劉敏，殷浩文，王綠平，王櫻芝，沈璐,朱慧

上海市檢測(cè)中心生物與安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

安乃近具有較強(qiáng)的解熱鎮(zhèn)痛功效，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)大量用于臨床治療。但是該藥具有較嚴(yán)重的毒副作用，比如，再生性貧血等，逐漸退出臨床用藥。發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)等禁止該藥用于食源性動(dòng)物中。歐盟規(guī)定其在肌肉中的限量為200 μg·kg-1[1]。在我國(guó)，安乃近由于價(jià)格低廉，仍大量用于豬、牛等食源性動(dòng)物疾病防控。2002年，我國(guó)也將其列入限制清單，規(guī)定其在食源性動(dòng)物組織中的限量為200 μg·kg-1[2]。

安乃近具有快速水解特性，水解產(chǎn)物4-甲氨基安替比林(MAA)，安乃近的藥理作用主要通過(guò)MAA產(chǎn)生。MAA的代謝產(chǎn)物主要為4-甲酰氨基安替比林(FAA)和4-氨基安替比林(AA)，AA繼續(xù)代謝，并最終代謝為4-乙酰氨基安替比林(4-AAA)[3]。早在1967年，Banerjee等[4]發(fā)現(xiàn)奶牛的血漿和尿液中存在大量的4-AAA。Martínez-Piernas等[5]發(fā)現(xiàn)廢水中4-AAA濃度高達(dá)1.46 μg·L-1。采用此廢水澆灌的蘿卜和萵筍中的濃度為0.08～1.13 ng·g-1。Wiegel等[6]在歐洲中部的Elbe河中普遍檢測(cè)出高水平的4-AAA，其最高濃度達(dá)939 ng·L-1。筆者之前的研究也發(fā)現(xiàn)，在上海市水源中，4-AAA濃度高達(dá)344 ng·L-1[7]。

然而，目前缺乏有關(guān)4-AAA的生態(tài)毒性報(bào)道，無(wú)法對(duì)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。為此本研究采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法，從3個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)水平，選取典型試驗(yàn)生物藻、大型溞和魚(yú)，對(duì)其毒性效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，為后續(xù)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

電子分析天平(Mettler Toledo AL204，梅特勒-托利多集團(tuán)，瑞士)，電子分析天平(Mettler Toledo ME204E/02，梅特勒-托利多集團(tuán)，瑞士)，智能光照空氣恒溫振蕩器(TS-211GZ，常州恒隆儀器有限公司，中國(guó))，細(xì)胞顆粒計(jì)數(shù)器(Casy TT，Innovatis公司，德國(guó))，手持式pH計(jì)(HANNA HI98128，哈納公司，意大利)，照度計(jì)(KIMO LX100，凱茂公司，法國(guó))，偏光顯微鏡(Zeiss Axio Scope.A1，卡爾蔡司公司，德國(guó))，溶解氧測(cè)定儀(Oxi7310，WTW公司，德國(guó))，超高效液相色譜儀(Waters AcquityTMH-class/PDA eλDetection，沃特世公司，美國(guó))，恒溫水浴槽(自制)。4-乙酰氨基安替比林，純度97%，購(gòu)自百靈威(中國(guó))；甲醇為色譜級(jí)，購(gòu)自西格瑪公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)生物

近頭狀偽蹄形藻引自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。藻在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，試驗(yàn)前，在試驗(yàn)條件下培養(yǎng)藻細(xì)胞3 d，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，藻細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，濃度為1.09×106個(gè)·mL-1。2018年6月1日，用參比樣品重鉻酸鉀進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)，得72 h-ErC50值為1.00 mg·L-1(0.92～1.28 mg·L-1)，在可接受范圍之內(nèi)((1.10±0.48) mg·L-1)[8]。

大型溞原種是引自MicroBioTests Inc.的大型溞休眠卵。試驗(yàn)用大型溞為實(shí)驗(yàn)室自行繁育的大型溞，經(jīng)孤雌繁殖后所得的是溞齡小于24 h的非頭胎幼溞。其各世代大型溞均飼養(yǎng)于Elendt M4中，投喂柵藻(Desmodesmussubspicatus)和近頭狀偽蹄型藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)，每日一次，每個(gè)成體每日0.1～0.2 mg有機(jī)碳。2018年9月，用參比樣品重鉻酸鉀進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)。重鉻酸鉀的24 h-EC50為1.42 mg·L-1，在可接受的范圍內(nèi)(0.6～2.1 mg·L-1)[9]。

稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)由上海市檢測(cè)中心生物與安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自行繁育。試驗(yàn)魚(yú)在試驗(yàn)條件下已馴養(yǎng)14 d以上。馴養(yǎng)條件為：活性炭過(guò)濾、紫外滅菌的自來(lái)水，同時(shí)也用作試驗(yàn)用水；21～25 ℃，變化不超過(guò)2 ℃；pH范圍為6.0～8.5；溶解氧濃度>80% ASV(即大于空氣中飽和氧含量的80%)；光照周期L∶D=12 h∶12 h；每天喂食豐年蝦薄片，試驗(yàn)開(kāi)始前24 h停止喂食。馴養(yǎng)期間未發(fā)現(xiàn)疾病。試驗(yàn)開(kāi)始前7天內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)死亡率為0%。2018年6月，用參比樣品重鉻酸鉀進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)。重鉻酸鉀對(duì)稀有鮈鯽的96 h-LC50值為257 mg·L-1(95%置信限為207～309 mg·L-1)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)(82.2～310 mg·L-1)。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

4-AAA的水生急性毒性通過(guò)藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)[10]、大型溞活動(dòng)抑制試驗(yàn)[11]以及魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)[12]進(jìn)行評(píng)估。

1.3.1 溶液制備

稱取一定量的樣品直接溶解于各試驗(yàn)用水中，避光連續(xù)磁力攪拌72 h，產(chǎn)生漩渦高度為樣品液柱高度的1/3，經(jīng)0.45 μm硝酸纖維素膜過(guò)濾后配制成濃度為1 500 mg·L-1或3 000 mg·L-1的樣品母液。用試驗(yàn)用水稀釋樣品母液，配制成各濃度的試驗(yàn)溶液。

1.3.2 藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，1 500 mg·L-14-AAA暴露條件下，未觀察到明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象；因此，以1 500 mg·L-1的配制濃度進(jìn)行限度試驗(yàn)，試驗(yàn)溶液體積100 mL，每組設(shè)6個(gè)平行。以藻類培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，設(shè)6個(gè)平行。藻細(xì)胞初始濃度約為104個(gè)·mL-1，試驗(yàn)持續(xù)72 h。試驗(yàn)條件為：22.8～23.1 ℃；培養(yǎng)基表面保持連續(xù)光照，光照強(qiáng)度4 988～5 554 lux；0 h和72 h，試驗(yàn)溶液pH范圍分別為8.01～8.02和9.12～9.16。在試驗(yàn)開(kāi)始后0、24、48和72 h，從各樣品組中選取1個(gè)容器，從中各取2 mL試驗(yàn)溶液用于濃度分析。試驗(yàn)開(kāi)始后0、24、48和72 h，對(duì)各試驗(yàn)容器內(nèi)的藻類數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 溞類急性運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，1 000 mg·L-1的4-AAA對(duì)大型溞的活動(dòng)存在明顯抑制；因此，開(kāi)展系列濃度暴露的正式試驗(yàn)。試驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)得樣品母液(3 000 mg·L-1)pH值為6.78，不需要調(diào)節(jié)pH。用Elendt M4稀釋樣品母液，配制成各濃度試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組和5個(gè)暴露組，暴露組的配制濃度分別為188、375、750、1 500和3 000 mg·L-1。各組均設(shè)置4個(gè)平行，各平行試驗(yàn)樣品體積為250 mL，試驗(yàn)持續(xù)48 h，試驗(yàn)方式為靜態(tài)。試驗(yàn)用水硬度為145 mg·L-1；pH值6.68～7.01；溫度20.1～20.5 ℃；溶解氧濃度7.03～8.31 mg·L-1；光照周期L∶D=16 h∶8 h；每個(gè)平行5只溞，試驗(yàn)期間不飼喂。在0、24和48 h分別觀察并記錄試驗(yàn)幼溞的活動(dòng)抑制數(shù)。在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)從空白對(duì)照組和樣品組各選取1個(gè)容器分別取20 mL試驗(yàn)溶液進(jìn)行樣品濃度分析。

1.3.4 魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，1 500 mg·L-1暴露條件下，魚(yú)未發(fā)生死亡現(xiàn)象。以1 500 mg·L-1的配制濃度進(jìn)行限度靜態(tài)試驗(yàn)，試驗(yàn)溶液體積4 L。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，不設(shè)平行。在每個(gè)試驗(yàn)組容器中分別放入10尾試驗(yàn)魚(yú)，試驗(yàn)持續(xù)96 h，試驗(yàn)期間不喂食。承載量約0.5 g·L-1(以魚(yú)體質(zhì)量計(jì))。溫度21.8～22.4 ℃；光照周期L∶D=12 h∶12 h；溶解氧為84.4%～91.2% ASV；pH 7.03～7.57。試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束，分別從暴露組和空白組各取2 mL試驗(yàn)溶液用于濃度分析。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)魚(yú)體長(zhǎng)為(2.4±0.1) cm(Mean±SD)，體重為(0.24±0.04) g(Mean±SD)。

