陳進林，許玉潔，高亮，蔡佳宏，梁嘉慧，余明喧，肖億金，陳桂蘭，馮寶欣，霍嘉維，梅承芳,#，曾國驅(qū),*

1. 廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，廣東省科學院，廣州 510070 2. 華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070 3. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 4. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

敵草隆(diuron)是一種常用的典型防污漆活性添加劑，也是一種抑制植物光合作用的除草劑[1]，其水解、光解和生物降解的半衰期均較長，有環(huán)境持久性[2]。由于長期廣泛的使用，近年來，敵草隆在地表水、海洋環(huán)境中被頻繁檢出，對環(huán)境和人類健康存在一定的潛在風險[3-4]。有研究表明，敵草隆對水生生物有一定的生態(tài)毒性，其中，藻類是對其最為敏感的物種，并且隨著食物鏈的傳遞可在魚類和甲殼類生物體內(nèi)蓄積[1]。Mansano等[5]的研究表明，敵草隆對月牙藻(Raphidocelissubcapitata)的96 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.4 μg·L-1，對近具刺鏈帶藻(Desmodesmussubspicatus)的72 h-IC50為46.3 μg·L-1[6]，顯示出極高的毒性。Nebeker和Schuytema[4]的研究表明，敵草隆對枝角類、端足類、搖蚊、魚類、蚯蚓和螺都有一定的慢性毒性，其中，對蚤狀溞(Daphniapulex)繁殖抑制的7 d最低可觀察效應濃度(LOEC)為7.7 mg·L-1，無可觀察效應濃度(NOEC)為4.0 mg·L-1；對黑頭呆魚幼魚的10 d半致死濃度(LC50)為27.1 mg·L-1。目前，標準化的測試要求更長生命周期的慢性毒性數(shù)據(jù)[7-8]，以支撐對化學品的環(huán)境風險評估。但是，敵草隆對水生甲殼綱枝角類更長生命周期的慢性毒性研究，卻鮮見有報道。

近年來，研究人員一直在探索無毒或低毒、對環(huán)境更友好的防污漆活性物質(zhì)，以替代目前常用的高毒性的物質(zhì)，其中一個研究方向是將低毒、具有殺生活性的天然產(chǎn)物添加于防污漆中[9]。辣椒素(capsaicin)被認為是最具潛力的天然防污漆活性添加劑之一，有研究者認為，與現(xiàn)有防污漆添加劑相比，辣椒素具有很多優(yōu)勢特性[10-13]。LaHann等[14]的研究表明，辣椒素的辛醇-水分配系數(shù)比較低(logKow= 3.04)，表明其不太可能具有生物蓄積性。辣椒素還具有快速生物降解性，對羊角月牙藻生長抑制的72 h半數(shù)效應濃度(EC50)為5.114 mg·L-1，對斑馬魚的96 h-LC50為5.98 mg·L-1[9]。Angarano等[12]的研究表明，辣椒素對大型溞的LC50為18.3 mg·L-1。所以，辣椒素對水生生物具有一定的急性毒性。Oliveira等[15]的研究表明，1 mg·L-1的辣椒素對萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的生長、大型溞的急性活動和斑馬魚胚胎的死亡率均沒有顯著影響，但可以顯著提高胚胎心臟的心率，因此，研究辣椒素在低濃度長期暴露下對水生生物的慢性毒性，顯得尤為必要。

大型溞(Daphniamagna)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼動物綱(Crustacea)，在世界范圍分布廣泛，處在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的第二級(初級消費者)，具有重要的生態(tài)學地位。大型溞體形小、易于實驗室操作和繁殖、全年可獲得幼溞，主要以孤雌生殖方式進行繁殖，易于得到基因型一致的單克隆個體，對有毒物質(zhì)敏感性高，被作為標準測試生物廣泛應用于有毒物質(zhì)的急性和慢性毒性研究[16]，獲得的毒性數(shù)據(jù)是我國新化學物質(zhì)管理常規(guī)登記中必須提供的毒性數(shù)據(jù)之一[17]。

