楊婧，陳曉倩，殷浩文，張瑛，楊希晨，劉亞楠，趙偉剛

上海市檢測中心，上海 201202

生物降解性評估是化學品環(huán)境行為研究的重要環(huán)節(jié)之一。實驗室條件下的評估主要有快速生物降解(ready biodegradation)、固有生物降解(inherent biodegradation)及模擬生物降解(simulation biodegradation)等3個不同層級。通常在化學品快速生物降解為陰性結果時，進一步的研究評估可直接開展模擬生物降解性研究，也可通過固有生物降解試驗進行降解潛能的補充研究。盡管模擬生物降解占據(jù)最高評估層級，被認為可為化學品尤其新化學物質降解性評估提供更可靠、準確的基礎，但受有效暴露場景選擇、低暴露濃度研究及分析條件、試驗周期和成本等諸多因素限制，目前多見于科研層面，化學品管理層面的應用相對較少。我國《新化學物質申報登記指南》[1]提出對于不具快速生物降解性的化學品還應提交固有生物降解數(shù)據(jù)，尚無提交模擬生物降解數(shù)據(jù)的明確要求。因此，固有生物降解性評估仍是現(xiàn)階段獲知化學品生物降解潛能的實用方法。此外，在高層級化學品風險評估中，固有生物降解數(shù)據(jù)亦是修改默認降解半衰期參數(shù)的依據(jù)。

經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)用于評估固有生物降解性的標準方法主要有改進的半連續(xù)活性污泥(SCAS)試驗(OECD 302A)[2]、贊恩-惠倫斯試驗(OECD 302B)[3]及改進的MITI Ⅱ試驗(OECD 302C)[4]等3項。其中，OECD 302C方法因可適用于難溶、吸附及弱揮發(fā)的化學品生物降解性評估，較前2項僅適合具一定水溶性的非揮發(fā)化學品測試的方法而言，OECD 302C方法具更廣泛的適用性。然而，OECD 302C方法對接種物要求較為嚴苛，方法規(guī)定：(1) 需定期采集一個城市涵蓋受試化學品可能暴露(使用和處置)場景內不少于10個位點的接種物；(2) 通過配制大量人工污水的方式對多位點混合接種物進行至少1個月的馴養(yǎng)；(3) 馴養(yǎng)3個月后需重新補充多位點采集的接種物。接種物采集、馴養(yǎng)和維持成本高于其他生物降解試驗且操作復雜程度相對高。已有文獻提示，人工污水馴養(yǎng)后的接種物部分碳源利用能力有所下降[5]，這可能是導致OECD 302C試驗降解能力弱于其他固有生物降解試驗[6]的原因之一。另有研究表明，在結果受接種物影響較大的快速生物降解試驗中，MITI方法下馴養(yǎng)的接種物生物降解能力相對弱于其他采用活性污泥作為接種物的試驗[7]，但上述結論是據(jù)不同降解方法獲取的降解及不降解結果的分布比例推斷而來，具一定局限性。盡管已有較多關于接種物對降解試驗影響的研究[8-11]以及MITI培養(yǎng)條件下接種物群落結構變化的研究，但均未直接采用多位點采集的接種物進行研究。10位點采集并按照OECD 302C方法馴養(yǎng)后的接種物在群落結構及功能上的變化及其對生物降解性產(chǎn)生的影響，尚無直接且相對明確的研究。

本研究通過Biolog微孔板及磷脂脂肪酸(PLFA)分析對多位點采集馴養(yǎng)前及馴養(yǎng)不同時間的接種物微生物群落變化情況進行研究，并與污水處理廠曝氣池采集的單一來源活性污泥樣本群落特征進行比較，從群落特征變化角度對多來源的2類接種物進行分析；同時，選擇了6種降解能力各異的化學品，比較馴養(yǎng)污泥與活性污泥對上述化學品的降解延滯期和最終降解率等參數(shù)，研究接種物對固有生物降解結果的影響。通過上述研究，探討多來源采集接種物的合理性與必要性以及OECD 302C方法可能的改進。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 接種物來源