1.4 化學(xué)分析

采用超高效液相色譜對(duì)試驗(yàn)溶液進(jìn)行分析。首先對(duì)各試驗(yàn)介質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的方法驗(yàn)證，主要包括線性范圍、回收率、精密度、檢測(cè)限和定量限。試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，樣品測(cè)試中均添加加標(biāo)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。分析條件如下：色譜柱為BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm；流動(dòng)相流速0.4 mL·L-1，流動(dòng)相為甲醇(A)和水(B)，梯度洗脫程序?yàn)槌跏急壤齎甲醇∶V水=98∶2，保持0.5 min，2 min內(nèi)甲醇含量增加到30%，保持3 min，0.5 min之內(nèi)回到起始點(diǎn)并平衡1.5 min。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用t-Test比較樣品組與空白對(duì)照組之間的平均特定生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)量的差異，從而獲取無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)和最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)值。采用Maximum Likelihood-Probit進(jìn)行濃度效應(yīng)擬合，計(jì)算效應(yīng)濃度(ECx)。數(shù)據(jù)分析用軟件Toxcalc v5.0.32完成。

2 結(jié)果與討論(Results and disscussion)

2.1 濃度分析

對(duì)藻、溞和魚(yú)試驗(yàn)各試驗(yàn)基質(zhì)中的分析方法均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的方法驗(yàn)證。線性范圍為0.0535～1.07 mg·L-1，線性方程為Y=1.07×104X+33.8，相關(guān)系數(shù)為0.9999?？瞻拙淮嬖诟蓴_，0.0642 mg·L-1和0.856 mg·L-1藻、溞和魚(yú)基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率分別為97.0%和96.3%、95.6%和95.1%、98.1%和99.5%；對(duì)應(yīng)的精密度分別為1.49%和0.46%、0.84%和0.33%、1.30%和0.58%。方法檢測(cè)限和定量限均為0.0268 mg·L-1和0.0535 mg·L-1。質(zhì)量控制樣品的回收率為99.8%～104%。

藻類抑制試驗(yàn)、大型溞活動(dòng)抑制試驗(yàn)和魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)中，各試驗(yàn)溶液的樣品實(shí)測(cè)濃度與配制濃度偏差均小于20%，分別-2.47%～2.80%、-8.27%～0.00%和2.00%～2.13%(表1)。

2.2 毒性效應(yīng)

2.2.1 藻類生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

空白對(duì)照組藻細(xì)胞濃度從1×104個(gè)·L-1增加到1.14×106個(gè)·L-1，增加至114倍(表2)；平均特定生長(zhǎng)率1.58 d-1，空白對(duì)照組各時(shí)間段特定生長(zhǎng)率的變異系數(shù)平均值為19.7%(表3)；整個(gè)試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組各平行的平均特定生長(zhǎng)率的變異系數(shù)為2.31%。整個(gè)試驗(yàn)滿足OECD 201質(zhì)量控制要求[10]。

暴露組藻細(xì)胞濃度從1×104個(gè)·L-1增加到1.10×106個(gè)·L-1，增加至110倍；跟對(duì)照組相比，生長(zhǎng)量抑制率為-13.5%～13.7%(表2)。平均特定生長(zhǎng)率1.59 d-1，空白對(duì)照組各時(shí)間段特定生長(zhǎng)率的變異系數(shù)平均值為17.6%；跟空白對(duì)照組進(jìn)行比較，特定生長(zhǎng)率抑制率為-2.53%～3.16%，平均抑制率僅為0.63%(表3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，4-AAA對(duì)近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)的72 h生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，若以平均特定生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)量表示，72 h-NOEC均≥1 502 mg·L-1，LOEC、EC10及EC50均>1 500 mg·L-1。

2.2.2 大型溞活動(dòng)抑制效應(yīng)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組大型溞活動(dòng)受抑制率為0%，試驗(yàn)溶液的溶解氧濃度最低值為7.62 mg·L-1。滿足OECD 202試驗(yàn)所有質(zhì)控要求[11]。

整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，375 mg·L-1及以下濃度組在試驗(yàn)期間未觀察到明顯的活動(dòng)抑制。但24 h后，750 mg·L-14-AAA暴露組，3只大型溞出現(xiàn)活動(dòng)抑制，1 500 mg·L-1的暴露組，抑制數(shù)量達(dá)到11只，而最高暴露組中，80%的大型溞的運(yùn)動(dòng)能力明顯受到抑制。暴露48 h后，抑制率明顯增加，750 mg·L-1組，運(yùn)動(dòng)能力受抑制的數(shù)量增加到8只，而1 500 mg·L-1和3 000 mg·L-1暴露組的抑制率分別達(dá)到70%和95%(圖1)。