防污漆活性物質(zhì)的廣泛使用為控制船舶和海洋設施的生物污損貢獻巨大，但也導致了在世界范圍內(nèi)的許多港口和碼頭都檢出了高濃度的活性物質(zhì)，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構成了潛在威脅[3]，因此，研發(fā)、篩選獲得無毒或低毒、對環(huán)境友好的活性物質(zhì)成為當前社會的迫切需求。筆者選用大型溞為受試生物，研究敵草隆和辣椒素對大型溞的急性和慢性毒性效應，為其環(huán)境風險評估提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

大型溞引種自沈陽化工研究院安全評價中心，在實驗室用Elendt M4培養(yǎng)基[7,18]培養(yǎng)和繁殖。環(huán)境溫度為(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照強度范圍為1 000～1 500 lux，投喂?jié)饪s的斜生柵藻液(Scenedesmusobliquus)或羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)液，使大型溞始終處于孤雌繁殖狀態(tài)。實驗前，大型溞已于實驗室培養(yǎng)半年以上，驗證其對重鉻酸鉀的24 h-EC50為1.85 mg·L-1，95%的置信限為1.72～1.99 mg·L-1，符合相關國際標準中敏感性范圍(0.6～2.1 mg·L-1)[19-20]。選擇出生<24 h的幼溞作為實驗溞。

敵草隆購自美國Sigma公司，純度≥98%，分子式為C9H10Cl2N2O，CAS號為330-54-1，外觀為白色晶體。辣椒素購自東京化成工業(yè)株式會社，純度>96.0%，分子式為C18H27NO3，CAS號為404-86-4，外觀為白色粉末。

高分離度快速液相色譜儀(RRLC，Agilent 1260，美國)，光照培養(yǎng)箱(PGX-330B-22H，寧波萊福科技有限公司)，pH計(pH3210，WTW，德國)，溶解氧儀(Oxi330i和Oxi3210，WTW，德國)，水質(zhì)硬度計(HI96735，HANNA，意大利)。

1.2 實驗方法

1.2.1 敵草隆分析方法驗證實驗

為了準確表征敵草隆的實際暴露濃度，采用RRLC測定實驗溶液中敵草隆濃度。建立的液相分析條件為：BDS Hypersil C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流動相為水-乙腈(體積比為50∶50)，柱溫40 ℃，檢測器DAD，檢測波長212 nm，流速0.4 mL·min-1，進樣量3.0 μL。

標準曲線范圍和檢出限：準確稱取敵草隆標樣，用乙腈配制成251.7 mg·L-1標準貯備液。然后用50%乙腈逐步稀釋，分別獲得0.126、0.503、1.01、2.52、12.6和50.3 mg·L-1的標準溶液。按上述條件進行測定。以信噪比(S/N)的3倍計算檢出限(LOD)，10倍計算定量限(LOQ)。

精密度分析：取2.52 mg·L-1標準溶液，連續(xù)進樣6次，進行濃度測定。

回收率分析：用試驗用水逐步稀釋標準貯備液或標準溶液，分別獲得理論濃度為1.01、1.26和2.52 mg·L-1的樣品，每個樣品進樣測定3次，以實測濃度與理論濃度的比值計算回收率。

1.2.2 辣椒素分析方法驗證實驗

為了準確表征辣椒素的實際暴露濃度，采用RRLC測定實驗溶液中辣椒素濃度。建立的液相分析條件為：BDS Hypersil C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流動相為0.05%磷酸-甲醇(體積比為30∶70)，柱溫40 ℃，檢測器DAD，檢測波長230 nm，流速0.3 mL·min-1，進樣量5.0 μL。

標準曲線范圍和檢出限：準確稱取辣椒素標樣，用甲醇配制成122.5 mg·L-1標準貯備液。然后用70%甲醇逐步稀釋，分別獲得0.245、0.490、1.96、4.90、12.3和49.0 mg·L-1的標準溶液。按上述條件進行測定。以信噪比(S/N)的3倍計算檢出限(LOD)，10倍計算定量限(LOQ)。

