辛 磊,安 慧,覃國樂,羅奉奉,李秀玲

(河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 宜州 546300)

農(nóng)業(yè)病蟲害的常規(guī)防治主要以化學(xué)防治為主,如核桃根腐病的防治[1]、水稻細菌性條斑病的防治[2]、油茶炭疽病的防治[3]和小麥全蝕病的防治[4]等,不僅對環(huán)境造成一定的影響,而且也易引發(fā)病原菌的抗藥性問題。隨著人們對綠色環(huán)保的要求越來越高,化學(xué)藥物防治所帶來的弊端也越來越明顯[5],農(nóng)業(yè)種植模式也由常規(guī)農(nóng)業(yè)向有機、生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展[6]。生物防治因?qū)ν寥篮铜h(huán)境生態(tài)安全,對人及動植物無毒副作用,不誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點[7],在農(nóng)業(yè)防治中發(fā)揮著越來越重要的作用[8]。從自然界分離獲得的野生菌株,其藥物代謝合成能力不論在產(chǎn)量還是質(zhì)量上,均很難適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求[9],故微生物的選育極為重要[10]。目前,菌株的選育多采用自然選育、誘變育種、轉(zhuǎn)錄、粒子流和等離子體等方法[11],而紫外誘變因設(shè)備簡單、安全易操作和成本低等優(yōu)點被廣泛采用[12-13]。孟兆麗等[14]利用紫外誘變,選育出1 株遺傳性穩(wěn)定的枯草芽孢桿菌mutHS-301,抑菌活性提高了約20%;武曉雨等[15]利用紫外選育出耐高溫新品種金西1號;趙瑋欽等[16]利用紫外-微波復(fù)合誘變技術(shù)提高云芝菌對煤的溶解效果;程開勇等[17]驗證微波和紫外2種方式對木霉T-YS菌株生長都具有明顯的影響。

枯草芽孢桿菌具有良好的生物活性,可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),抗逆性強,抗菌譜廣;亦可產(chǎn)生類似植物生長激素、細胞分裂素的物質(zhì)促進植物生長而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[18-19];申順善等[20]從化香根際土壤種分離到多粘類芽孢桿菌HK18-8并驗證該菌對辣椒炭疽病菌的防治效果達到88.58%;王波等[21]從大豆植株中篩選到的多粘類芽孢桿菌XZ-2對大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌均有較強的抑制作用。利用發(fā)酵配方優(yōu)化,可提高目標(biāo)菌株的活性物質(zhì)產(chǎn)量和活性,陳勝杰等[22]對玉米秸稈生產(chǎn)燃料乙醇的工藝優(yōu)化,乙醇質(zhì)量濃度提高到26.4 g/L;范佳碩等[23]對植物乳桿菌的發(fā)酵配方進行優(yōu)化,活菌數(shù)可達到3.9×109CFU/mL。本試驗采用紫外誘變技術(shù)對枯草芽孢桿菌XL05的原始菌株進行紫外誘變,以期篩選到抗真菌生物活性較高的突變株,并對抑菌效果最好的突變株的發(fā)酵配方進行初步優(yōu)化,以期更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

原始菌株為枯草芽孢桿菌XL05;病原菌為尖孢鐮刀菌;供試菌株均為本試驗室分離、鑒定和保存。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

PDA培養(yǎng)基:土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g (種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基不加),蒸餾水1 000 mL。

效價檢測培養(yǎng)基同PDA培養(yǎng)基一致。

1.2 方 法

1.2.1 液體菌種的制備

將原始菌株活化后刮取一定量的菌體至種子培養(yǎng)基中,溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,振蕩培養(yǎng)20 h。

1.2.2 效價公式計算

將尖孢鐮刀菌接種后培養(yǎng)10 d,制備孢子懸液,加入到效價檢測培養(yǎng)基中,調(diào)整活菌數(shù)為4×104～6×104CFU/mL,將該混合培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,制成復(fù)合平板。

發(fā)酵液效價的測定采用杯碟法(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)[24]。準(zhǔn)確稱取抗真菌活性物質(zhì)將其配制成質(zhì)量濃度5 g/L的水溶液,并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0 g/L,進行生物測定。根據(jù)抗真菌活性物質(zhì)質(zhì)量濃度與抑菌圈直徑的相對關(guān)系,以抗真菌活性物質(zhì)質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo),抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得出效價計算公式。

