周旭波,丁 鼎,劉 帥,王 威,王 健

(江蘇澳創(chuàng)生物科技有限公司,江蘇 無錫 214100)

L-蘇氨酸是人體和動物體內(nèi)的必需氨基酸之一,是構(gòu)成蛋白的重要組成部分,人和動物自身不能合成,必須從食物中攝取。L-蘇氨酸具有恢復(fù)疲勞、促進生長發(fā)育等多種生理功能,在飼料、食品和醫(yī)藥等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用[1-2]。近幾年,全球蘇氨酸市場以每年20%多的增長率高速增長,L-蘇氨酸的需求量也在逐年上升,蘇氨酸也成為僅次于谷氨酸、賴氨酸和蛋氨酸的第四大產(chǎn)能的大宗氨基酸產(chǎn)品[3]。L-蘇氨酸的生產(chǎn)方法目前主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn),利用發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘇氨酸,比傳統(tǒng)的采用化學合成法和水解動物蛋白質(zhì)提取法,具有生產(chǎn)成本更低、更加綠色環(huán)保等顯著優(yōu)越性[4-5]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,研究者們利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株,使L-蘇氨酸生產(chǎn)技術(shù)得到不斷進步和發(fā)展[6-8]。在蘇氨酸高產(chǎn)菌株里,大腸桿菌由于遺傳學清晰、基因操作簡單、易于培養(yǎng)、周期短和培養(yǎng)條件粗放等優(yōu)點,已成為直接法發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的主要菌株[9]。

在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的過程中容易產(chǎn)生乙酸等有機酸代謝副產(chǎn)物,乙酸作為大腸桿菌主要的有機酸副產(chǎn)物,會抑制菌體生長、減弱菌體活力、減少目的產(chǎn)物的合成、降低菌株生產(chǎn)能力[10],此外,大腸桿菌碳代謝流的10%～30%可轉(zhuǎn)化為乙酸,造成碳源浪費,降低了發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率,增加了生產(chǎn)成本,進而影響大腸桿菌發(fā)酵的生產(chǎn)能力[11]。乙酸的產(chǎn)生與細胞中的氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)有關(guān),一般在兩種情況下易產(chǎn)生乙酸:一是無氧條件或是供氧不足;二是供氧充足,但糖酵解碳代謝流與TCA碳代謝流不平衡[12]。為了減少大腸桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸,降低乙酸對發(fā)酵菌體產(chǎn)生的抑制作用,提高生產(chǎn)效率,近年來很多研究人員對此展開了大量研究:一方面利用代謝工程手段對菌體本身進行分子改造以減少乙酸的代謝合成[13];另一方面通過對發(fā)酵過程進行有效控制,主要包括發(fā)酵條件優(yōu)化和對培養(yǎng)基的改善,對菌體培養(yǎng)基和代謝過程進行調(diào)節(jié),使代謝流朝著有利的方向進行,降低乙酸生成,提高發(fā)酵水平[14]。以大腸桿菌ACThr1032為蘇氨酸生產(chǎn)菌,利用響應(yīng)面試驗探索了不同的補糖量、補氮量及溶氧控制對大腸桿菌發(fā)酵蘇氨酸產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸的影響,以減少大腸桿菌發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸的生成,為大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn)L-蘇氨酸提供一個可行方案。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

大腸桿菌(Escherichiacoli)ACThr1032,江蘇澳創(chuàng)生物科技有限公司保藏菌種。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

1) 活化斜面培養(yǎng)基:葡萄糖1 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸出粉5 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂20 g/L,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

2) 種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,(NH4)2SO42 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,酵母粉10 g/L,玉米漿干粉0.5 g/L,FeSO4·7H2O 2.8 mg/L,MnSO4·H2O 2.8 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

3) 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,(NH4)2SO41.8 g/L,KH2PO43 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,酵母粉1 g/L,玉米漿干粉1 g/L,FeSO4·7H2O 80 mg/L,MnSO4·H2O 80 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀 器

