高美琪，林鶴，于娜，劉兆泉，任利翔,*

1. 沈陽化工研究院有限公司安全評價中心，沈陽 110021 2. 沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016

環(huán)境中的各種化學物質(zhì)可通過不同途徑進入人體。肝臟作為主要的代謝器官無疑最易受到損害。如何快速、準確和多維度地進行化學物質(zhì)肝臟毒性篩選，對于化學品環(huán)境風險防控具有重要意義。

化學物質(zhì)可通過多種作用機制誘導肝損傷[1-2]，主要包括：破壞鈣離子平衡和細胞膜損傷、膽汁淤積和膽小管損傷、激活經(jīng)肝藥酶代謝、激活自身免疫、激活細胞凋亡和線粒體損傷等[3]。事實上，這些機制不是完全孤立存在的，細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)對細胞的生存極為重要，鈣離子跨膜內(nèi)流會聚集在線粒體，引起線粒體膜電位降低，進而產(chǎn)生大量氧自由基，最后導致線粒體和肝細胞的脂質(zhì)過氧化損傷[4-5]。

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)是指在保持細胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時檢測被篩化合物對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導各個環(huán)節(jié)的影響，在單一實驗中獲取大量與基因、蛋白及其他細胞成分相關(guān)的信息，確定其生物活性和潛在毒性的過程。高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)彌補了毒理學篩選系統(tǒng)在通量、毒性機制檢測和潛在毒性揭示等方面的不足，為化學物質(zhì)的毒理學研究提供了新的有效的技術(shù)。近年來，高內(nèi)涵能夠?qū)崟r、動態(tài)監(jiān)測體外肝細胞毒性的多個參數(shù)、毒理學相關(guān)機制，是評估候選化學物質(zhì)肝細胞毒性和預(yù)測化學物質(zhì)肝臟毒性的有效手段[6-7]。根據(jù)肝損傷的發(fā)生機制，高內(nèi)涵檢測的熒光探針主要包括：Hoechst 33342、DCFH-DA、MitoTrackerDeep Red FM、mBBr和DIOC6(3)等，它們分別用來檢測細胞核的損傷、細胞內(nèi)活性氧的水平、線粒體膜電位的情況、谷胱甘肽含量和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷程度等[8-9]。

人源肝癌細胞系HepG2具有正常肝細胞的很多功能和特點，保留了較完整的生物轉(zhuǎn)化酶體系，敏感性高，與原代肝細胞及HepRG細胞相比更為穩(wěn)定、成熟，被認為是體外肝細胞篩選的理想模型之一。而L-02細胞是人正常肝細胞系，沒有癌變細胞的特征，功能表達完整，可以傳代培養(yǎng)，已經(jīng)大量應(yīng)用在體外肝毒性篩選過程中[10]。因此，本研究通過以HepG2細胞和L-02細胞為對象，建立2種肝損傷體外篩選模型，并比較2種細胞預(yù)測肝損傷的能力，選出更有優(yōu)勢的體外篩選模型。

環(huán)境中存在的化學物質(zhì)導致的肝損傷是不容忽視的問題，且其篩選模型仍然是目前研究的熱點。大多數(shù)篩選模型只以單一參數(shù)為判斷標準，缺乏準確性。而目前還沒有合適的體外篩選模型和篩選方法能夠有效地篩選出具有肝損傷風險的化學物質(zhì)，所以建立適宜的肝損傷篩選模型尤為重要。本研究選取2種肝細胞、5種陽性藥及3種陰性藥，首先用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)考察不同藥物對2種細胞體外的生長抑制作用，并且采用高內(nèi)涵檢測法考察2種細胞預(yù)測肝損傷的能力，并采用實時定量PCR法比較了2種細胞的藥物代謝酶含量。理論上，可以通過比較2種細胞對陽性藥的敏感性、預(yù)測肝損傷機制的準確性以及人體肝藥酶水平的含量選出最適宜的細胞模型。希望通過這些研究，可以為環(huán)境中能夠?qū)е赂味拘曰瘜W成分的發(fā)現(xiàn)和篩選以及其肝損傷機制的確定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞株

本實驗所使用的細胞系為HepG2人源肝癌細胞系和L-02人源正常肝細胞系，均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要儀器與試劑

