陳進林，許玉潔，高亮，蔡佳宏，梁嘉慧，余明喧，肖億金，陳桂蘭，馮寶欣，霍嘉維，梅承芳,#，曾國驅,*

1. 廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，廣東省科學院，廣州 510070 2. 華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070 3. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 4. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

敵草隆(diuron)是一種常用的典型防污漆活性添加劑，也是一種抑制植物光合作用的除草劑[1]，其水解、光解和生物降解的半衰期均較長，有環(huán)境持久性[2]。由于長期廣泛的使用，近年來，敵草隆在地表水、海洋環(huán)境中被頻繁檢出，對環(huán)境和人類健康存在一定的潛在風險[3-4]。有研究表明，敵草隆對水生生物有一定的生態(tài)毒性，其中，藻類是對其最為敏感的物種，并且隨著食物鏈的傳遞可在魚類和甲殼類生物體內蓄積[1]。Mansano等[5]的研究表明，敵草隆對月牙藻(Raphidocelissubcapitata)的96 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.4 μg·L-1，對近具刺鏈帶藻(Desmodesmussubspicatus)的72 h-IC50為46.3 μg·L-1[6]，顯示出極高的毒性。Nebeker和Schuytema[4]的研究表明，敵草隆對枝角類、端足類、搖蚊、魚類、蚯蚓和螺都有一定的慢性毒性，其中，對蚤狀溞(Daphniapulex)繁殖抑制的7 d最低可觀察效應濃度(LOEC)為7.7 mg·L-1，無可觀察效應濃度(NOEC)為4.0 mg·L-1；對黑頭呆魚幼魚的10 d半致死濃度(LC50)為27.1 mg·L-1。目前，標準化的測試要求更長生命周期的慢性毒性數(shù)據(jù)[7-8]，以支撐對化學品的環(huán)境風險評估。但是，敵草隆對水生甲殼綱枝角類更長生命周期的慢性毒性研究，卻鮮見有報道。

近年來，研究人員一直在探索無毒或低毒、對環(huán)境更友好的防污漆活性物質，以替代目前常用的高毒性的物質，其中一個研究方向是將低毒、具有殺生活性的天然產(chǎn)物添加于防污漆中[9]。辣椒素(capsaicin)被認為是最具潛力的天然防污漆活性添加劑之一，有研究者認為，與現(xiàn)有防污漆添加劑相比，辣椒素具有很多優(yōu)勢特性[10-13]。LaHann等[14]的研究表明，辣椒素的辛醇-水分配系數(shù)比較低(logKow= 3.04)，表明其不太可能具有生物蓄積性。辣椒素還具有快速生物降解性，對羊角月牙藻生長抑制的72 h半數(shù)效應濃度(EC50)為5.114 mg·L-1，對斑馬魚的96 h-LC50為5.98 mg·L-1[9]。Angarano等[12]的研究表明，辣椒素對大型溞的LC50為18.3 mg·L-1。所以，辣椒素對水生生物具有一定的急性毒性。Oliveira等[15]的研究表明，1 mg·L-1的辣椒素對萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的生長、大型溞的急性活動和斑馬魚胚胎的死亡率均沒有顯著影響，但可以顯著提高胚胎心臟的心率，因此，研究辣椒素在低濃度長期暴露下對水生生物的慢性毒性，顯得尤為必要。

大型溞(Daphniamagna)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼動物綱(Crustacea)，在世界范圍分布廣泛，處在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的第二級(初級消費者)，具有重要的生態(tài)學地位。大型溞體形小、易于實驗室操作和繁殖、全年可獲得幼溞，主要以孤雌生殖方式進行繁殖，易于得到基因型一致的單克隆個體，對有毒物質敏感性高，被作為標準測試生物廣泛應用于有毒物質的急性和慢性毒性研究[16]，獲得的毒性數(shù)據(jù)是我國新化學物質管理常規(guī)登記中必須提供的毒性數(shù)據(jù)之一[17]。