30 L自動發(fā)酵罐,上海百侖生物科技有限公司;高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀,山東科學院生物研究所。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1) 斜面活化培養(yǎng):取保藏菌種劃線接種于活化斜面,37 ℃培養(yǎng)15～18 h。

2) 搖瓶培養(yǎng):從新鮮活化斜面上挑取2環(huán)大腸桿菌于種子培養(yǎng)基中,500 mL三角瓶裝液量30 mL,置于旋轉(zhuǎn)式搖床上,200 r/min,37 ℃振蕩培養(yǎng)至光密度OD為12～14。

3) 30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)結(jié)束的搖瓶種子按10%體積分數(shù)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始通氣量10 L/min,攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min,通過自動流加氨水控制pH在7.0左右,培養(yǎng)溫度36.5 ℃。培養(yǎng)過程中,流加5%質(zhì)量分數(shù)的有機氮源補充培養(yǎng)基,當溶氧降低至一定值時交替提高轉(zhuǎn)速和通氣量,當發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度降至一定值時,流加質(zhì)量分數(shù)為80%的葡萄糖溶液。

1.2.2 分析檢測方法

1) 菌體生長測定:發(fā)酵液用蒸餾水稀釋20倍后,測定600 nm波長下的OD值。

2) 葡萄糖質(zhì)量濃度測定:采用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

3) 蘇氨酸質(zhì)量濃度測定:高效液相色譜法[15]。

4) 乙酸質(zhì)量濃度測定:高效液相色譜法[15]。

1.2.3 試驗方法

通過控制葡萄糖的流加速率可以調(diào)節(jié)大腸桿菌發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生量[10];在發(fā)酵過程中流加精氨酸、琥珀酸和甲硫氨酸等氨基酸或富含氨基酸的酵母粉等有機氮源,可以降低大腸桿菌發(fā)酵過程中乙酸的積累量[16-19];發(fā)酵過程控制中溶氧控制對乙酸的生成也具有顯著影響,供氧不足或缺氧可迫使糖進入混合酸發(fā)酵途徑,使副產(chǎn)物乙酸大量積累。此外,溶氧控制與菌體生長和補料控制相互關(guān)聯(lián)反饋,廣泛用于控制大腸桿菌發(fā)酵過程中乙酸的生成[20-21]。

依據(jù)參考文獻報道以及對前期大量試驗數(shù)據(jù)和生產(chǎn)經(jīng)驗總結(jié)的基礎(chǔ)上,選取大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中控制乙酸生成的3個關(guān)鍵因素,即平均補糖流量A、平均補氮流量B和溶氧控制值C,以發(fā)酵培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度R(g/L)為指標,進行單因素試驗,確定響應(yīng)面優(yōu)化范圍,然后根據(jù)單因素試驗結(jié)果,進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗,采用Box-Behnken Design(BBD)響應(yīng)面試驗設(shè)計法[22],所有試驗均做3個重復(fù)取平均值,采用Design-Expert(Version 8.0.5)軟件對響應(yīng)面試驗得到的數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析,模型及因素的顯著性均通過P值進行考察,其中P<0.05時影響顯著,以*表示;P<0.001時影響極其顯著,以**表示。以響應(yīng)面實驗得到的最優(yōu)試驗方案為基礎(chǔ),探索最佳的補糖、補氮、溶氧控制策略,獲得最佳的試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 平均補糖流量對蘇氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)生乙酸的影響

發(fā)酵控制過程中,補糖控制一般是根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度及耗糖速率來計算補糖流量來進行控制,經(jīng)過試驗數(shù)據(jù)經(jīng)驗積累,可以確定一個平均補糖流量,然后根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度及耗糖速率圍繞平均補糖流量進行調(diào)節(jié)控制,不同平均補糖流量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響見圖1。由圖1可知:平均補糖流量為0.3 L/h時大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的副產(chǎn)物乙酸最低,因此確定平均補糖流量為0.3 L/h。