精密度分析：取4.90 mg·L-1標準溶液，連續(xù)進樣6次，進行濃度測定。

回收率分析：用試驗用水逐步稀釋標準貯備液或標準溶液，分別獲得理論濃度為0.490、1.23和2.45 mg·L-1的樣品，每個樣品進樣測定3次，以實測濃度與理論濃度的比值計算回收率。

1.2.3 敵草隆和辣椒素在實驗體系的溶解性和穩(wěn)定性

按照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)系列指南文件No.23[21]的評估方法，通過預試驗，獲知敵草隆和辣椒素均較難溶于水。經(jīng)過約10 min的超聲波分散和約24 h的連續(xù)磁力攪拌，獲得敵草隆和辣椒素在Elendt M4培養(yǎng)基中的飽和溶液(saturation solution, SS)，用RRLC測定其飽和溶解濃度分別為30 mg·L-1和17 mg·L-1。

敵草隆在急性和慢性毒性實驗體系中的濃度在48 h內(nèi)可維持在設置濃度的±20%范圍內(nèi)，因此，可以靜態(tài)方式開展急性毒性實驗，以48 h更換1次暴露溶液的半靜態(tài)方式開展慢性毒性實驗?？赡苁蔷哂锌焖偕锝到庑缘脑?，辣椒素在急性毒性實驗體系中的濃度半衰期約為48 h，在添加了濃縮綠藻液的慢性毒性實驗體系中，濃度下降還可能會加快，因此，均以24 h更換1次暴露溶液的半靜態(tài)方式開展辣椒素的急性和慢性毒性實驗(表1)。

1.2.4 急性毒性實驗

制備受試物的飽和溶液，再用Elendt M4培養(yǎng)基稀釋獲得不同濃度的受試物實驗溶液。參照OECD 202[19]和《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應卷》[18]的方法，通過預實驗，獲得受試物對大型溞未產(chǎn)生活動抑制的最高濃度(EC0)和完全產(chǎn)生活動抑制的最低濃度(EC100)，從而確定正式實驗的濃度范圍。

對于敵草隆，以1.310為濃度間隔系數(shù)，設置10.2、13.3、17.5、22.9和30.0 mg·L-1的受試物實驗組，同時設置空白對照組。對于辣椒素，以1.330為濃度間隔系數(shù)，設置32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS的受試物實驗組，同時設置空白對照組。將每個濃度實驗溶液，分裝入4個試驗容器(150 mL燒杯)，每個容器含50 mL實驗溶液和5只幼溞。環(huán)境溫度控制在(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，實驗持續(xù)48 h。在實驗開始后24 h和48 h，觀察和記錄大型溞的活動抑制情況。實驗期間，不曝氣也不喂食。

在敵草隆的正式實驗中，測定新制備的飽和溶液中敵草隆的實際濃度，再用培養(yǎng)基稀釋獲得各濃度實驗溶液。實驗期間不更換實驗溶液，為靜態(tài)實驗。在0 h和48 h，測定各實驗組的溫度、pH和溶解氧濃度，同時采集實驗溶液，用于測定敵草隆的實際濃度。

在辣椒素的正式實驗中，用培養(yǎng)基直接稀釋新制備的SS溶液，獲得各濃度實驗溶液。實驗期間每24 h更換1次實驗溶液，為24 h半靜態(tài)實驗。在0、24和48 h，測定各實驗組的溫度、pH和溶解氧濃度，同時采集新、舊實驗溶液，用于測定辣椒素的實際濃度。

