關建華 逯遙 朱曉勤，2 林久茂，2#

（1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院 福州350122；2 福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室 福州350122）

惡性腫瘤的浸潤轉移嚴重威脅著人類的健康[1]，淋巴轉移是腫瘤轉移的最常見方式。近年來研究發(fā)現(xiàn)，淋巴管生成是促使腫瘤的生長及發(fā)生淋巴轉移的前兆，也是預防癌癥轉移的治療靶點[2]，因此，通過抑制淋巴管生成從而達到抗腫瘤轉移已成為研究熱點[3]。有學者證實，人淋巴管內皮細胞（Human Lymphatic Endothelial Cell,HLEC）是腫瘤發(fā)生轉移的主要作用界面[4]，主要是通過誘導HLEC 增殖和管腔生成，為腫瘤淋巴轉移提供直接通道，最終發(fā)生向遠處擴散[5]。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤治療及預后中得到很大的運用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，清解扶正顆粒（Qingjiefuzheng Granules, QFG）可以抑制肝癌細胞[6～7]和大腸癌細胞[8～10]的增殖，還能夠減輕 5-FU 化療引起的腸道損傷作用[11～12]，并且可體外抑制血管生成[13]。然而，QFG 是否可以通過抑制淋巴管生成從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用尚不清楚，因此本研究對此進行了探索?，F(xiàn)報道如下：

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 HLEC 購于廣州吉尼歐生物技術有限公司。

1.2 藥物配置 QFG（由福建中醫(yī)藥大學藥學院制劑室提供），磷酸鹽緩沖液（PBS）配置成50 mg/ml的濃度，超聲助溶后使用孔徑0.45 μm 的過濾器進行過濾，放置于4℃冰箱內儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑耗材 ECM 培養(yǎng)基套裝（購于美國ScienCell 公司）；PBS（購于美國 Life technologies 公司）；DAPI 染色試劑盒（購于江蘇凱基生物技術股份有限公司）；結晶紫、四唑鹽[MTT（購于北京索萊寶科技有限公司）]；遷移小室（購于美國Corning 公司）；管腔試劑盒（購于美國Abcam 公司）。

1.4 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、多功能酶標儀（美國Thermo 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；全自動細胞計數(shù)儀（美國Life 公司）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica 儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) HLEC 采用ECM 完全培養(yǎng)基 [胎牛血清（fetal calf serum,FBS）25 ml、內皮細胞生長補充物（Endothelial Cell Growth supplements,ECGS）5 ml 和 青 霉 素 - 鏈 霉 素 溶 液 雙 抗（Penicillin-Streptomycin）5 ml]，置于 37℃、含 5%二氧化碳、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞活力檢測 運用MTT 法檢測細胞活力。取對數(shù)生長期的HLEC 按照1×105/ml 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，觀察細胞匯合度達到50%～60%時，加入 100 μl/孔含不同濃度 QFG（0、0.5、1.0、2.0 mg/ml）的培養(yǎng)液干預24 h，吸棄培養(yǎng)液，添加100 μl/孔 MTT（0.5 mg/ml）溶液繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄后加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl/ 孔，置于酶標儀（波長570 nm）中測定光密度（OD）值。細胞活力計算公式：細胞活力（%）=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%；

2.3 細胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的HLEC 按2×105/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，細胞匯合度達到50%～60%時，加入不同濃度 QFG（0、0.5、1.0、2.0 mg/ml）的培養(yǎng)液干預24 h，吸棄原培養(yǎng)基并用PBS 清洗，放置于倒置顯微鏡中觀察細胞的形態(tài)變化并拍照（200×）。

2.4 細胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期的HLEC 按照1×105/ml 的密度接種到12 孔板中。當細胞匯合度達到 50%～60%時，添加不同濃度 QFG（0、0.5、1.0、2.0 mg/ml）的培養(yǎng)液干預細胞24 h，隨后使用4%的多聚甲醛溶液固定10 min，DAPI 染色10 min，用PBS 清洗后用熒光顯微鏡（100×）拍攝。