活性污泥采自上海污水處理廠(楊浦、嘉定區(qū)的生活污水處理污泥及寶山、奉賢區(qū)的工業(yè)污水處理污泥)曝氣池；馴養(yǎng)接種物為涵蓋3種不同生態(tài)類型環(huán)境水體(淀山湖、川楊河及蘇州河、長江口)的水樣、2種類型活性污泥(同上述活性污泥來源)以及3種土樣(農(nóng)用土、濕地土及園林土)，混和后參照OECD 302C[4]方法馴養(yǎng)后使用。

1.2 主要儀器及試劑

微生物鑒定儀(MicroStation，Biolog公司，美國)，安捷倫氣相色譜(Agilent 6890N，安捷倫公司，美國)，BOD分析儀(Oxitop，WTW公司，德國)，恒溫培養(yǎng)箱(MI-250A，STIK公司，中國)。

GN(Gram-negative，革蘭氏陰性)/GP(Gram-positive，革蘭氏陽性)微孔板(Biolog公司)(用于革蘭氏陰/陽性好氧菌分析)，ATP標準試劑及微生物細胞活性檢測試劑盒(Promega公司)，脂肪酸標樣(上海恒奇生物有限公司)。

脂肪酸抽提試劑(見1.3.2)及固有生物降解實驗用化學品(見1.3.3)均為分析純，分別購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司和上海萬宏生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Biolog微生物群落分析

選取采集自生活污水處理廠及工業(yè)污水處理廠的2個批次的污泥樣本各1份，2個批次的馴養(yǎng)接種物分別取馴養(yǎng)0 d(即多位點采集接種物混合當天)、7 d、14 d及1個月的接種物各1份，以滅菌的0.85%(m/V)NaCl溶液離心清洗上述污泥樣本2次(4 000 r·min-1、4 ℃，10 min)后，用0.85%(m/V)的NaCl溶液攪拌后，重懸接種物至相同細菌細胞數(shù)(即活菌數(shù)約1010個·L-1)，采用ATP法進行活菌計數(shù)[12]。2號濾紙過濾后，濾液分別接種至Biolog GN2及GP2微孔板，每孔150 μL菌液，每個樣本設置2個重復。置于恒溫培養(yǎng)箱中(25±1) ℃培養(yǎng)48 h后，在590 nm處讀數(shù)并記錄每孔的光吸收值。

1.3.2 磷脂脂肪酸(PLFA)分析

取1.3.1中污泥及接種物樣本進行PLFA抽提，提取方法如下。(1)提取與分離：污泥離心(4 000 r·min-1、4 ℃，20 min)后，取約0.5 g置于20 mL離心管中，根據(jù)《SHERLOCK微生物鑒定系統(tǒng)操作手冊》上所述方法進行抽提，分別采用試劑1(mNaOH∶V甲醇∶V蒸餾水=45 g∶150 mL∶150 mL)進行皂化、試劑2 (VHCl∶V甲醇=325 mL∶275 mL)進行甲基化、試劑3(V正己烷∶V甲基叔丁醚= 200 mL∶200 mL)萃取及試劑4(質量分數(shù)2%的NaOH溶液)洗滌后，取頂部2/3溶液加入氣相色譜進樣品瓶中，壓蓋待分析。通過微生物鑒定系統(tǒng)(Microbial Identification System, MIDI)，采用帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行PLFA分析，系統(tǒng)根據(jù)各組分保留時間與標樣保留時間的比較自動識別目標組分。

1.3.3 固有生物降解試驗

采用馴養(yǎng)1個月的馴養(yǎng)接種物與生活污水處理廠采集的污泥進行苯甲酸鈉、二甘醇、3,5-二叔丁基-4-羥基苯丙酸異辛酯(簡稱為AO-1135)、1,4-雙(氨基甲基)環(huán)己烷(簡稱為BAMCH)、N-[4-(磺酰胺)苯基]甲基丙烯酰胺(簡稱為ASPMAA)和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸(簡稱為BP-4)等6種化學品的固有生物降解試驗，試驗參照OECD 302C方法[4]進行，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，試驗周期為28 d。固有生物降解曲線采用GraphPad Prism 5軟件進行擬合。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