鹽酸胺碘酮(99.9%)、鹽酸四環(huán)素(97.5%)、利福平(99.9%)和地塞米松(99.7%)購自中國食品藥品檢定研究院；雙氯芬酸鈉(99.0%)、他莫昔芬(99.0%)和DIOC6(3)(98.0%)熒光探針購自aladdin公司；檸檬酸三鈉(99.0%)購自西隴化工股份有限公司；抗壞血酸(99.0%)、二甲基亞砜(99.7%)、噻唑藍(98.0%)和mBBr(99.0%)熒光探針購自Sigma公司；Hoechst 33342、DCFH-DA熒光探針和SYBR Green qPCR Mix(2×)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；MitoTrackerDeep Red FM熒光探針購自Yeasen公司。

多功能酶標儀(Synergy HT，美國Bio-Tek公司)，高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(CELLINSIGHT CX7，美國Thermo公司)，實時定量PCR儀(C 1000TM Thermal Cycler，美國BIO-RAD公司)，超微量核酸蛋白測定儀(NANO DROP 2000C，美國Thermo公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法檢測不同肝毒性化學物質(zhì)對2種細胞的生長抑制作用

將處于對數(shù)生長期的細胞以密度為6 000個·孔-1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。次日，每孔加入不同濃度的受試物溶液，每個濃度設(shè)置3個復孔，使其最大濃度均為1 000 μmol·L-1(即鹽酸胺碘酮682 mg·L-1，鹽酸四環(huán)素444 mg·L-1，雙氯芬酸鈉296 mg·L-1，利福平823 mg·L-1，他莫昔芬372 mg·L-1，檸檬酸鈉294 mg·L-1，抗壞血酸176 mg·L-1，地塞米松392 mg·L-1)，并依次3倍向下稀釋4個濃度。然后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法檢測各孔吸光度，并計算各濃度受試物對細胞生長的抑制作用，用SPSS 20.0軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.2 高內(nèi)涵檢測肝毒性機制相關(guān)參數(shù)的變化

以3種熒光探針的組合方式進行高內(nèi)涵試驗。分別為Hoechst 33342(藍色)/DCFH-DA(綠色)/MitoTrackerDeep Red FM(紅色)；Hoechst 33342(藍色)/DIOC6(3)(綠色)；mBBR(綠色)3種。

將處于對數(shù)生長期的細胞以5 000 個·孔-1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，次日，每孔加入不同濃度的受試物，每個濃度設(shè)置3個復孔。肝毒性陽性化學物質(zhì)(簡稱陽性物)鹽酸胺碘酮、雙氯芬酸鈉、利福平、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬作用的最大濃度均約為IC50值，依次以2倍濃度梯度向下再稀釋4個濃度。肝毒性陰性化學物質(zhì)(簡稱陰性物)檸檬酸三鈉、抗壞血酸和地塞米松的給藥濃度與MTT法相同。然后，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h用于檢測。檢測時，棄去培養(yǎng)板內(nèi)的液體，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次，棄去PBS后，在96孔板中每孔加入50 μL不同熒光探針混合液，37 ℃避光孵育20 min。孵育結(jié)束后棄去96孔板內(nèi)液體，用PBS清洗一次后每孔再加入50 μL PBS，將96孔板置于高內(nèi)涵儀器中掃板檢測，得到每個孔不同參數(shù)的平均熒光強度值，并根據(jù)各個參數(shù)陰性物與空白對照組平均熒光強度的比值計算出陰性閾。

其中，對于呈劑量依賴性增加的指標，忽略陰性閾的下限，按式(1)計算陰性閾：

陰性閾=熒光強度比值的平均值+熒光強度

比值的標準差

(1)

對于呈劑量依賴性減少的指標，忽略陰性閾的上限，按式(2)計算陰性閾：

陰性閾=熒光強度比值的平均值-熒光強度

比值的標準差

(2)

各機制參數(shù)的精確度、靈敏度和準確度計算方法為：

精確度 = (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN)

(3)

靈敏度 = TP/(TP + FN)

(4)

特異度 = TN/(TN + FP)

(5)

式中：TP表示與陽性物已知肝毒性機制相關(guān)的參數(shù)變化為陽性的個數(shù)；FP表示與陽性物已知肝毒性機制相關(guān)的參數(shù)變化為陰性的個數(shù)；TN表示與陰性物已知肝毒性機制相關(guān)的參數(shù)變化為陰性的個數(shù)；FN表示與陰性物已知肝毒性機制相關(guān)的參數(shù)變化為陽性的個數(shù)。