防污漆活性物質的廣泛使用為控制船舶和海洋設施的生物污損貢獻巨大，但也導致了在世界范圍內的許多港口和碼頭都檢出了高濃度的活性物質，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構成了潛在威脅[3]，因此，研發(fā)、篩選獲得無毒或低毒、對環(huán)境友好的活性物質成為當前社會的迫切需求。筆者選用大型溞為受試生物，研究敵草隆和辣椒素對大型溞的急性和慢性毒性效應，為其環(huán)境風險評估提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

大型溞引種自沈陽化工研究院安全評價中心，在實驗室用Elendt M4培養(yǎng)基[7,18]培養(yǎng)和繁殖。環(huán)境溫度為(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照強度范圍為1 000～1 500 lux，投喂?jié)饪s的斜生柵藻液(Scenedesmusobliquus)或羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)液，使大型溞始終處于孤雌繁殖狀態(tài)。實驗前，大型溞已于實驗室培養(yǎng)半年以上，驗證其對重鉻酸鉀的24 h-EC50為1.85 mg·L-1，95%的置信限為1.72～1.99 mg·L-1，符合相關國際標準中敏感性范圍(0.6～2.1 mg·L-1)[19-20]。選擇出生<24 h的幼溞作為實驗溞。

敵草隆購自美國Sigma公司，純度≥98%，分子式為C9H10Cl2N2O，CAS號為330-54-1，外觀為白色晶體。辣椒素購自東京化成工業(yè)株式會社，純度>96.0%，分子式為C18H27NO3，CAS號為404-86-4，外觀為白色粉末。

高分離度快速液相色譜儀(RRLC，Agilent 1260，美國)，光照培養(yǎng)箱(PGX-330B-22H，寧波萊?？萍加邢薰?，pH計(pH3210，WTW，德國)，溶解氧儀(Oxi330i和Oxi3210，WTW，德國)，水質硬度計(HI96735，HANNA，意大利)。

1.2 實驗方法

1.2.1 敵草隆分析方法驗證實驗

為了準確表征敵草隆的實際暴露濃度，采用RRLC測定實驗溶液中敵草隆濃度。建立的液相分析條件為：BDS Hypersil C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流動相為水-乙腈(體積比為50∶50)，柱溫40 ℃，檢測器DAD，檢測波長212 nm，流速0.4 mL·min-1，進樣量3.0 μL。

標準曲線范圍和檢出限：準確稱取敵草隆標樣，用乙腈配制成251.7 mg·L-1標準貯備液。然后用50%乙腈逐步稀釋，分別獲得0.126、0.503、1.01、2.52、12.6和50.3 mg·L-1的標準溶液。按上述條件進行測定。以信噪比(S/N)的3倍計算檢出限(LOD)，10倍計算定量限(LOQ)。

精密度分析：取2.52 mg·L-1標準溶液，連續(xù)進樣6次，進行濃度測定。

回收率分析：用試驗用水逐步稀釋標準貯備液或標準溶液，分別獲得理論濃度為1.01、1.26和2.52 mg·L-1的樣品，每個樣品進樣測定3次，以實測濃度與理論濃度的比值計算回收率。

1.2.2 辣椒素分析方法驗證實驗

為了準確表征辣椒素的實際暴露濃度，采用RRLC測定實驗溶液中辣椒素濃度。建立的液相分析條件為：BDS Hypersil C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流動相為0.05%磷酸-甲醇(體積比為30∶70)，柱溫40 ℃，檢測器DAD，檢測波長230 nm，流速0.3 mL·min-1，進樣量5.0 μL。

標準曲線范圍和檢出限：準確稱取辣椒素標樣，用甲醇配制成122.5 mg·L-1標準貯備液。然后用70%甲醇逐步稀釋，分別獲得0.245、0.490、1.96、4.90、12.3和49.0 mg·L-1的標準溶液。按上述條件進行測定。以信噪比(S/N)的3倍計算檢出限(LOD)，10倍計算定量限(LOQ)。