1.2.5 慢性毒性實驗

參照OECD 211[7]和《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應卷》[18]的方法，依據(jù)大型溞急性活動抑制實驗結果和預實驗結果，設置正式實驗的濃度范圍。對于敵草隆，以1.770為濃度間隔系數(shù)，設置1.02、1.80、3.19、5.56和10.0 mg·L-1的受試物實驗組，同時設置空白對照組；對于辣椒素，以1.351為濃度間隔系數(shù)，設置15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS的受試物實驗組，同時設置空白對照組。每個實驗組設置10個平行(容器)，每個容器(150 mL燒杯)含80 mL實驗溶液和1只親溞。環(huán)境溫度控制在(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照強度范圍為1 000～1 500 lux，實驗周期為21 d。實驗期間，不曝氣，每天向各個容器投喂藻細胞濃縮液，投喂量(以碳計)為0.1～0.2 mg C·溞-1·d-1。

在敵草隆的正式實驗中，每天投喂?jié)饪s的斜生柵藻液，每48 h更換1次實驗溶液，測定每個實驗組在0、8和18 d的新實驗溶液和2、10和20 d的舊實驗溶液中敵草隆的實際濃度，測定空白對照組和1.02、10.0 mg·L-1的實驗組在0、8和18 d的新實驗溶液和2、10和20 d的舊實驗溶液中的溫度、pH、溶解氧濃度和總硬度。

表1 敵草隆和辣椒素在急性和慢性實驗體系中的穩(wěn)定性Table 1 Stability of diuron and capsaicin in test system of acute and chronic test

在辣椒素的正式實驗中，每天投喂?jié)饪s的羊角月牙藻液，每24 h更換1次實驗溶液，測定每個實驗組在實驗開始時、每次更換實驗溶液前后和實驗結束時實驗溶液中辣椒素的實際濃度，測定空白對照組和5% SS、50% SS的實驗組在0、8和15 d的新實驗溶液和1、9和16 d的舊實驗溶液中的溫度、pH、溶解氧濃度和總硬度。

試驗期間，每天觀察親溞的外觀和存活情況，及時移除出生的幼溞并計算存活幼溞的數(shù)量，記錄親溞的死亡率、產(chǎn)幼溞的數(shù)量、初次生殖時間和總生殖胎數(shù)。試驗結束時，測定所有存活親溞的體長。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Office Excel 2010匯總和整理數(shù)據(jù)。

對大型溞急性毒性效應數(shù)據(jù)，用概率分析法(Probit Analysis Method)和修正的斯皮爾曼-卡伯法(Trimmed Spearman-Karber Method)統(tǒng)計EC50。

對大型溞慢性毒性效應數(shù)據(jù)，先進行正態(tài)分布檢驗(Shapiro-Wilk test檢驗)、方差齊性檢驗(Levene’s test檢驗)。在數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且等方差性前提條件下，使用方差分析檢驗顯著性差異，并用多重比較檢驗(Dunnet’t test)分析處理不同濃度間的差異顯著性。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或存在不等方差性時，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)分析其顯著性差異。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件上進行。

2 結果(Results)

2.1 敵草隆和辣椒素分析方法驗證結果

以吸收峰面積為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x)，進行線性回歸分析，結果如圖1所示。敵草隆在0.126～50.3 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值存在極好的線性關系，線性方程為y= 53.6x+ 7.5998 (R2= 0.9998)，LOD為0.0330 mg·L-1，LOQ為0.110 mg·L-1。辣椒素在0.245～49.0 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值的線性關系極好，線性方程為y= 22.8x+ 1.8293 (R2= 0.9999)，LOD為0.0665 mg·L-1，LOQ為0.222 mg·L-1。

精密度分析結果表明，2.52 mg·L-1的敵草隆標準溶液，連續(xù)進樣6次測得的平均峰面積為140.42，相對標準偏差(RSD)為0.23%；4.90 mg·L-1的辣椒素標準溶液，連續(xù)進樣6次測得的平均峰面積為116.69，RSD為0.34%，說明2個分析方法的精密度良好。