圖1 不同平均補糖流量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響

2.2 平均補氮流量對蘇氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)生乙酸的影響

蘇氨酸發(fā)酵過程中,發(fā)酵起始培養(yǎng)基都會有一定量的有機氮源,有機氮源在菌種生長代謝過程中會逐漸消耗掉,補氮操作就是為了彌補發(fā)酵過程中有機氮源不足而進行的操作,通過發(fā)酵過程中的補氮操作可以避免發(fā)酵起始培養(yǎng)基中含有過高質(zhì)量濃度的有機氮源,同時還能滿足菌種持續(xù)生長代謝對有機氮源的需求,補氮控制一般是勻速流加或根據(jù)生長不同周期階梯勻速流加,不同平均補氮流量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響見圖2。由圖2可知:平均補氮流量為20 mL/h時大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的副產(chǎn)物乙酸最低,因此確定平均補氮流量為20 mL/h。

圖2 不同平均補氮流量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響

2.3 溶氧控制對蘇氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)生乙酸的影響

發(fā)酵過程中的溶氧控制一般通過設(shè)定溶氧DO電極測定的DO值在某一目標值范圍內(nèi),通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)數(shù)或通風量來進行控制,不同溶氧控制值對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響見圖3。由圖3可知:溶氧控制值設(shè)定為30%時大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的副產(chǎn)物乙酸最低,因此確定溶氧控制值的設(shè)定為30%。

圖3 不同溶氧控制對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的影響

2.4 響應(yīng)面試驗分析

設(shè)定平均補糖流量A為0.2～0.4 L/h,平均補氮流量B為10～30 mL/h,溶氧控制值C為20%～40%,采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計試驗,以乙酸質(zhì)量濃度R為考察指標(g/L)。試驗因素編碼和水平如表1所示,試驗安排及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平和編碼

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.1 二次回歸擬合和方差分析

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合,響應(yīng)值乙酸質(zhì)量濃度R(g/L)與因素編碼值(Coded factors)之間的函數(shù)關(guān)系為

(1)

響應(yīng)值乙酸質(zhì)量濃度R(g/L)預(yù)測值與各因素實際值(Actual Factors)之間的函數(shù)關(guān)系為

(2)

利用Design Expert軟件對響應(yīng)面二次模型進行方差分析及可信度分析,結(jié)果詳見表3,4。由表3可知：該回歸模型高度顯著(P=0.000 3),失擬項不顯著(P=0.167 7),說明模型擬合得較好。由表4可知:復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.963 72,說明模型擬合程度較好,模型的預(yù)測值和真實值高度相關(guān),可以用其代替真實試驗點進行預(yù)測。從表3中可以看出:各因素對目標值影響的顯著性為A>C>B,尤其是因素A,其不同水平對乙酸質(zhì)量濃度具有較明顯的影響。

表3 回歸模型的方差分析

表4 模型可信度分析

2.4.2 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化

根據(jù)模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線見圖4。通過該組動態(tài)圖對任何兩因素交互影響乙酸產(chǎn)生的效應(yīng)進行分析與評價,從而確定最佳因素水平。從圖4中可以看出:平均補糖流量與平均補氮流量、平均補糖流量與溶氧控制、平均補氮流量與溶氧控制值兩兩交互作用,其中,平均補糖流量與平均補氮流量交互作用的等高線圖形近乎圓形,表明平均補糖流量與平均補氮流量兩因素之間的交互效應(yīng)較弱,而平均補糖流量與溶氧控制值、平均補氮流量與溶氧控制值兩兩因素交互作用的等高線圖形狀近乎橢圓形,說明平均補糖流量與溶氧控制值、平均補氮流量與溶氧控制值兩兩因素之間存在著較為復(fù)雜的交互作用。從圖4可以看出:實驗因素對響應(yīng)值的影響變化趨勢以及回歸模型確實具有最優(yōu)響應(yīng)值。利用設(shè)計軟件進行嶺脊分析,可以得到最優(yōu)控制條件為:平均補糖流量為0.23 L/h,平均補氮流量為15.47 mL/h,溶氧控制值為33.78%,此時乙酸質(zhì)量濃度最小預(yù)測值為0.468 g/L。為驗證回歸模型的可靠性,以響應(yīng)面實驗得到的最優(yōu)培養(yǎng)方案進行了3次平行驗證實驗,試驗得到的乙酸質(zhì)量濃度的平均值為0.462 g/L,與預(yù)測值0.468 g/L吻合度較高,說明模型能較好地預(yù)測實際發(fā)酵產(chǎn)生乙酸情況。