1.4.1 Biolog結果數(shù)據(jù)處理

(1)碳源利用活性

一位被訪者談及他們的殯儀館硬軟件設施時這樣描述：“您不知道，我們殯儀館晚上看過去就像一個高級賓館一樣，燈火通明。但引進的軟件只有我一個人會使用，所以，平時日常工作，我會很累。很多任務壓在我的身上，有些可以教會他們，有些只能在下午大家休息時，我再專門去做?！?/p>

采用微平板平均每孔顏色變化率(average well color development, AWCD)作為反映接種物微生物利用單一碳源的能力。GN及GP板計算公式為：

AWCD=[∑(Ci-R)]/95

(1)

式中：Ci為反應孔所測得的光吸收值，R為對照孔A1的光吸收值。

(2)多樣性指數(shù)

采用Shannon-Wiener指數(shù)(H’)反映物種豐富程度，計算公式為：

H’=-∑(Pi×lnPi)

(2)

式中：Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率；以Shannon均勻度(E)衡量群落及種間個體分布均一程度，計算公式為：

E=H’/lnS

(3)

式中：S為顏色變化孔的數(shù)目。

1.4.2 PLFA分析結果數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法計算各組分相對含量。采用Origin 2018軟件對活性污泥及馴養(yǎng)接種物樣本各組分含量特征進行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。

生物降解數(shù)據(jù)的處理方式參照OECD 302C方法[4]進行。

2 結果(Results)

2.1 Biolog微生物群落分析

1.3.1中所述馴養(yǎng)0 d(即混合當天)、7 d、14 d及1個月的接種物與工業(yè)及生活污水處理廠采集的活性污泥樣本在Biolog GN2及GP2這2種微孔板中的AWCD、Shannon-Wiener指數(shù)及Shannon均勻度如表1所示。從反映微生物碳源整體利用能力及代謝活性的AWCD值來看，GN板(革蘭氏陰性菌分析用)經(jīng)48 h培養(yǎng)后，馴養(yǎng)0 d(即混合當天的接種物)及7 d的接種物AWCD分別為0.596±0.0988及0.859±0.390，均高于生活污水處理廠與工業(yè)污水處理廠采集的污泥的AWCD值，其值分別為0.144±0.0377及0.227±0.0834，馴養(yǎng)7 d的接種物比馴養(yǎng)0 d的接種物碳源利用活性增強；但隨馴養(yǎng)時間的增加，馴養(yǎng)接種物碳源利用活性反而出現(xiàn)下降，馴養(yǎng)14 d及1個月的AWCD值分別降低為0.254±0.0377及0.244±0.0259。t-test雙側檢驗結果顯示，馴養(yǎng)0 d及7 d的接種物碳源利用活性明顯高于其他組別接種物(P值為0.0230～0.0447，P<0.05)，但二者之間無碳源利用活性上的明顯差異(P=0.453，P>0.05)；馴養(yǎng)14 d及1個月的接種物與生活污水處理廠與工業(yè)污水處理廠采集的活性污泥碳源利用活性無顯著性差異(P值為0.0991～0.718，P>0.05)。此外，反映微生物多樣性程度及各類微生物分布數(shù)量的微生物群落多樣性(H’)及均勻度指數(shù)(E)也在馴養(yǎng)7 d時達到最高值，馴養(yǎng)14 d及1個月的接種物的微生物群落的H’及E值低于馴養(yǎng)0 d、7 d的接種物、污水處理廠采集的活性污泥。