精密度分析：取4.90 mg·L-1標準溶液，連續(xù)進樣6次，進行濃度測定。

回收率分析：用試驗用水逐步稀釋標準貯備液或標準溶液，分別獲得理論濃度為0.490、1.23和2.45 mg·L-1的樣品，每個樣品進樣測定3次，以實測濃度與理論濃度的比值計算回收率。

1.2.3 敵草隆和辣椒素在實驗體系的溶解性和穩(wěn)定性

按照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)系列指南文件No.23[21]的評估方法，通過預試驗，獲知敵草隆和辣椒素均較難溶于水。經(jīng)過約10 min的超聲波分散和約24 h的連續(xù)磁力攪拌，獲得敵草隆和辣椒素在Elendt M4培養(yǎng)基中的飽和溶液(saturation solution, SS)，用RRLC測定其飽和溶解濃度分別為30 mg·L-1和17 mg·L-1。

敵草隆在急性和慢性毒性實驗體系中的濃度在48 h內可維持在設置濃度的±20%范圍內，因此，可以靜態(tài)方式開展急性毒性實驗，以48 h更換1次暴露溶液的半靜態(tài)方式開展慢性毒性實驗。可能是具有快速生物降解性的原因，辣椒素在急性毒性實驗體系中的濃度半衰期約為48 h，在添加了濃縮綠藻液的慢性毒性實驗體系中，濃度下降還可能會加快，因此，均以24 h更換1次暴露溶液的半靜態(tài)方式開展辣椒素的急性和慢性毒性實驗(表1)。

1.2.4 急性毒性實驗

制備受試物的飽和溶液，再用Elendt M4培養(yǎng)基稀釋獲得不同濃度的受試物實驗溶液。參照OECD 202[19]和《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應卷》[18]的方法，通過預實驗，獲得受試物對大型溞未產(chǎn)生活動抑制的最高濃度(EC0)和完全產(chǎn)生活動抑制的最低濃度(EC100)，從而確定正式實驗的濃度范圍。

對于敵草隆，以1.310為濃度間隔系數(shù)，設置10.2、13.3、17.5、22.9和30.0 mg·L-1的受試物實驗組，同時設置空白對照組。對于辣椒素，以1.330為濃度間隔系數(shù)，設置32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS的受試物實驗組，同時設置空白對照組。將每個濃度實驗溶液，分裝入4個試驗容器(150 mL燒杯)，每個容器含50 mL實驗溶液和5只幼溞。環(huán)境溫度控制在(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，實驗持續(xù)48 h。在實驗開始后24 h和48 h，觀察和記錄大型溞的活動抑制情況。實驗期間，不曝氣也不喂食。

在敵草隆的正式實驗中，測定新制備的飽和溶液中敵草隆的實際濃度，再用培養(yǎng)基稀釋獲得各濃度實驗溶液。實驗期間不更換實驗溶液，為靜態(tài)實驗。在0 h和48 h，測定各實驗組的溫度、pH和溶解氧濃度，同時采集實驗溶液，用于測定敵草隆的實際濃度。

在辣椒素的正式實驗中，用培養(yǎng)基直接稀釋新制備的SS溶液，獲得各濃度實驗溶液。實驗期間每24 h更換1次實驗溶液，為24 h半靜態(tài)實驗。在0、24和48 h，測定各實驗組的溫度、pH和溶解氧濃度，同時采集新、舊實驗溶液，用于測定辣椒素的實際濃度。

