中,代謝途徑上的多種反應(yīng)均需要酶進(jìn)行催化,在酶的幫助下完成底物的分解與產(chǎn)物的合成,因此適宜的溫度和pH對(duì)于菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)物的積累都有非常重要的影響。陳立平[16]通過(guò)誘變育種篩選到一株高產(chǎn)色氨酸的菌株,利用單因素實(shí)驗(yàn)確定了發(fā)酵過(guò)程中最佳溫度、pH、接種量、種齡以及底糖濃度等條件,色氨酸產(chǎn)量提高了12.4%。溶氧控制是發(fā)酵過(guò)程中影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵因素,供氧不足時(shí),菌體呼吸受限,菌體生長(zhǎng)受到抑制,此時(shí)菌體溢流代謝明顯,乙酸、乳酸增加;當(dāng)供氧過(guò)量時(shí),大部分葡萄糖流向了TCA循環(huán),不利于色氨酸的生成[68]。Zhao等[69]根據(jù)發(fā)酵的不同階段對(duì)pH與溶氧采用分階段控制,發(fā)酵的前20 h將溶氧控制在20%,pH控制在7.0;在發(fā)酵進(jìn)行到20 h以后,將溶氧控制在30%,pH控制在6.5。對(duì)色氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)此種控制手段有利于代謝流流向戊糖磷酸途徑及色氨酸生成途徑,最終產(chǎn)酸為52.57 g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.15%。

補(bǔ)料發(fā)酵廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工藝中,流加限制性底物可促使微生物更好地利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。婁秀平[70]利用正交實(shí)驗(yàn)在搖瓶水平優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件后,又考察了不同補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵的影響。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度低于5 g/L時(shí),將70%的葡萄糖以15 mL/h的速率流加到發(fā)酵罐中,后期由于殘?zhí)沁^(guò)高,大量葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙酸?？紤]到乙酸過(guò)高的問(wèn)題,將葡萄糖間歇地流加到發(fā)酵罐中,色氨酸產(chǎn)量較恒速補(bǔ)料提高了13.1%,乙酸也明顯減少?？紤]到溶氧和pH均為影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的重要因素,根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中溶氧與pH的波動(dòng)進(jìn)行補(bǔ)料,顯著提高了色氨酸的產(chǎn)量和菌體生物量,最大產(chǎn)酸可達(dá)24.6 g/L。程立坤[71]提出了控制流加糖濃度使菌體的比生長(zhǎng)速率低于閾值的補(bǔ)料策略,在發(fā)酵過(guò)程中控制菌體最大比生長(zhǎng)速率小于0.25,最終產(chǎn)酸達(dá)到38.8 g/L,轉(zhuǎn)化率為19.9%。劉鎮(zhèn)瑜等[72]利用活細(xì)胞在線監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)罐內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量,利用活細(xì)胞數(shù)計(jì)算比生長(zhǎng)速率進(jìn)行補(bǔ)料,產(chǎn)酸提高了9.62%,副產(chǎn)物乙酸明顯減少。還有學(xué)者提出了稀糖分罐發(fā)酵的策略,在發(fā)酵中期將發(fā)酵液重新分配,一定程度上提升了產(chǎn)酸[73]。

3 展 望

近年來(lái),隨著生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展,越來(lái)越多新技術(shù)的出現(xiàn)給傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)注入了新鮮血液。筆者認(rèn)為今后的研究可以從以下4個(gè)方面展開(kāi):

1) 共培養(yǎng)策略:氨基酸高產(chǎn)菌株在工業(yè)上通常為單一培養(yǎng)。最近,代謝工程已經(jīng)證明：可以設(shè)計(jì)微生物聯(lián)合體,使兩個(gè)菌株之間分工以生產(chǎn)所需的化合物。張震等[74]利用大腸桿菌TRTH和谷氨酸棒桿菌TQ2223進(jìn)行混合發(fā)酵,有效地減少了副產(chǎn)物的積累,提高了色氨酸產(chǎn)量。

2) 新一代工業(yè)微生物底盤(pán)菌株的開(kāi)發(fā):色氨酸的主要生產(chǎn)菌株為大腸桿菌與谷氨酸棒桿菌,二者在菌株改造及發(fā)酵過(guò)程中存在一定的局限性。此外,在培養(yǎng)過(guò)程中易被污染,工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。有研究學(xué)者在極端條件下篩選出了一株可以在高pH和高鹽條件下快速生長(zhǎng)的鹽單胞菌,并對(duì)其進(jìn)行改造用于生產(chǎn)蘇氨酸[75]。未來(lái)，此類菌株可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以用于色氨酸發(fā)酵生產(chǎn)。

3) 利用組學(xué)技術(shù)對(duì)菌株改造:傳統(tǒng)的基因敲除、過(guò)表達(dá)等定向改造策略在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中存在一定的局限性。部分代謝通路的改造可能會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)在內(nèi)的技術(shù)應(yīng)用可以更好地闡釋微生物發(fā)酵過(guò)程中所隱含的信息,同時(shí)可以為菌株的優(yōu)化過(guò)程提供更多的理論指導(dǎo)[76]。

4) 發(fā)酵與分離耦合:在生物反應(yīng)發(fā)生的同時(shí),利用合適的分離方法及時(shí)地將抑制性產(chǎn)物選擇性地從反應(yīng)體系移除。一方面在線分離產(chǎn)物并解除生物反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物抑制可以提高反應(yīng)強(qiáng)度和產(chǎn)率,另一方面則易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程的連續(xù)性和自動(dòng)化?？梢越档彤a(chǎn)物分離過(guò)程的投資和操作成本,為企業(yè)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié) 論

氨基酸生產(chǎn)是我國(guó)發(fā)酵行業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一,隨著大宗氨基酸如谷氨酸等產(chǎn)品的產(chǎn)量及市場(chǎng)需求量的飽和,小品種氨基酸及衍生物的開(kāi)發(fā)受到了行業(yè)內(nèi)的關(guān)注。越來(lái)越多的氨基酸產(chǎn)品從餐桌走向醫(yī)療保健、美容化妝等領(lǐng)域。目前,微生物發(fā)酵法制備色氨酸的研究取得了較大的突破,部分菌株也具備了工業(yè)化生產(chǎn)的能力。菌株的代謝工程改造與發(fā)酵優(yōu)化相結(jié)合的策略逐步克服了發(fā)酵過(guò)程中存在的糖酸轉(zhuǎn)化率較低的問(wèn)題。同時(shí),此類研究的相關(guān)方法也可進(jìn)一步推廣到其他品種氨基酸的生產(chǎn)中,為相關(guān)的研究提供理論指導(dǎo)。