GP板(革蘭氏陽性菌分析用)的AWCD值變化表明，馴養(yǎng)接種物的碳源利用活性亦在馴養(yǎng)7 d時達到最高值，馴養(yǎng)14 d及1個月后活性隨馴養(yǎng)時間增加而下降。與GN板略不同的是，馴養(yǎng)14 d的接種物活性僅略低于馴養(yǎng)0 d及7 d的接種物，而馴養(yǎng)1個月的接種物碳源利用能力下降，明顯低于馴養(yǎng)7 d的接種物(P=0.0379，P<0.05)。馴養(yǎng)1個月的接種物與污水處理廠采集的活性污泥在代謝活性上沒有明顯差異(P值為0.792～0.916，P>0.05)。馴養(yǎng)7 d的接種物H’及E值最高，馴養(yǎng)1個月后的接種物反而出現(xiàn)下降，H’及E值低于其他組別的馴養(yǎng)接種物，也低于污水處理廠采集的活性污泥。

表1 不同接種物中微生物的碳源利用活性及群落多樣性指數(shù)比較Table 1 Comparison of microbial utilization of carbon sources and community diversity index in different inoculum

2.2 PLFA分析

PLFA組成差異一定程度反映不同接種物中活體微生物的不同類群生物量及總體生物量的差異。不同接種物(見1.3.1所述)PLFA組成主成分分析結果如圖1所示。PC1和PC2分別代表了52.7%和10.4%的差異，結果大致分布于3個區(qū)域。其中，馴養(yǎng)0 d與馴養(yǎng)7 d的馴養(yǎng)接種物分別分布在2個不同區(qū)域中，表明這2種接種物之間在PLFA組成上均存在較大差異；另一個區(qū)域中，分布有馴養(yǎng)14 d、1個月的馴養(yǎng)污泥以及生活及工業(yè)污水處理廠采集的活性污泥等不同類型的接種物，表明從PLFA組成來看，這幾種接種物間的區(qū)分度略低，但其組成與馴養(yǎng)0 d及7 d的馴養(yǎng)接種物存在一定差異，尤其與馴養(yǎng)7 d的馴養(yǎng)接種物微生物組成上差異較大。

圖1 不同接種物磷脂脂肪酸(PLFA)組成主成分分析注：XY為馴養(yǎng)接種物，標號中的0d、7d、14d及1m分別表示多位點接種物混和后馴養(yǎng)0 d、7 d、14 d及1個月；SL為活性污泥(采集自生活污水處理污泥和工業(yè)污水處理污泥)。Fig. 1 PCA analysis on phospholipid fatty acid (PLFA) composition of different inoculumNote: XY is the domesticated inoculum, and 0d, 7d, 14d and 1m are the mixed inoculum collected from different places and domesticated for 0 d, 7 d, 14 d and 1 month respectively; SL is activated sludge (collected from domestic sewage treatment plant and industrial sewage treatment plant).

2.3 馴養(yǎng)污泥與活性污泥的固有生物降解試驗

按OECD 302C標準實驗方法，分別采用馴養(yǎng)1個月的馴養(yǎng)污泥與生活污水處理廠曝氣池采集的活性污泥對6種降解能力各異的物質開展固有生物降解試驗，各平行組之間的降解率差異<20%，故采用平均生物降解率繪制固有生物降解曲線(圖2)。固有生物降解結果表明，2種接種物對于6種化學品的生物降解能力處于相近水平：對可固有生物降解的化學品苯甲酸鈉及二甘醇的生物降解率為81%～85%，均超過固有生物降解的判定水平(降解率達70%)。2種接種物對化學品ASPMAA、BP-4的固有生物降解率分別為29%～31%及20%～28%，具初步固有生物降解跡象；對化學品AO-1135和BAMCH的生物降解率分別為12%～14%及5%，未表現(xiàn)出固有生物降解能力。

進一步采用GraphPad Prism 5軟件非線性擬合2種接種物對6種化學品的降解曲線，擬合度(R2)在0.83～0.99之間，馴養(yǎng)污泥對苯甲酸鈉、二甘醇、AO-1135、BAMCH、ASPMAA和BP-4等6種化學品的降解延滯期分別為0.42、2.2、13、>28、7.2和5.4 d；活性污泥對上述6種化學品的降解延滯期分別為0.51、1.7、13、>28、9.1和11 d，活性污泥對6種化學品的降解延滯期普遍長于馴養(yǎng)接種物。