1.2.5 慢性毒性實驗

參照OECD 211[7]和《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應卷》[18]的方法，依據(jù)大型溞急性活動抑制實驗結果和預實驗結果，設置正式實驗的濃度范圍。對于敵草隆，以1.770為濃度間隔系數(shù)，設置1.02、1.80、3.19、5.56和10.0 mg·L-1的受試物實驗組，同時設置空白對照組；對于辣椒素，以1.351為濃度間隔系數(shù)，設置15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS的受試物實驗組，同時設置空白對照組。每個實驗組設置10個平行(容器)，每個容器(150 mL燒杯)含80 mL實驗溶液和1只親溞。環(huán)境溫度控制在(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照強度范圍為1 000～1 500 lux，實驗周期為21 d。實驗期間，不曝氣，每天向各個容器投喂藻細胞濃縮液，投喂量(以碳計)為0.1～0.2 mg C·溞-1·d-1。

在敵草隆的正式實驗中，每天投喂?jié)饪s的斜生柵藻液，每48 h更換1次實驗溶液，測定每個實驗組在0、8和18 d的新實驗溶液和2、10和20 d的舊實驗溶液中敵草隆的實際濃度，測定空白對照組和1.02、10.0 mg·L-1的實驗組在0、8和18 d的新實驗溶液和2、10和20 d的舊實驗溶液中的溫度、pH、溶解氧濃度和總硬度。

表1 敵草隆和辣椒素在急性和慢性實驗體系中的穩(wěn)定性Table 1 Stability of diuron and capsaicin in test system of acute and chronic test

在辣椒素的正式實驗中，每天投喂?jié)饪s的羊角月牙藻液，每24 h更換1次實驗溶液，測定每個實驗組在實驗開始時、每次更換實驗溶液前后和實驗結束時實驗溶液中辣椒素的實際濃度，測定空白對照組和5% SS、50% SS的實驗組在0、8和15 d的新實驗溶液和1、9和16 d的舊實驗溶液中的溫度、pH、溶解氧濃度和總硬度。

試驗期間，每天觀察親溞的外觀和存活情況，及時移除出生的幼溞并計算存活幼溞的數(shù)量，記錄親溞的死亡率、產(chǎn)幼溞的數(shù)量、初次生殖時間和總生殖胎數(shù)。試驗結束時，測定所有存活親溞的體長。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Office Excel 2010匯總和整理數(shù)據(jù)。

對大型溞急性毒性效應數(shù)據(jù)，用概率分析法(Probit Analysis Method)和修正的斯皮爾曼-卡伯法(Trimmed Spearman-Karber Method)統(tǒng)計EC50。

對大型溞慢性毒性效應數(shù)據(jù)，先進行正態(tài)分布檢驗(Shapiro-Wilk test檢驗)、方差齊性檢驗(Levene’s test檢驗)。在數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且等方差性前提條件下，使用方差分析檢驗顯著性差異，并用多重比較檢驗(Dunnet’t test)分析處理不同濃度間的差異顯著性。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或存在不等方差性時，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)分析其顯著性差異。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件上進行。

2 結果(Results)

2.1 敵草隆和辣椒素分析方法驗證結果

以吸收峰面積為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x)，進行線性回歸分析，結果如圖1所示。敵草隆在0.126～50.3 mg·L-1的濃度范圍內與峰面積積分值存在極好的線性關系，線性方程為y= 53.6x+ 7.5998 (R2= 0.9998)，LOD為0.0330 mg·L-1，LOQ為0.110 mg·L-1。辣椒素在0.245～49.0 mg·L-1的濃度范圍內與峰面積積分值的線性關系極好，線性方程為y= 22.8x+ 1.8293 (R2= 0.9999)，LOD為0.0665 mg·L-1，LOQ為0.222 mg·L-1。

精密度分析結果表明，2.52 mg·L-1的敵草隆標準溶液，連續(xù)進樣6次測得的平均峰面積為140.42，相對標準偏差(RSD)為0.23%；4.90 mg·L-1的辣椒素標準溶液，連續(xù)進樣6次測得的平均峰面積為116.69，RSD為0.34%，說明2個分析方法的精密度良好。