1.3.3 實時定量PCR法檢測細胞肝毒性化學成分的代謝酶mRNA的相對表達含量

將處于對數(shù)生長期的細胞以20萬個·孔-1接種于6孔板中，24 h后從CO2培養(yǎng)箱中取出，胰酶消化后離心收集細胞于離心筒中，用1 mL PBS重懸后轉(zhuǎn)移至無酶的1.5 mL EP管中，3 000 r·min-1離心10 min后棄去上清。參照說明書操作步驟提取總RNA，核酸測定儀在波長260 nm和280 nm測定吸光度A260和A280，以上述總RNA為模板，參照說明書操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA于-20 ℃保存。

參照說明書設(shè)定PCR程序，每個樣本設(shè)3個重復管。根據(jù)2-ΔΔCT法計算出每個目的基因的相對表達含量。本研究所用到的引物序列如表1所示。

1.3.4 統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理

所有實驗結(jié)果來源于至少3次獨立重復試驗，并表示為mean ± SD，精確度、靈敏度和特異度實驗結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行秩和檢驗，其他實驗結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同肝毒性化學成分對2種細胞的生長抑制作用

通過MTT法評價了8種化合物對2種細胞的生長抑制作用(表2)。結(jié)果表明，5種陽性物對2種細胞均呈現(xiàn)出不同程度的體外生長抑制作用，且L-02細胞的IC50值均不同程度地小于HepG2細胞。而陰性物并無抑制作用或者僅有輕度的抑制作用。

2.2 高內(nèi)涵檢測不同肝毒性的化學成分對2種細胞肝損傷機制相關(guān)參數(shù)的影響

各陽性物以IC50近似值為最大給藥濃度作用于2種細胞時，6種與肝毒性機制相關(guān)的參數(shù)均出現(xiàn)不同程度的變化。高內(nèi)涵檢測結(jié)果顯示，雙氯芬酸鈉、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬作用于HepG2細胞時，均可引起活性氧的大量產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低和谷胱甘肽含量的減少。同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)一定程度的損傷，細胞核DNA含量增加，細胞核染色質(zhì)凝集、固縮，細胞可能發(fā)生凋亡。而鹽酸胺碘酮作用于HepG2細胞時線粒體膜電位沒有明顯降低，利福平作用于HepG2細胞時谷胱甘肽含量沒有明顯變化。與此同時，雙氯芬酸鈉、利福平和他莫昔芬作用于L-02細胞時，也可引起活性氧的大量產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低和谷胱甘肽的減少。同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)一定程度的損傷，細胞核染色質(zhì)凝集、固縮，細胞可能發(fā)生凋亡。而鹽酸胺碘酮作用于L-02細胞時除線粒體膜電位沒有明顯降低外，細胞核也沒有發(fā)生變化，鹽酸四環(huán)素作用于L-02細胞時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沒有出現(xiàn)明顯損傷(圖1)。

此外，我們根據(jù)各機制參數(shù)的陰性閾，得到了陽性物每個機制參數(shù)的最小中毒濃度(minimum toxic concentration, MTC)，即最初設(shè)置的5個濃度中超過陰性域的最小濃度(表3和表4)。實驗結(jié)果表明，各陽性物作用于2種細胞時，MTC結(jié)果與高內(nèi)涵圖片反映出的結(jié)果基本一致。而陰性物作用于2種細胞時，各機制參數(shù)均無明顯變化。

表1 PCR試驗所用的引物序列Table 1 Primers used in real-time PCR

表2 化合物對2種肝細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)(均值±標準差，n=3)Table 2 The 50% inhibiting concentration (IC50) of different chemicals in two cell lines (mean ± SD, n=3)