而從曲線擬合獲取的最終降解率與試驗獲得的實測值計算而來的28 d降解率(圖2)相近，曲線擬合后，馴養(yǎng)接種物對上述6種化學品的最終降解率分別為78%、82%、14%、4.9%、32%和28%；活性污泥對6種化學品的最終降解率分別為84%、84%、17%、5.4%、34%和30%。活性污泥對6種化學品的最終降解率略高于馴養(yǎng)1個月的接種物。

3 討論(Discussion)

Biolog分析反映群落代謝活性，可評估微生物群落功能的多樣性。接種物濃度對Biolog分析結果影響較大[13]，因此，為保證結果的準確性與可比性，本研究在進行Biolog微孔板接種前，將各接種物的活菌細胞數(shù)統(tǒng)一調節(jié)至相近水平(即活菌數(shù)約1010個·L-1)。10個位點采集接種物在未馴養(yǎng)時(多點采集混合初期，即馴養(yǎng)0 d)及馴養(yǎng)7 d時碳源利用活性均高于污水處理廠曝氣池采集的活性污泥，馴養(yǎng)0～7 d，馴養(yǎng)接種物代謝活性增強，馴養(yǎng)7 d時，微平板平均每孔顏色變化率(AWCD)及Shannon-Wiener指數(shù)(H’)及Shannon均勻度(E)達到最高，表明馴養(yǎng)7 d后接種物的代謝活性、微生物種類及數(shù)量都達到最佳狀態(tài)，而馴養(yǎng)14 d后接種物代謝活性則反而出現(xiàn)下降，尤其馴養(yǎng)1個月后的接種物，活性下降尤為明顯，與污水處理廠采集的污泥無明顯差異。馴養(yǎng)14 d尤其1個月的馴養(yǎng)接種物其微生物多樣性程度及各類微生物分布數(shù)量均弱于污水處理廠采集的活性污泥。

圖2 2種不同接種物對6種化學品的固有生物降解曲線注：XY-1m為馴養(yǎng)1個月的接種物；SL為采集自生活污水處理廠的活性污泥；AO-1135、BAMCH、ASPMAA和BP-4表示3,5-二叔丁基-4-羥基苯丙酸異辛酯、1,4-雙(氨基甲基)環(huán)己烷、N-[4-(磺酰胺)苯基]甲基丙烯酰胺和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸。Fig. 2 Inherent biodegradation curves of 6 chemicals by using two different inoculumNote: XY is the domesticated inoculum (with 1-month domestication); SL is activated sludge (collected from domestic sewage treatment plant); AO-1135, BAMCH, ASPMAA and BP-4 stand for Antioxidant 1135, 1,4-cyclohexanediamine, N-[4-(aminosulfony1)phenyl]methacrylamid and 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid.

PLFA分析反映活微生物群落結構多樣性，結果表明，馴養(yǎng)0 d及7 d的接種物與馴養(yǎng)14 d、馴養(yǎng)1個月的接種物以及污水處理廠采集污泥的脂肪酸類型上存在一定差異，尤其馴養(yǎng)7 d的接種物，與其他類型的接種物存在較為明顯的差異，該結果與Biolog結果較為一致。綜上，可推測按照MITI方法馴養(yǎng)7 d的接種物可能具有較高的微生物活性及群落多樣性，而馴養(yǎng)7 d的接種物受接種物生長速度的限制，總量非常有限，難于滿足降解試驗的要求，考慮研究成本及實際可操作性，未對馴養(yǎng)7 d的接種物進行進一步研究。