回收率分析結果表明，加標1.01、1.26和2.52 mg·L-1的敵草隆樣品的平均回收率分別為92.2%、96.2%和102%；加標0.490、1.23和2.45 mg·L-1的辣椒素樣品的平均回收率分別為89.2%、92.9%和97.3%，說明2個分析方法的回收率良好(表2)。

表2 敵草隆和辣椒素回收率實驗結果Table 2 Results of recovery test for diuron and capsaicin

2.2 敵草隆和辣椒素在實驗體系的穩(wěn)定性和暴露濃度的表征

正式實驗中，敵草隆的實測濃度在48 h內能始終維持在設置濃度的±20%范圍內，與預實驗的情況一致，可直接以設置濃度表示敵草隆的暴露濃度。

由于辣椒素具有快速生物降解性，在其慢性毒性正式實驗中，可能是加入濃縮的藻液加速了其降解，在24 h內其部分實測濃度低于初始濃度的80%，因此，需以實測濃度的時間-加權平均值表示其暴露濃度[21]。急性毒性正式實驗中，32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS實驗組的時間-加權平均值分別為4.52、6.01、8.08、10.9和14.6 mg·L-1；慢性毒性正式實驗中，15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS實驗組的時間-加權平均值分別為1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1。

圖1 敵草隆和辣椒素的分析標準曲線Fig. 1 Standard curve for analysis of diuron and capsaicin

2.3 對大型溞的急性毒性

急性毒性實驗中，溶液的pH在7.62～8.22范圍內，溶解氧濃度在4.7～8.3 mg·L-1之間，始終滿足不低于3 mg·L-1的實驗有效性要求。2組實驗的空白對照組大型溞表觀均正常，無活動抑制和死亡現(xiàn)象。大型溞暴露于不同濃度的實驗溶液后，隨著時間的延長，在不同濃度組中表現(xiàn)出不同程度的活動抑制，濃度-效應相關性顯著。

敵草隆對大型溞的24 h和48 h EC50分別為>30 mg·L-1和17.1 mg·L-1；辣椒素對大型溞的24 h和48 h EC50分別為13.3 mg·L-1和12.4 mg·L-1，如表3所示?？梢姡笮蜏袑苯匪氐亩拘皂憫^快，但到48 h時，兩者所呈現(xiàn)的急性毒性水平相當。根據(jù)《化學品分類和標簽規(guī)范 第28部分：對水生環(huán)境的危害》(GB 30000.28—2013)[8]的急性分類標準，敵草隆和辣椒素對大型溞都屬于急性水生危害的類別3。

表3 敵草隆和辣椒素對大型溞急性毒性效應Table 3 Acute toxicity of diuron and capsaicin to Daphnia magna

2.4 對大型溞的慢性毒性

敵草隆和辣椒素的慢性毒性實驗中，空白對照組親溞的死亡率均為0%，所產(chǎn)存活幼溞數(shù)量的平均數(shù)和標準差分別為179±7(變異系數(shù)為3.9%)和158±14(變異系數(shù)為8.3%)，均>60，滿足OECD 211對實驗有效性的要求，變異系數(shù)均<25%，表明實驗運行的質量良好。實驗溶液的pH在7.80～8.81范圍內，溶解氧濃度在7.5～9.1 mg·L-1范圍內，水溫在19. 5～20.8 ℃之間，水質總硬度為260～270 mg·L-1(以CaCO3計)，光照強度范圍在1 010～1 375 lux。

2.4.1 敵草隆的慢性毒性

各項毒性指標結果如表4所示。1.02、1.80、3.19、5.65和10.0 mg·L-1實驗組的親溞死亡率分別為0%、0%、0%、0%和20%，經(jīng)Cochran-Armitage趨勢檢驗，顯示濃度與親溞死亡率之間有緊密的相關性，表明敵草隆具有一定的慢性致死效應。

表4 敵草隆對大型溞慢性毒性實驗各項毒性指標結果匯總Table 4 Summary of all endpoints observed in the chronic test of diuron to Daphnia magna

