于 銳，張新茹，王丹丹，何 平，白 瑜，田 密，張蓓茹*

(1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 腎內(nèi)科,遼寧 沈陽 110004；2.沈陽市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院 腎內(nèi)科,遼寧 沈陽 110101)

近年來隨著放射診斷技術(shù)的進展與介入治療的廣泛應(yīng)用，碘對比劑(iodine contrast)使用明顯增加，盡管碘對比劑本身已不斷的改良，但對比劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN)仍頻頻發(fā)生。研究表明腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)不僅可以作為急慢性腎損傷的早期生物學標志物，而且也參與了腎臟病的損傷與修復過程[1]。本研究團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，對比劑腎病大鼠模型尿KIM-1水平在早期即明顯增加，可作為對比劑腎病早期的生物學標志物[2]，但KIM-1是否在對比劑腎病的發(fā)展中具有病理作用尚不明確。因此，本實驗通過體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞系HK-2，初步探索KIM-1是否參與對比劑腎病HK2細胞凋亡及其可能途徑，明確KIM-1在碘對比劑所致HK2細胞損傷中可能的病理作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人腎小管上皮細胞系HK-2以及KIM-1-siRNA、MCP-1引物(中國廣州吉妮歐公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS磷酸鹽緩沖液和Opti-MEM(Hycloe公司)；胰蛋白酶(Gbico公司)；DEMSO和HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(Sigma-Aldrich公司)；青霉素-鏈霉素溶液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、細胞膜蛋白與胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)；LipofecamineTM2000(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR相關(guān)試劑(TaKaRa公司)；碘海醇(iohexol)(通用電氣藥業(yè)上海有限公司)；KIM-1抗體(Abcam公司)；GAPDH抗體(Proteintech Group公司)；SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；Bax和Bcl-2抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細胞，取3～5代對數(shù)增殖期細胞進行實驗，各組實驗重復3次。進行細胞轉(zhuǎn)染時以5×105個細胞/孔將細胞接種于6孔板，細胞至70%～80%匯合時，更換無血清培養(yǎng)液同步化，依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細胞的分組:用10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將35 g/100 mL的碘海醇稀釋成與體內(nèi)使用對比劑后腎小管腔內(nèi)濃度一致的75 mg/mL工作液，處理HK-2細胞不同時間點(0、0.5、2、4和12 h)[3]，觀察不同時間點KIM-1的表達情況，以確定本實驗的最佳干預(yù)時間點。在觀察KIM-1在對比劑所致HK-2細胞損傷中的病理作用實驗中，將細胞分為對照組(A)，對比劑組(B)，對比劑+空載組(C)和對比劑+KIM-1-siRNA組(D)，75 mg/mL的碘海醇均在細胞轉(zhuǎn)染siRNA后24 h加入，加入后2 h收集細胞,并進行進一步實驗。

1.2.3 Western blot檢測KIM-1蛋白:收集不同組細胞，按照提取試劑盒說明書提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液并煮沸，取等量蛋白進行SDS-PAGE，進行半干法轉(zhuǎn)膜和5% BSA封閉1 h，按照抗體說明書推薦比例對一抗進行稀釋，在4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL發(fā)光液顯影，Image J圖像分析系統(tǒng)進行吸光度值分析。

1.2.4 Annexin V-FITC檢測細胞凋亡：收集不同組細胞1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS重懸細胞并計數(shù)，取5×104個重懸的細胞，再次1 000×g離心5 min，棄上清，加入195 μL annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，加入5 μL annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min。1 000×g離心5 min，棄上清，加入190 μL annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，混勻冰浴放置，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.5 MDA、SOD和ROS含量的測定：測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)時，收集不同組細胞上清液，分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法，按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。而測定活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量時，收集不同組細胞，采用流式細胞計量術(shù)利用熒光探針DCFH-DA按照試劑盒說明書步驟進行ROS測定。

1.2.6 RT-qPCR檢測MCP-1：收集不同組細胞,按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的濃度。取500 ng RNA按照cDNA合成試劑盒說明書步驟進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。隨后進行PCR擴增，引物設(shè)計如下：MCP-1上游引物：5′-GCAGAAGTGGGTTCAGGATT-3′，下游引物：5′-CAAGTCTTCGGAGTTTGGGT-3′。擴增完成后通過2-△△Ct法計算MCP-1的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 碘海醇導致HK-2細胞KIM-1表達增加

給予75 mg/mL碘海醇處理HK-2細胞不同時間，在2 h時KIM-1蛋白表達量最多，在4和12 h時KIM-1表達有所下降(圖1)。根據(jù)該結(jié)果確定碘海醇處理HK-2細胞2 h作為進一步實驗干預(yù)時間。

2.2 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染使碘海醇所致HK-2細胞KIM-1表達減少

給予75 mg/mL碘海醇處理HK-2細胞2 h，KIM-1蛋白表達明顯增多，但靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后能夠有效抑制KIM-1的表達(圖2)。