基于上述結果，結合OECD 302C方法接種物至少馴養(yǎng)1個月(不超過3個月)的要求，進一步研究了馴養(yǎng)1個月的接種物與污水處理廠采集活性污泥對6種降解性各異物質的生物降解情況。通常認為化學品的生物降解性或持久性是化學品自身的內在屬性，而在化學品持久性的實驗室方法評估層面，不能簡單將結果概括為化學品的固有屬性，尤其對于不具快速生物降解性而又未顯示出持久性跡象的化學品，結果往往受接種物細胞密度、微生物群落多樣性、化學品與微生物的比例等因素影響[14]而存在較大變化。因此，本研究在固定的接種物濃度與化學品暴露濃度下，進行6種化學品的固有生物降解性研究。結果表明，活性污泥對苯甲酸鈉、二甘醇、AO-1135、BAMCH、ASPMAA和BP-4等6種化學品的降解延滯期普遍長于馴養(yǎng)污泥，而對6種化學品的最終降解率則普遍略高于馴養(yǎng)1個月的污泥，但最終降解率上的微弱差異并未構成固有生物降解性結果判定層面的差異。本實驗室的另一項關于馴養(yǎng)污泥及污水處理廠采集的活性污泥在模擬生物降解中的比較研究[15]也有類似發(fā)現(xiàn)，即馴養(yǎng)污泥對聚乙二醇400及BP-4這2種化學品有較短的延滯期，但2種接種物在最終的生物降解能力上無本質差異。

綜上，多位點采集、馴養(yǎng)1個月的接種物(OECD 302C方法)與污水處理廠新鮮采集的活性污泥相比，未表現(xiàn)出更優(yōu)的微生物多樣性、代謝活性及固有生物降解能力。鑒于馴養(yǎng)14 d起，馴養(yǎng)接種物活性及多樣性隨馴養(yǎng)周期延長而下降，馴養(yǎng)1個月后的接種物已完全不具有多點采樣混合當天(即馴養(yǎng)0 d)接種物的群落特征，故認為OECD 302C方法馴養(yǎng)的接種物難以代表實際環(huán)境中多來源接種物對化學品的降解能力，10點采集、馴養(yǎng)至少1個月的接種物用于固有生物降解研究的處置方法未見合理性及必要性。相對OECD 302C方法中的馴養(yǎng)污泥而言，新鮮采集自污水處理廠曝氣池的活性污泥則是真實環(huán)境來源的接種物。已有研究表明，出水穩(wěn)定、運行良好的污水處理廠的活性污泥的菌群結構具有相似性[16]。因此，筆者認為，使用新鮮采集自運行良好的污水處理廠的活性污泥代替馴養(yǎng)污泥進行OECD 302C固有生物降解性評估同樣可能獲取穩(wěn)定、可重復的降解結果，并且因其源自真實環(huán)境，與環(huán)境相關性更強，可能更有效地預測化學品在環(huán)境中的生物降解情況。

后續(xù)研究將嘗試在OECD 302C體系中，增加活性污泥濃度、降低受試化學品濃度[17]以及延長暴露時間等，以便實現(xiàn)對化學品的環(huán)境持久性的進一步預測。同時，針對學者提出實驗室條件下開展302B、302C等固有生物降解研究中，礦質培養(yǎng)基難以模擬實際環(huán)境中多種碳源共存時的共代謝情況[18]，嘗試實驗室條件多種碳源添加對降解結果的影響研究。此外，近年來提出采用“可能性”方法(“probability approach”或“Probabio”)判定化學品持久性的新思路，即通過實際環(huán)境接種物，以不同的接種濃度、受試濃度進行一系列降解性研究，通過最大可能數(shù)(MPN)來評估化學品的持久性[19]。上述研究將把生物降解試驗最終引入微量化及高通量的層面，而以OECD 302C這一相對成熟、適用范圍廣且易于實現(xiàn)自動化操作的體系為基礎，采用活性污泥作為接種物開展MPN研究，極大降低了操作成本，縮短了研究周期，在相對更大且易操作的體系中嘗試方法的改進并開發(fā)研究更敏感的新終點，是快速獲取并積累數(shù)據(jù)、實現(xiàn)與高通量研究數(shù)據(jù)間的比較并最終實現(xiàn)有效的微體積、高通量化學品持久性判別篩選方法的研發(fā)、評估、驗證及改進的有效橋梁。

致謝：感謝上海市檢測中心劉敏博士在文章修改中給予的幫助。