2.5 細胞遷移實驗 HLEC 經不同濃度QFG（0、0.5、1、2 mg/ml）的培養(yǎng)液干預 24 h 后，吸棄原培養(yǎng)基，消化離心并收集細胞，用空白ECM 培養(yǎng)基重懸以調整細胞密度為2.5×105/ml，小室內加入200 μl重懸液（5×104個細胞），室外加入 700 μl 完全ECM 培養(yǎng)基，放入恒溫箱培育12 h 后進行處理，吸棄原培養(yǎng)基后使用4%多聚甲醛固定和結晶紫染色各10 min，晾置干燥后，放置于倒置顯微鏡鏡下隨機選取5 個視野拍照（100×）。

2.6 管腔形成實驗 冰上操作配置基質膠，并鋪置于48 孔板中，隨后置于恒溫培養(yǎng)箱中凝膠1 h；凝膠期間處理QFG 干預后的HLEC，按照4×104/孔接種于基質膠上，放置恒溫箱中孵育3 h 后置于倒置顯微鏡觀察并拍攝（100×）。

2.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，多組數(shù)據(jù)比較實用單因素變量分析，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學差異。

3 結果

3.1 QFG 對HLEC 的增殖能力的影響 MMT 法檢測細胞活力結果顯示，與正常組比較，QFG 干預后各組細胞活力均有不同程度的下降，活力值依次為（75.69±4.23）%、（65.68±4.35）%和 （4.76.66±2.46）%，說明QFG 對HLEC 細胞活力有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性，并具有統(tǒng)計學差異（*P＜0.05，#P＜0.01）。見圖 1。

圖1 QFG 對HLEC 的增殖能力的影響

3.2 QFG 對HLEC 細胞形態(tài)的影響 細胞形態(tài)觀察結果顯示，與正常組比較，不同濃度的QFG 干預后，HLEC 細胞密度逐漸減小，并出現(xiàn)細胞脫落。證實QFG 對HLEC 細胞形態(tài)有著改變作用，與對細胞活力的抑制正相關，呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖2。

圖2 QFG 對HLEC 細胞形態(tài)的影響

3.3 QFG 對HLEC 細胞凋亡的影響 DAPI 染色結果顯示，正常組的細胞存在細胞凋亡現(xiàn)象，正常組的凋亡率為（10.82±3.00）%，經不同濃度QFG 干預24 h 后，各組細胞呈現(xiàn)不同程度的凋亡現(xiàn)象，且隨著QFG 濃度增加，HLEC 細胞的凋亡率逐漸上升，其凋亡率分別為（24.26±2.41）%、（38.80±7.63）%和（69.51±9.72）%，說明 QFG 對 HLEC 細胞凋亡有促進作用，表現(xiàn)為濃度依賴性，且具有統(tǒng)計學差異（*P＜0.05，#P＜0.01）。見圖 3。

圖3 QFG 對HLEC 細胞凋亡能力的影響

3.4 QFG 對HLEC 細胞損傷修復能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，正常組HLEC 劃痕部位隨著時間延長，可以出現(xiàn)逐漸修復愈合，提示我們HLEC細胞自身具有損傷修復能力；不同濃度的QFG 干預HLEC 后，隨著QFG 藥物濃度的逐漸增加，HLEC細胞損傷修復能力逐漸降低，表明QFG 對HLEC細胞損傷修復能力的具有抑制作用。見圖4。