敵草隆對大型溞的初次生殖時間、總生殖胎數(shù)、體長和產(chǎn)存活幼溞數(shù)量都存在不同程度的毒性效應。與空白對照組相比，1.80、5.65和10.0 mg·L-1實驗組能顯著延遲(P<0.05)大型溞的初次生殖時間，LOEC為1.80 mg·L-1，NOEC為1.02 mg·L-1；10.0 mg·L-1實驗組親溞始終未產(chǎn)幼溞，數(shù)量為0(P<0.05)，LOEC為10.0 mg·L-1，NOEC為5.65 mg·L-1；5.65 mg·L-1和10.0 mg·L-1實驗組存活親溞的體長顯著縮短(P<0.05)，LOEC為5.65 mg·L-1，NOEC為3.19 mg·L-1；所有濃度實驗組所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量均顯著性減少(P<0.05)，NOEC為<1.02 mg·L-1。

產(chǎn)幼溞數(shù)量的減少是所有毒性效應中最敏感的指標。以大型溞繁殖抑制率計算EC10為0.830 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.696～5.67 mg·L-1；EC50為7.52 mg·L-1，95%置信區(qū)間為7.45～7.59 mg·L-1。

2.4.2 辣椒素的慢性毒性

各項毒性指標結果如表5所示。1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1實驗組的親溞死亡率分別為0%、0%、10%、10%和30%，經(jīng)Cochran-Armitage趨勢檢驗，顯示濃度與親溞死亡率之間有緊密的相關性，表明辣椒素具有一定的慢性致死效應。

表5 辣椒素對大型溞慢性毒性實驗各項毒性指標結果匯總Table 5 Summary of all endpoints observed in the chronic test of capsaicin to Daphnia magna

辣椒素對大型溞的初次生殖時間、總生殖胎數(shù)、體長和產(chǎn)存活幼溞數(shù)量都存在不同程度的毒性效應。與空白對照組相比，8.06 mg·L-1實驗組能顯著延遲(P<0.05)大型溞的初次生殖時間，LOEC為8.06 mg·L-1，NOEC為5.83 mg·L-1；5.83 mg·L-1和8.06 mg·L-1實驗組親溞的總生殖胎數(shù)會顯著減少(P<0.05)，LOEC為5.83 mg·L-1，NOEC為4.33 mg·L-1；4.33、5.83和8.06 mg·L-1實驗組存活親溞的體長會顯著縮短(P<0.05)，LOEC為4.33 mg·L-1，NOEC為2.65 mg·L-1；所有濃度實驗組所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量均顯著性減少(P<0.05)，NOEC為<1.95 mg·L-1。

產(chǎn)幼溞數(shù)量的減少是所有毒性效應中最敏感的指標。以大型溞繁殖抑制率計算EC10為1.63 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.10～2.22 mg·L-1；EC50為5.31 mg·L-1，95%置信區(qū)間為4.74～5.74 mg·L-1。

3 討論(Discussion)

敵草隆和辣椒素對大型溞急性活動抑制的48 h-EC50分別為17.1 mg·L-1和12.4 mg·L-1，對溞類毒性都屬于急性類別3[8]。根據(jù)Wang等[9]的研究，可知辣椒素對羊角月牙藻的EC50為5.114 mg·L-1，對斑馬魚LC50為5.98 mg·L-1，說明在藻、溞和魚3個營養(yǎng)水平的生物中，藻類和魚類對辣椒素的急性毒性更為敏感。有文獻報道，敵草隆對月牙藻的96 h-IC50為10.4 μg·L-1[5]，對近具刺鏈帶藻的72 h-IC50為46.3 μg·L-1[6]，對蚤狀溞繁殖抑制的7 d-LOEC為7.7 mg·L-1，NOEC為4.0 mg·L-1[4]，對黑頭呆魚幼魚的10 d-LC50為27.1 mg·L-1[4]，顯示在3個營養(yǎng)水平中，藻類是對敵草隆最為敏感的物種，與劉亞楠等[1]得出的結論一致。