回收率分析結果表明，加標1.01、1.26和2.52 mg·L-1的敵草隆樣品的平均回收率分別為92.2%、96.2%和102%；加標0.490、1.23和2.45 mg·L-1的辣椒素樣品的平均回收率分別為89.2%、92.9%和97.3%，說明2個分析方法的回收率良好(表2)。

表2 敵草隆和辣椒素回收率實驗結果Table 2 Results of recovery test for diuron and capsaicin

2.2 敵草隆和辣椒素在實驗體系的穩(wěn)定性和暴露濃度的表征

正式實驗中，敵草隆的實測濃度在48 h內(nèi)能始終維持在設置濃度的±20%范圍內(nèi)，與預實驗的情況一致，可直接以設置濃度表示敵草隆的暴露濃度。

由于辣椒素具有快速生物降解性，在其慢性毒性正式實驗中，可能是加入濃縮的藻液加速了其降解，在24 h內(nèi)其部分實測濃度低于初始濃度的80%，因此，需以實測濃度的時間-加權平均值表示其暴露濃度[21]。急性毒性正式實驗中，32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS實驗組的時間-加權平均值分別為4.52、6.01、8.08、10.9和14.6 mg·L-1；慢性毒性正式實驗中，15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS實驗組的時間-加權平均值分別為1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1。

圖1 敵草隆和辣椒素的分析標準曲線Fig. 1 Standard curve for analysis of diuron and capsaicin

2.3 對大型溞的急性毒性

急性毒性實驗中，溶液的pH在7.62～8.22范圍內(nèi)，溶解氧濃度在4.7～8.3 mg·L-1之間，始終滿足不低于3 mg·L-1的實驗有效性要求。2組實驗的空白對照組大型溞表觀均正常，無活動抑制和死亡現(xiàn)象。大型溞暴露于不同濃度的實驗溶液后，隨著時間的延長，在不同濃度組中表現(xiàn)出不同程度的活動抑制，濃度-效應相關性顯著。

敵草隆對大型溞的24 h和48 h EC50分別為>30 mg·L-1和17.1 mg·L-1；辣椒素對大型溞的24 h和48 h EC50分別為13.3 mg·L-1和12.4 mg·L-1，如表3所示?？梢?，大型溞對辣椒素的毒性響應較快，但到48 h時，兩者所呈現(xiàn)的急性毒性水平相當。根據(jù)《化學品分類和標簽規(guī)范 第28部分：對水生環(huán)境的危害》(GB 30000.28—2013)[8]的急性分類標準，敵草隆和辣椒素對大型溞都屬于急性水生危害的類別3。

表3 敵草隆和辣椒素對大型溞急性毒性效應Table 3 Acute toxicity of diuron and capsaicin to Daphnia magna

2.4 對大型溞的慢性毒性

敵草隆和辣椒素的慢性毒性實驗中，空白對照組親溞的死亡率均為0%，所產(chǎn)存活幼溞數(shù)量的平均數(shù)和標準差分別為179±7(變異系數(shù)為3.9%)和158±14(變異系數(shù)為8.3%)，均>60，滿足OECD 211對實驗有效性的要求，變異系數(shù)均<25%，表明實驗運行的質(zhì)量良好。實驗溶液的pH在7.80～8.81范圍內(nèi)，溶解氧濃度在7.5～9.1 mg·L-1范圍內(nèi)，水溫在19. 5～20.8 ℃之間，水質(zhì)總硬度為260～270 mg·L-1(以CaCO3計)，光照強度范圍在1 010～1 375 lux。

2.4.1 敵草隆的慢性毒性

各項毒性指標結果如表4所示。1.02、1.80、3.19、5.65和10.0 mg·L-1實驗組的親溞死亡率分別為0%、0%、0%、0%和20%，經(jīng)Cochran-Armitage趨勢檢驗，顯示濃度與親溞死亡率之間有緊密的相關性，表明敵草隆具有一定的慢性致死效應。

表4 敵草隆對大型溞慢性毒性實驗各項毒性指標結果匯總Table 4 Summary of all endpoints observed in the chronic test of diuron to Daphnia magna