圖1 化合物處理肝細胞系后的高內(nèi)涵(HCS)分析圖像注：ROS表示活性氧，MMP表示線粒體膜電位，ER表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，GSH表示谷胱甘肽；nuclei-藍/ROS-綠/MMP-紅，nuclei-藍/ER-綠，GSH-綠；對于HepG2細胞，胺碘酮50 μmol·L-1(34 mg·L-1)，雙氯芬酸鈉150 μmol·L-1(44 mg·L-1)，利福平200 μmol·L-1(165 mg·L-1)，四環(huán)素150 μmol·L-1(67 mg·L-1)，他莫昔芬50 μmol·L-1(19 mg·L-1)；對于L-02細胞，胺碘酮20 μmol·L-1(14 mg·L-1)，雙氯芬酸鈉150 μmol·L-1(44 mg·L-1)，利福平150 μmol·L-1(123 mg·L-1)，四環(huán)素150 μmol·L-1(67 mg·L-1)，他莫昔芬20 μmol·L-1(7 mg·L-1)；比例尺為50 μm。Fig. 1 The high content screening (HCS) images were obtained from the same well of cell line treated with five chemicals by using different filters to detectNote: ROS stands for reactive oxygen species; MMP stands for mitochondrial membrane potential; ER stands for endoplasmic reticulum; GSH stands for glutathione; nuclei-blue/ROS-green/MMP-red, nuclei-blue/ER-green, GSH-green; HepG2 cells treated with amiodarone 50 μmol·L-1 (34 mg·L-1), diciofenac sodium 150 μmol·L-1(44 mg·L-1), rifampicin 200 μmol·L-1(165 mg·L-1), tetracycline 150 μmol·L-1 (67 mg·L-1), tomoxifen 50 μmol·L-1(19 mg·L-1); L-02 cells treated with amiodarone 20 μmol·L-1(14 mg·L-1), diciofenac sodium 150 μmol·L-1(44 mg·L-1), rifampicin 150 μmol·L-1(123 mg·L-1), tetracycline 150 μmol·L-1(67 mg·L-1), tomoxifen 20 μmol·L-1(7 mg·L-1); Scale bar = 50 μm.

2.3 不同肝細胞模型預(yù)測肝毒性化學成分性肝損傷能力的比較

實驗結(jié)果表明，2種細胞預(yù)測肝毒性化學成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度均存在顯著性差異，且L-02細胞預(yù)測肝毒性化學成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度均顯著高于HepG2細胞(表5)。這表明L-02細胞預(yù)測肝毒性化學成分性肝損傷的能力更強。

表3 高內(nèi)涵檢測中受試化合物對HepG2細胞的最小毒性濃度(MTC)Table 3 Minimum toxic concentration (MTC) of tested chemicals in HepG2 cells in HCS test

表4 高內(nèi)涵檢測中受試化合物對L-02細胞的MICTable 4 MIC of tested chemicals in L-02 cells in HCS test

表5 2種肝細胞系在高內(nèi)涵檢測中的預(yù)測能力Table 5 Predictive ability of two liver cell lines detected with HCS

2.4 2種肝細胞的藥物代謝酶mRNA表達含量比較

實驗結(jié)果顯示，與HepG2細胞相比，L-02細胞各個肝毒性化學成分代謝酶的mRNA表達水平均顯著增加。其中，L-02細胞Ⅱ相肝毒性化學成分代謝酶UGT1A1和GSTA1/2的mRNA表達含量增加最為顯著，分別約為HepG2細胞的12倍和9倍。這表明，L-02細胞相對于HepG2細胞高表達肝毒性化學成分代謝相關(guān)的酶類，可能與體內(nèi)肝臟代謝水平更加接近(圖2)。

圖2 L-02與HepG2細胞中代謝酶mRNA的相對表達量(均值±標準差，n=3)注：*P<0.05、**P<0.01表示與HepG2相比差異顯著。Fig. 2 The relative mRNA expression of metabolizing enzyme in L-02 cells and HepG2 cells (mean ± SD, n=3)Note: *, ** indicate significance at P<0.05 and P<0.01 compared with HepG2 cells.

3 討論(Discussion)