大型溞慢性毒性指標對敵草隆和辣椒素的敏感性不完全一致。對于敵草隆，各指標敏感性強弱依次為：幼溞數(shù)量>初次生殖時間>體長>總生殖胎數(shù)；對于辣椒素，各指標敏感性強弱依次為：幼溞數(shù)量>體長>總生殖胎數(shù)>初次生殖時間；可見，在所有毒性指標中產(chǎn)幼溞數(shù)量始終是最敏感的毒性指標。蔡小宇等[22]研究壬基酚聚氧乙烯醚對大型溞的慢性毒性時，發(fā)現(xiàn)總生殖胎數(shù)是最敏感的毒性指標；李娜等[23]研究多氯聯(lián)苯(PCB28)對大型溞的慢性毒性時，發(fā)現(xiàn)第一次產(chǎn)卵時間最為敏感。這可能是由于不同化學物質在生物體內的代謝途徑不同，從而導致毒性的癥狀表現(xiàn)不同。

本研究中，敵草隆對大型溞繁殖抑制的21 d-NOEC<1.02 mg·L-1，低于Nebeker和Schuytema[4]研究得出的對蚤狀溞的7 d-NOEC(4.0 mg·L-1)，表明敵草隆在低濃度下長期暴露，仍會對水生生物造成危害。Mansano等[24]在研究敵草隆對新熱帶區(qū)溞類(Ceriodaphniasilvestrii)的慢性毒性中，發(fā)現(xiàn)低濃度(250～2 000 μg·L-1)敵草隆能刺激溞類繁殖，當濃度達到6 000 μg·L-1時才會顯著地(P<0.05)抑制繁殖，抑制繁殖的8 d-NOEC為4 000 μg·L-1，8 d-LOEC為6 000 μg·L-1，這與本研究結果有較大的差異，可能是暴露時間不同或物種差異造成的。ECx是根據(jù)在暴露時間內的濃度-效應曲線，經(jīng)過統(tǒng)計計算獲得的引起x%受試生物產(chǎn)生毒性響應的毒物濃度；而NOEC則是假定存在的一個濃度(或劑量)閾值，毒物低于此閾值即觀察不到顯著毒性效應，但是并非所有化學物質的所有毒性終點都存在上述閾值[25]，且不同實驗濃度設置獲得的該閾值存在差異。近年來，隨著科學技術的發(fā)展，許多研究者主張用ECx(如EC10)替代NOEC，用于化學物質的環(huán)境風險評估[8,26]。本研究中，基于所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量，計算敵草隆對大型溞繁殖抑制的21 d-EC10為0.830 mg·L-1，辣椒素對大型溞繁殖抑制的21 d-EC10為1.63 mg·L-1。根據(jù)《化學品分類和標簽規(guī)范 第28部分：對水生環(huán)境的危害》(GB 30000.28—2013)對慢性毒性的分類標準，同時考慮到敵草隆在環(huán)境中具有持久性，認為敵草隆具有長期的水生危害，屬于慢性類別2；而對于辣椒素，由于其具有快速生物降解性，可判定其沒有長期水生危害，體現(xiàn)了環(huán)境友好性，與Wang等[9]和Oliveira等[15]得出的辣椒素生態(tài)風險評估結論一致。

OECD 211推薦作為大型溞食物的藻種為小球藻(Chlorellasp.)、羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)和近具刺鏈帶藻(Desmodesmussubspicatus)。本研究中，敵草隆的慢性毒性實驗中以斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為食物，不屬于推薦藻種種類，但也能滿足大型溞生長和繁殖的營養(yǎng)需求，空白對照組親溞產(chǎn)存活幼溞數(shù)量的平均數(shù)和標準差為179±7，與熊勤犁等[27]研究中的161±19相近，均能滿足試驗有效的要求。