敵草隆對大型溞的初次生殖時間、總生殖胎數(shù)、體長和產(chǎn)存活幼溞數(shù)量都存在不同程度的毒性效應。與空白對照組相比，1.80、5.65和10.0 mg·L-1實驗組能顯著延遲(P<0.05)大型溞的初次生殖時間，LOEC為1.80 mg·L-1，NOEC為1.02 mg·L-1；10.0 mg·L-1實驗組親溞始終未產(chǎn)幼溞，數(shù)量為0(P<0.05)，LOEC為10.0 mg·L-1，NOEC為5.65 mg·L-1；5.65 mg·L-1和10.0 mg·L-1實驗組存活親溞的體長顯著縮短(P<0.05)，LOEC為5.65 mg·L-1，NOEC為3.19 mg·L-1；所有濃度實驗組所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量均顯著性減少(P<0.05)，NOEC為<1.02 mg·L-1。

產(chǎn)幼溞數(shù)量的減少是所有毒性效應中最敏感的指標。以大型溞繁殖抑制率計算EC10為0.830 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.696～5.67 mg·L-1；EC50為7.52 mg·L-1，95%置信區(qū)間為7.45～7.59 mg·L-1。

2.4.2 辣椒素的慢性毒性

各項毒性指標結果如表5所示。1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1實驗組的親溞死亡率分別為0%、0%、10%、10%和30%，經(jīng)Cochran-Armitage趨勢檢驗，顯示濃度與親溞死亡率之間有緊密的相關性，表明辣椒素具有一定的慢性致死效應。

表5 辣椒素對大型溞慢性毒性實驗各項毒性指標結果匯總Table 5 Summary of all endpoints observed in the chronic test of capsaicin to Daphnia magna

辣椒素對大型溞的初次生殖時間、總生殖胎數(shù)、體長和產(chǎn)存活幼溞數(shù)量都存在不同程度的毒性效應。與空白對照組相比，8.06 mg·L-1實驗組能顯著延遲(P<0.05)大型溞的初次生殖時間，LOEC為8.06 mg·L-1，NOEC為5.83 mg·L-1；5.83 mg·L-1和8.06 mg·L-1實驗組親溞的總生殖胎數(shù)會顯著減少(P<0.05)，LOEC為5.83 mg·L-1，NOEC為4.33 mg·L-1；4.33、5.83和8.06 mg·L-1實驗組存活親溞的體長會顯著縮短(P<0.05)，LOEC為4.33 mg·L-1，NOEC為2.65 mg·L-1；所有濃度實驗組所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量均顯著性減少(P<0.05)，NOEC為<1.95 mg·L-1。

產(chǎn)幼溞數(shù)量的減少是所有毒性效應中最敏感的指標。以大型溞繁殖抑制率計算EC10為1.63 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.10～2.22 mg·L-1；EC50為5.31 mg·L-1，95%置信區(qū)間為4.74～5.74 mg·L-1。

3 討論(Discussion)

敵草隆和辣椒素對大型溞急性活動抑制的48 h-EC50分別為17.1 mg·L-1和12.4 mg·L-1，對溞類毒性都屬于急性類別3[8]。根據(jù)Wang等[9]的研究，可知辣椒素對羊角月牙藻的EC50為5.114 mg·L-1，對斑馬魚LC50為5.98 mg·L-1，說明在藻、溞和魚3個營養(yǎng)水平的生物中，藻類和魚類對辣椒素的急性毒性更為敏感。有文獻報道，敵草隆對月牙藻的96 h-IC50為10.4 μg·L-1[5]，對近具刺鏈帶藻的72 h-IC50為46.3 μg·L-1[6]，對蚤狀溞繁殖抑制的7 d-LOEC為7.7 mg·L-1，NOEC為4.0 mg·L-1[4]，對黑頭呆魚幼魚的10 d-LC50為27.1 mg·L-1[4]，顯示在3個營養(yǎng)水平中，藻類是對敵草隆最為敏感的物種，與劉亞楠等[1]得出的結論一致。