1.2.3 XL05菌株的紫外誘變

將XL05菌株活化后,加入適量生理鹽水,刮取菌苔,調(diào)整菌懸液活菌數(shù)為107～108CFU/mL,再將制備好的菌懸液進行紫外誘變。取不同照射時間的菌懸液涂布平板,按平板培養(yǎng)計數(shù)法計活菌數(shù),以未經(jīng)照射的菌懸液為對照,計算致死率,確定紫外誘變的最佳照射時間。致死率計算式為

1.2.4 誘變菌株的初篩

首先將誘變后的菌懸液稀釋一定倍數(shù),均勻涂布于添加少量該抗真菌活性物質(zhì)的固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后將平板上生長迅速、菌落直徑大的單株菌落挑出單獨培養(yǎng)。

1.2.5 誘變菌株的復(fù)篩

將初篩得到的單株菌液體振蕩發(fā)酵,重復(fù)2次,同時用原始菌做對照。發(fā)酵液高溫滅菌后,低速離心取上清液效價檢測,每株做3次重復(fù),選取效價比對照高的菌株。

1.2.6 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性測定

將復(fù)篩得到的高產(chǎn)菌株在培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)轉(zhuǎn)接5代,每代均進行發(fā)酵及效價檢測,每代做2次重復(fù),確定高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3 高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

刮取菌株ZW75接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)24 h。改變某一條件,并保持其他發(fā)酵條件不變,通過測量其效價,研究不同碳源、氮源和無機鹽對效價的影響。

1.3.1 不同碳源對效價的影響

分別將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的土豆(10%,20%,30%)、玉米粉(2%,4%,6%)、葡萄糖(2%,4%,6%)和乳糖(2%,4%,6%)加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,配制含不同碳源的培養(yǎng)基,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照,每種處理3個重復(fù),測定其效價。

1.3.2 不同氮源對效價的影響

分別按照0.2%的配制將蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏粉和硫酸銨加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照,每種處理3個重復(fù),測定其效價。

1.3.3 不同無機鹽對效價的影響

分別按照0.1%的配制將CaCO3,MgSO4,NaCL,K2HPO4和KH2PO4加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照,每種處理3個重復(fù),測定其效價。

1.3.4 發(fā)酵工藝的正交優(yōu)化

選取對抗真菌活性物質(zhì)效價影響顯著的單因素進行正交試驗設(shè)計,設(shè)計因素及水平如表1所示,每種處理2個重復(fù)。測定發(fā)酵液效價,驗證最佳發(fā)酵條件。

表1 因素與水平的設(shè)置

2 結(jié)果與分析

2.1 效價計算公式

通過對效價的生物測定,可得到發(fā)酵液效價計算公式,即

(1)

式中:Y為發(fā)酵液效價(μg/mL);x為抑菌圈直徑(12.0 mm

對抗真菌活性物質(zhì)或發(fā)酵液效價進行生物測定時,將待測樣品或發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù),測量并記錄抑菌圈直徑,將數(shù)值代入式(1),計算發(fā)酵液效價。

2.2 最佳誘變時間

計算經(jīng)紫外照射后,不同時間的菌株的致死率,并繪制致死曲線,如圖1所示。由圖1可看出:XL05菌株對紫外非常敏感,在20 s時致死率達到94.5%。為了保證較高的突變率,一般選擇致死率在74%～95%為最佳紫外誘變時間,因為致死率太低其誘變效果不理想,太高則負突率增加,所以選擇20 s作為紫外誘變時間。

圖1 UV誘變時間與致死率間的關(guān)系

2.3 誘變高產(chǎn)菌株的初篩

抗真菌活性物質(zhì)是目標(biāo)菌正常生長所產(chǎn)生的次生代謝物,過多的次生代謝物會影響目標(biāo)菌株的正常生長,能在含有一定量次生代謝物的培養(yǎng)基中生長,則說明該突變株能夠產(chǎn)生更多的次生代謝物,利用該篩選培養(yǎng)基,可以篩選到高產(chǎn)菌株。經(jīng)初篩后,共篩選到76株誘變株,劃線培養(yǎng),進行復(fù)篩。

2.4 誘變高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

復(fù)篩后,共得到發(fā)酵液效價高于原始菌株1倍以上的誘變高產(chǎn)菌株5株,菌株編號為ZW08,ZW19,ZW35,ZW58和ZW75,結(jié)果如圖2所示,其效價較原始菌株分別提高了1.25倍、1.40倍、1.35倍、1.38倍和1.36倍。