*P<0.05 compared with other group圖1 75 mg/mL碘海醇處理HK-2細胞不同時間KIM-1蛋白表達情況Fig 1 Expression of KIM-1 protein in HK-2 cells treated with iohexol at different

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖2 75 mg/mL碘海醇處理HK-2細胞2 h時各組細胞KIM-1蛋白表達情況Fig 2 Expression of KIM-1 protein in HK-2 cells treated with iohexol for 2 hours

2.3 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染能夠減輕碘海醇所致HK-2細胞的凋亡

HK-2細胞給予碘海醇處理2 h后，HK-2細胞發(fā)生明顯凋亡，而給予靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后，HK-2細胞凋亡程度明顯減輕(P<0.05)(圖3)。碘海醇使Bax表達增加，Bcl-2表達降低，而靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后，相比較空載組Bax表達下降，而Bcl-2蛋白表達上升(P<0.05)(圖4)。

2.4 KIM-1可能通過促進氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)參與碘海醇所致HK-2細胞凋亡

碘海醇處理HK-2細胞2 h后(圖5)，與對照組比較，MDA、ROS水平明顯上升，而SOD水平下降，同時MCP-1表達增加(P<0.05)。而給予靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后，上述改變均得到部分糾正，在碘海醇處理下，siRNA組較空載組HK-2細胞MDA、ROS水平有所下降，SOD水平上升，同時MCP-1表達下降(P<0.05)。

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖3 流式細胞計量術(shù)評估HK-2細胞凋亡程度Fig 3 Assessment of apoptotic degree of HK-2 cells by flow

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖4 Western blot方法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達評估HK-2細胞凋亡程度Fig 4 Expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by Western blot to evaluate the apoptotic degree of HK-2 n=3)

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖5 MDA、ROS和SOD評估HK-2細胞氧化應(yīng)激，MCP-1評估HK-2細胞炎性反應(yīng)Fig 5 MDA,ROS and SOD assessed oxidative stress in HK-2 cells,and MCP-1 assessed inflammatory response in HK-2 n=3)

3 討論

KIM-1是新近發(fā)現(xiàn)的在腎小管上皮細胞表達的一種 Ⅰ 型跨膜蛋白。目前可以通過檢測尿液中KIM-1的水平來反映腎小管損傷程度，在臨床中也將KIM-1作為各種原因引起的急性腎小管損傷的早期敏感生物標志物[4-5]。對比劑腎病是臨床中常見的急性腎損傷的病因，目前仍然以肌酐水平的升高來診斷，筆者團隊在動物模型中證實KIM-1是反映對比劑腎病(CIN)早期生物標志物[3]。在臨床中也得到同樣的結(jié)論[6]。

KIM-1在腎臟的生理功能以及病理作用仍不明確，但是越來越多的證據(jù)支持KIM-1的早期表達不僅僅是反映腎小管急性損傷的生物標志物，而是參與了腎臟疾病的進展[7-8]。在一項納入4 739例患者，平均隨訪16.6年的研究中發(fā)現(xiàn)基線血清KIM-1水平與eGFR下降速率呈明顯正相關(guān)，而且伴隨著基線KIM-1水平的增加，在隨訪期間因腎功能衰竭住院風險也明顯增加[9]。研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)缺血/再灌注急性腎損傷大鼠模型尿KIM-1水平與進展至慢性期腎小管間質(zhì)纖維化的程度呈密切相關(guān)性[10]。建立持續(xù)在腎小管上皮細胞表達KIM-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)即使在沒有外界任何促進腎小管間質(zhì)損傷的因素存在下，4周后轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)出現(xiàn)腎臟炎性反應(yīng)和腎小管間質(zhì)纖維化，且進行性加重[11]。本研究中也進一步證實在碘海醇刺激下KIM-1表達增加不僅僅是細胞損傷的生物標志物，而且參與了細胞凋亡的過程，具有重要的病理作用。

KIM-1通過何種途徑參與腎臟病機制尚不十分明確，促進腎臟局部炎性反應(yīng)被認為是重要的機制之一[11]。近些年研究提示炎性反應(yīng)過程也參與了對比劑所致的腎損傷過程[12]。在本研究中主要通過評估KIM-1表達的抑制對碘海醇所致HK-2細胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響進一步探討KIM-1參與對比劑腎病發(fā)病的可能機制，結(jié)果證實KIM-1可能部分通過促進炎性反應(yīng)進而參與對比劑所致腎臟損傷過程。

綜上所述，本研究初步探討了在對比劑所致腎小管上皮細胞損傷過程中KIM-1的病理作用，研究結(jié)果提示KIM-1在對比劑干預(yù)下的高表達可能通過促進腎小管上皮細胞的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)而參與細胞損傷過程。這一研究結(jié)果更進一步證實了KIM-1不僅僅是對比劑腎病(CIN)的早期生物標志物，而且參與到病理過程中，對KIM-1進行干預(yù)可能成為臨床預(yù)防或治療對比劑腎病的有效手段，為將來有效防治對比劑腎病(CIN)提供理論基礎(chǔ)。