大型溞慢性毒性指標對敵草隆和辣椒素的敏感性不完全一致。對于敵草隆，各指標敏感性強弱依次為：幼溞數(shù)量>初次生殖時間>體長>總生殖胎數(shù)；對于辣椒素，各指標敏感性強弱依次為：幼溞數(shù)量>體長>總生殖胎數(shù)>初次生殖時間；可見，在所有毒性指標中產(chǎn)幼溞數(shù)量始終是最敏感的毒性指標。蔡小宇等[22]研究壬基酚聚氧乙烯醚對大型溞的慢性毒性時，發(fā)現(xiàn)總生殖胎數(shù)是最敏感的毒性指標；李娜等[23]研究多氯聯(lián)苯(PCB28)對大型溞的慢性毒性時，發(fā)現(xiàn)第一次產(chǎn)卵時間最為敏感。這可能是由于不同化學物質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝途徑不同，從而導致毒性的癥狀表現(xiàn)不同。

本研究中，敵草隆對大型溞繁殖抑制的21 d-NOEC<1.02 mg·L-1，低于Nebeker和Schuytema[4]研究得出的對蚤狀溞的7 d-NOEC(4.0 mg·L-1)，表明敵草隆在低濃度下長期暴露，仍會對水生生物造成危害。Mansano等[24]在研究敵草隆對新熱帶區(qū)溞類(Ceriodaphniasilvestrii)的慢性毒性中，發(fā)現(xiàn)低濃度(250～2 000 μg·L-1)敵草隆能刺激溞類繁殖，當濃度達到6 000 μg·L-1時才會顯著地(P<0.05)抑制繁殖，抑制繁殖的8 d-NOEC為4 000 μg·L-1，8 d-LOEC為6 000 μg·L-1，這與本研究結果有較大的差異，可能是暴露時間不同或物種差異造成的。ECx是根據(jù)在暴露時間內(nèi)的濃度-效應曲線，經(jīng)過統(tǒng)計計算獲得的引起x%受試生物產(chǎn)生毒性響應的毒物濃度；而NOEC則是假定存在的一個濃度(或劑量)閾值，毒物低于此閾值即觀察不到顯著毒性效應，但是并非所有化學物質(zhì)的所有毒性終點都存在上述閾值[25]，且不同實驗濃度設置獲得的該閾值存在差異。近年來，隨著科學技術的發(fā)展，許多研究者主張用ECx(如EC10)替代NOEC，用于化學物質(zhì)的環(huán)境風險評估[8,26]。本研究中，基于所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量，計算敵草隆對大型溞繁殖抑制的21 d-EC10為0.830 mg·L-1，辣椒素對大型溞繁殖抑制的21 d-EC10為1.63 mg·L-1。根據(jù)《化學品分類和標簽規(guī)范 第28部分：對水生環(huán)境的危害》(GB 30000.28—2013)對慢性毒性的分類標準，同時考慮到敵草隆在環(huán)境中具有持久性，認為敵草隆具有長期的水生危害，屬于慢性類別2；而對于辣椒素，由于其具有快速生物降解性，可判定其沒有長期水生危害，體現(xiàn)了環(huán)境友好性，與Wang等[9]和Oliveira等[15]得出的辣椒素生態(tài)風險評估結論一致。

OECD 211推薦作為大型溞食物的藻種為小球藻(Chlorellasp.)、羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)和近具刺鏈帶藻(Desmodesmussubspicatus)。本研究中，敵草隆的慢性毒性實驗中以斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為食物，不屬于推薦藻種種類，但也能滿足大型溞生長和繁殖的營養(yǎng)需求，空白對照組親溞產(chǎn)存活幼溞數(shù)量的平均數(shù)和標準差為179±7，與熊勤犁等[27]研究中的161±19相近，均能滿足試驗有效的要求。