圖2 高產(chǎn)突變株的復(fù)篩結(jié)果

2.5 高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性

篩選獲得的5株高產(chǎn)突變株連續(xù)轉(zhuǎn)接5代,結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出:經(jīng)過連續(xù)5代后,ZW19的發(fā)酵液效價上下浮動最大為10.1%,ZW75的發(fā)酵液前后5代的效價變化浮動只有1.01%,各突變株的效價基本不變,遺傳性狀穩(wěn)定。

表2 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性

2.6 高產(chǎn)菌株發(fā)酵配方優(yōu)化

誘變得到的5株高產(chǎn)突變株,經(jīng)遺傳穩(wěn)定性實驗得知:遺傳性狀穩(wěn)定,尤其是ZW75菌株最穩(wěn)定,故選取其進行發(fā)酵配方的初步優(yōu)化。

2.6.1 不同碳源對菌株效價的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基因為選用的是PDA培養(yǎng)基,里面的主要成分也是土豆和葡萄糖,所以不同碳源對效價的影響不是很明顯,如圖3所示(其中碳源成分“土豆”簡稱“土”,“玉米粉”簡稱“玉”,“葡萄糖”簡稱“葡”,“乳糖”簡稱“乳”),葡萄糖對效價的影響略高,其添加量在4%時,效價最高,玉米粉、乳糖的影響略小。

圖3 不同碳源對效價的影響

2.6.2 不同氮源對菌株效價的影響

不同氮源對菌株效價的影響如圖4所示,蛋白胨和酵母浸膏粉能促進活性物質(zhì)的產(chǎn)生,蛋白胨作為氮源時產(chǎn)生的活性物質(zhì)的效價略高于酵母浸膏粉組,故選擇蛋白胨作為最佳氮源。

圖4 不同氮源對效價的影響

2.6.3 不同無機鹽對菌株效價的影響

無機鹽對菌株效價的影響如圖5所示,從圖5中可以看出:CaCO3對活性物質(zhì)的效價影響最大,其效價最高,故選擇CaCO3為最佳無機鹽。

圖5 不同無機鹽對效價的影響

2.6.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

對優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進行驗證,選擇葡萄糖、蛋白胨和碳酸鈣進行正交優(yōu)化,結(jié)果如表3所示。優(yōu)化后發(fā)酵效價可達到2 685.32 μg/mL,因此可確定該菌株的發(fā)酵工藝為葡萄糖4.0%、蛋白胨0.2%和CaCO30.1%,根據(jù)極差R的大小,對效價影響能力為葡萄糖>蛋白胨>CaCO3。

表3 正交優(yōu)化分析

3 結(jié) 論

筆者選取對核桃根腐病有拮抗作用的枯草芽孢桿菌XL05進行誘變及開展發(fā)酵配方優(yōu)化實驗。經(jīng)過初篩和復(fù)篩,得到5株較穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株,菌株編號為ZW08,ZW19,ZW35,ZW58,ZW75,其效價較原始菌株分別提高了1.25倍,1.4倍,1.35倍,1.38倍和1.36倍,且遺傳性狀穩(wěn)定;對ZW75突變株的發(fā)酵配方進行初步優(yōu)化,當(dāng)葡萄糖4.0%、蛋白胨0.2%和碳酸鈣0.1%時,發(fā)酵效價可達到2 685.32 μg/mL,根據(jù)極差R的大小,對效價影響能力為葡萄糖>蛋白胨>CaCO3。廣西河池市自2012年以來,利用當(dāng)?shù)靥赜械目λ固氐孛埠投嗌絽^(qū)優(yōu)勢,大力種植核桃,現(xiàn)已種植達到1 334 km2以上規(guī)模,極大地帶動了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟。隨著種植面積的不斷擴大,各種核桃病蟲害也隨即爆發(fā),核桃業(yè)的發(fā)展受到了嚴(yán)重影響。為了避免化學(xué)藥物對核桃及環(huán)境帶來污染,該實驗所得到的突變株發(fā)酵后,經(jīng)中試及田間試驗,可用于核桃根腐病的防治,為當(dāng)?shù)睾颂业纳锓乐翁峁┮粋€研究方向。