圖4 QFG 對HLEC 細胞損傷修復能力的影響（100×）

3.5 QFG 對HLEC 細胞遷移能力的影響 遷移實驗結果顯示，正常組細胞可以遷移成功，證明HLEC細胞自身具有遷移能力；經過QFG 干預后，QFG 0.5 mg/ml 組與 1 mg/ml 組的細胞遷移率分別為（72.93±2.48）%與（10.32±0.69）%，QFG 2 mg/ml 組完全抑制HLEC 細胞的遷移能力。結果表明，QFG對HLEC 遷移能力有抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性，與正常照組比較具有統(tǒng)計學差異（*P＜0.05，#P＜0.01）。見圖 5。

圖5 QFG 對HLEC 細胞遷移能力的影響

3.6 QFG 對HLEC 細胞管腔生成能力的影響 管腔生成實驗結果顯示，正常組HLEC 細胞有較多的管腔生成，提示HLEC 細胞自身具有較好的管腔生成能力；不同濃度的QFG 干預后，各組管腔生成率均得到完全抑制，與正常對照組比較具有顯著統(tǒng)計學差異（#P＜0.01）。結果表明，QFG 能夠對 HLEC 細胞管腔生成能力有抑制作用。見圖6。

圖6 QFG 對HLEC 細胞管腔生成能力的影響

4 討論

腫瘤的轉移擴散是癌癥發(fā)展的早期事件，從腫瘤淋巴管的轉移過程來看，主要是通過誘導腫瘤淋巴管生成，從而達到淋巴道轉移的目的。腫瘤淋巴管生成是轉移的重要環(huán)節(jié)，也就是淋巴道轉移的“開關點”[14]。目前，通過抑制淋巴管生成從而抑制腫瘤轉移是抗腫瘤轉移的研究熱點之一。然而，所謂淋巴管生成，是指在病理狀態(tài)下，設計多種成分和生長因子等參與的復雜過程，包含有人淋巴內皮細胞的增殖、遷移及管腔生成等過程[15～16]。HLEC 細胞的增殖、遷移及管腔生成促進了淋巴管生成，在淋巴管生成過程中，發(fā)揮著重要作用。因此，研究抑制淋巴管生成主要就是研究藥物干預對HLEC 細胞的增殖、遷移及管腔生成能力的影響情況。

清解扶正顆粒是由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成，具有清熱解毒、健脾補氣和益氣固表等功效，常用于治療多種消化道惡性腫瘤，減輕患者不良反應等。前期研究中，體內外實驗均證實QFG 能夠抑制腫瘤增殖、轉移及血管生成等，但抗腫瘤轉移中的機制需進一步闡明，因此通過研究淋巴管生成可探索QFG 抑制腫瘤轉移的作用機制。

本研究中，我們以HLEC 作為研究對象，采用不同濃度的QFG 進行干預，觀察QFG 對淋巴管生成的影響。MTT 實驗結果顯示，QFG 能夠抑制HLEC 細胞增殖，且具有濃度依賴性，同時可以改變HLEC 的細胞形態(tài)，二者呈現(xiàn)正相關；DAPI 染色實驗結果顯示，QFG 干預HLEC 細胞后，細胞凋亡水平逐漸增加，證實QFG 能夠促進HLEC 細胞凋亡。此外，細胞劃痕實驗及遷移實驗顯示，QFG 干預HLEC 后，HLEC 的細胞損傷修復及遷移能力均得到抑制，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。管腔生成是淋巴管生成最關鍵的過程，通過管腔生成實驗我們發(fā)現(xiàn)，QFG干預后，HLEC 細胞管腔生成能力得到顯著抑制，說明QFG 能夠抑制HLEC 的管腔生成能力。

綜上所述，QFG 能夠促進HLEC 細胞凋亡，抑制HLEC 細胞增殖、遷移及管腔生成能力，從而來達到抑制淋巴管生成的作用。然而QFG 作為中藥復方，所包含的成分十分復雜，同時淋巴管生成與淋巴結轉移的過程也是比較復雜的，需要在后續(xù)的研究中，通過多條淋巴管生成信號通路進行深入研究，以更加完善系統(tǒng)地探討QFG 抑制淋巴管生成的作用機制。