Livertox Database數(shù)據(jù)庫詳細介紹了能夠?qū)е赂味拘运幬锏乃幚砘钚?，其在使用時與肝損傷發(fā)生的因果關(guān)系、導致肝損傷發(fā)生的頻率和肝損傷的機制及類型等。而本研究所選的陽性藥(鹽酸胺碘酮、雙氯芬酸鈉、利福平、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬)均為Livertox Database里藥物列表中明確會導致藥物性肝損傷的藥物，陰性藥(檸檬酸三鈉、抗壞血酸和地塞米松)均為臨床上沒有與肝損傷相關(guān)的任何報道的藥物，上述8種藥物分別作為工具化合物用于評價篩選體系[11-12]。實驗結(jié)果顯示，當陰性物作用于2種細胞時，2種細胞均呈現(xiàn)出較低程度的生長抑制。而當陽性物作用于2種細胞時，2種細胞均受到不同程度較強的生長抑制作用。L-02細胞對陽性物的敏感程度均大于HepG2細胞，且鹽酸胺碘酮和他莫昔芬這2種陽性物作用時更加明顯，L-02細胞的敏感性約為HepG2細胞的2倍以上。本研究的MTT實驗中，3種陰性藥的實驗結(jié)果與已有文獻報道的結(jié)果一致，IC50均>1 000 μmol·L-1，而5種陽性藥作用于2種細胞時的IC50值與已有文獻報道雖不完全一致，但均相差不大且在同一數(shù)量級，此外本研究中的MTT法實驗均設(shè)有3個復孔，標準差較小，因此，本研究的MTT法實驗結(jié)果是準確的[10]。根據(jù)MTT法實驗結(jié)果，可以初步判斷L-02細胞可能比HepG2細胞對能夠?qū)е赂味拘曰瘜W成分性肝損傷的化學成分更敏感。

為了進一步比較2種細胞的預(yù)測能力，采用了高內(nèi)涵檢測的方法。大量研究表明，在高內(nèi)涵實驗中，當參數(shù)變化超過陰性域時的給藥濃度小于該肝毒性化合物最大血藥濃度(Cmax)的100倍時，可以認為其具有肝毒性[13]。根據(jù)MTT法實驗結(jié)果，測得的各個陽性物的IC50值均在其Cmax的100倍以內(nèi)，因此，在此濃度范圍內(nèi)能夠正確篩出陽性物的機制參數(shù)變化情況。實驗結(jié)果顯示，當陰性物作用于2種細胞時，各參數(shù)的變化情況均小于空白組的20%，根據(jù)陰性物的實驗結(jié)果，計算出了各個機制相關(guān)參數(shù)的陰性域，即在陰性域范圍內(nèi)變化為陰性，而在陰性域范圍外變化為陽性。根據(jù)實驗結(jié)果可知，當5種陽性物作用于2種細胞時，除個別參數(shù)外，各機制參數(shù)變化時，整體來看L-02細胞的最小中毒濃度較小，說明L-02細胞對肝毒性機制的變化更加敏感[14]。為了能更準確和更直觀地比較2種細胞模型對肝毒性化學成分性肝損傷的預(yù)測能力，根據(jù)高內(nèi)涵的實驗結(jié)果計算并比較了2種細胞預(yù)測肝毒性化學成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度。實驗結(jié)果表明，L-02細胞的精確度、敏感度和特異度均顯著高于HepG2細胞，這表明L-02細胞預(yù)測肝毒性化學成分性肝損傷的能力更強。高內(nèi)涵試驗可以多端點且準確地檢測出肝損傷的機制。在今后的研究中，筆者會通過陽性藥和陰性藥的高內(nèi)涵實驗結(jié)果制定肝損傷的評分和判定標準，以用來大規(guī)模篩選出環(huán)境中能夠?qū)е赂螕p傷的化學物質(zhì)。

肝藥酶的含量也是比較2種細胞與生理水平接近程度的有效方法，采用實時定量PCR的方法評價了2種細胞的肝毒性化學成分代謝酶在mRNA水平的含量。實驗結(jié)果表明，L-02細胞肝毒性化學成分代謝酶的mRNA表達水平均不同程度地顯著高于HepG2細胞。

以上實驗結(jié)果表明，2種細胞均能正確區(qū)分出能夠?qū)е赂螕p傷的化學物質(zhì)，且L-02細胞對能夠?qū)е赂螕p傷化學物質(zhì)的敏感性優(yōu)于HepG2細胞。與HepG2細胞相比，L-02細胞預(yù)測藥物性肝損傷的準確度、敏感度和特異度更高，且L-02細胞的肝藥酶含量高于HepG2細胞。高內(nèi)涵實驗與MTT法實驗結(jié)果均表明L-02細胞更適合作為肝損傷篩選模型，因其能夠?qū)崿F(xiàn)多端點、快速和高通量篩選，所以可以使用單一的高內(nèi)涵實驗作為肝損傷的篩選方法。因此，L-02細胞結(jié)合高內(nèi)涵可作為預(yù)測藥物性肝損傷的最佳模型。