圖1 不同4-乙酰氨基安替比林(4-AAA)暴露濃度下大型溞的活動(dòng)抑制率Fig. 1 Mobility inhibition rate of daphnia when exposed to different concentrations of 4-acetamidoantipyrine (4-AAA)

表1 樣品的濃度分析結(jié)果Table 1 The results of samples analysis

表2 72 h內(nèi)藻的生長(zhǎng)量Table 2 Yield of alga in 72 h

濃度效應(yīng)擬合曲線(圖2)分析結(jié)果表明，對(duì)大型溞(Daphniamagna)活動(dòng)抑制的24 h-EC50值為1 538 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1 217～2 017 mg·L-1；48 h-EC50值為1 041 mg·L-1，95%置信區(qū)間為834～1 304 mg·L-1。

2.2.3 魚(yú)類急性致死效應(yīng)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組魚(yú)無(wú)死亡現(xiàn)象。試驗(yàn)溶液的溶解氧為79.1%～91.3% ASV。滿足OECD 203試驗(yàn)所有質(zhì)控要求[12]。

試驗(yàn)過(guò)程中，暴露組試驗(yàn)魚(yú)均未出現(xiàn)死亡和異常行為。試驗(yàn)溶液中樣品實(shí)測(cè)濃度的幾何平均值為1 531 mg·L-1。因此，4-AAA對(duì)魚(yú)類無(wú)急性毒性，96 h-LC50為≥1 531 mg·L-1。

Zhou等[13]采用ECOSAR軟件估算其對(duì)藻和魚(yú)的急性毒性，測(cè)算得到的EC50和LC50分別為2.53 mg·L-1和6.05 mg·L-1。這可能是由于ECOSAR數(shù)據(jù)庫(kù)中與4-AAA結(jié)構(gòu)類似的化合物數(shù)據(jù)較少，導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果偏差較大。Gong等[14]的研究表明，其母體化合物安替比林及其催化降解產(chǎn)物對(duì)普通小球藻(Chorellavulgaris)在1～50 μmol·L-1范圍內(nèi)沒(méi)有抑制效應(yīng)。另外，催化降解過(guò)程中，隨著安替比林的降解，對(duì)豐年蝦(Artemiasalina)的致死效應(yīng)降低。這表明，其降解產(chǎn)物毒性下降。

2.3 分類及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度(GHS)分類[15]，急性毒性終點(diǎn)>100 mg·L-1，無(wú)明顯急性毒性，急性毒性不歸類。根據(jù)歐盟風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估導(dǎo)則，獲得3個(gè)急性毒性數(shù)據(jù)的情況下，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估因子為1 000[16]。選取急性毒性最大的終點(diǎn)值，即大型溞活動(dòng)抑制的48 h-EC50為1 041 mg·L-1，由此計(jì)算4-AAA的預(yù)計(jì)無(wú)效應(yīng)濃度(PNEC)為1.04 mg·L-1。其類似物4-甲基氨基-安替比林的PNEC為961 μg·L-1[17]。筆者列出了國(guó)內(nèi)外地表水中4-AAA的濃度(表4)。將地表水的測(cè)試濃度除以PNEC得到風(fēng)險(xiǎn)商值(RCR)。由表4可知，我國(guó)地表水中由4-AAA引起的風(fēng)險(xiǎn)值處于較低水平。盡管歐洲污水受納河中4-AAA高達(dá)3 675 ng·L-1，其最大風(fēng)險(xiǎn)值為3.53×10-3，表明風(fēng)險(xiǎn)較低。由此判斷，水中4-AAA污染引起的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)較低。北京的生活污水處理廠的出水中4-AAA濃度達(dá)1 300～2 240 ng·L-1[18]。西班牙的污水處理廠出水中4-AAA更是高達(dá)25 μg·L-1[19]。Shao等[20]采用Toolox軟件計(jì)算的方法篩選基因毒性化合物，認(rèn)為4-AAA具有潛在的基因毒性。同時(shí)檢測(cè)出基因毒性的地表水中也鑒別出了4-AAA。因此，盡管從現(xiàn)有的測(cè)試數(shù)據(jù)來(lái)看，生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)較小，但仍需關(guān)注其對(duì)地表水的影響。因?yàn)?，現(xiàn)有的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)有限，評(píng)估存在較大的不確定性，后續(xù)需關(guān)注其慢性毒性。

表4 地表水中4-AAA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Table 4 Risk assessment of 4-AAA in surface water