圖4 等高線圖及響應(yīng)面立體圖

2.5 蘇氨酸發(fā)酵控制方案優(yōu)化

在響應(yīng)面試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,進一步考察補糖流量和溶氧控制值之間交互作用對所產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸質(zhì)量濃度的影響。在響應(yīng)面試驗水平的基礎(chǔ)上進一步降低平均補糖流量的水平值,發(fā)現(xiàn)在平均補糖流量小于0.2 L/h時,DO值出現(xiàn)上升趨勢,同時伴隨著最大菌體OD值的下降,發(fā)酵液中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度進一步下降至0.4 g/L以下,意味著平均補糖流量進一步減少至影響菌體生長的程度,可以進一步降低產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度,同時還提高了發(fā)酵液中的DO值,說明在溶氧充足的情況下,減少補糖的量可以有效降低發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度。同時,在試驗中發(fā)現(xiàn)補糖的量與發(fā)酵液中的DO值及菌體OD值存在一定的關(guān)聯(lián),在發(fā)酵一定時期后,補糖的量與菌體OD值正相關(guān),與發(fā)酵液中的DO值負相關(guān)。為了降低發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙酸的質(zhì)量濃度,一方面需要保持充足的溶氧,另一方面還需要保持一定的菌體OD值。因此,采用補糖與溶氧連鎖控制:一方面根據(jù)發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度,利用溶氧反饋進行補糖;另一方面還要保證菌體的生長OD值達到一定范圍,使補糖的量稍低于菌體生長需求的補糖量。采用優(yōu)化后的補糖控制策略,在30 L發(fā)酵罐中進行蘇氨酸發(fā)酵培養(yǎng)30 h,經(jīng)過3次平行發(fā)酵試驗驗證,試驗結(jié)果見表5,蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸3次試驗結(jié)果的均值比優(yōu)化前提高了23.15%。

表5 優(yōu)化前后的發(fā)酵試驗結(jié)果比較

3 結(jié) 論

在使用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸的過程中,副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生,對菌體的生長和目標產(chǎn)物的合成都會造成較大影響,甚至會嚴重抑制發(fā)酵過程和產(chǎn)物合成。乙酸的產(chǎn)生與發(fā)酵培養(yǎng)基組分和菌體代謝密切相關(guān)。筆者選取大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中葡萄糖流加、有機氮流加、溶氧控制值3個關(guān)鍵因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和分析,通過試驗考察補糖、補氮及溶氧控制條件對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸的影響,研究補糖、補氮和溶氧控制條件對蘇氨酸發(fā)酵菌體生長和產(chǎn)物合成的影響。在響應(yīng)面試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,進一步研究了平均補糖流量與溶氧控制值的交互作用,采用溶氧反饋的亞適量補糖控制策略,在此控制條件下,30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)30 h,蘇氨酸產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了23.15%。研究對蘇氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。在試驗過程中,發(fā)現(xiàn)補糖控制與溶氧控制、補糖控制與補氮控制、菌體生長的控制同副產(chǎn)物乙酸的富集、蘇氨酸產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率之間具有較為復(fù)雜的交互作用,需要通過試驗進一步研究。