于華，劉亞君，梅小慶，趙佳麗，張紅，陳夢媛

(1.四川工業(yè)科技學(xué)院 食品學(xué)院，四川 德陽 618500；2.四川工業(yè)科技學(xué)院 電子信息與計算機工程學(xué)院，四川 德陽 618500)

豆豉是以黑豆或黃豆為原料，利用微生物發(fā)酵制成的一種具有獨特風(fēng)味的中國民族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。近些年來，其保健功能引起了研究者及消費者的高度關(guān)注[1]。已有的研究結(jié)果表明，豆豉具有良好的抗氧化性、降血壓和抗糖尿病等功能特性[2]。同時，豆豉中風(fēng)味物質(zhì)的形成機制歷來備受關(guān)注，其風(fēng)味來源主要是微生物在豆豉中生長分泌的各種酶，降解了豆中的蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)，水解后的次級代謝產(chǎn)物之間又經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，從而生成獨特的風(fēng)味物質(zhì)[3]。

豆豉中風(fēng)味物質(zhì)的研究，前期依靠人的感官對其進行評判，但由于人的主觀因素該方法最終被淘汰。隨著科技的發(fā)展出現(xiàn)了頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法和高效液相色譜法，更快速、方便、準(zhǔn)確地測定食品中的風(fēng)味物質(zhì)[4]。豆豉中風(fēng)味物質(zhì)的分析主要為測定有機酸、揮發(fā)性物質(zhì)和游離氨基酸。近年來對豆豉中揮發(fā)性物質(zhì)和功能性物質(zhì)的研究越來越多，但大多是對豆豉風(fēng)味物質(zhì)的簡單檢測，對于豆豉混菌發(fā)酵中各功能菌的相互作用影響風(fēng)味以及豆豉中各風(fēng)味物質(zhì)貢獻作用的研究較少。

本文對傳統(tǒng)的米曲霉型制曲工藝進行改進，在人工接種米曲霉的基礎(chǔ)上，又添加了異常威克漢姆酵母、乳酸片球菌和產(chǎn)酸芽孢桿菌等功能菌，以及不同配比，最終分析各種功能菌和功能菌相互作用對米曲霉型豆豉風(fēng)味物質(zhì)的影響。本研究對今后米曲霉型豆豉制作工藝的改進、功能菌以及風(fēng)味物質(zhì)的確定有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

黃豆：購于超市，成都人民營養(yǎng)食品廠；米曲霉孢子：石家莊市鼎鑫釀造食品科學(xué)研究所；異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和產(chǎn)酸芽孢桿菌(Bacillusacidiproducens)：學(xué)院實驗室提供。

試劑：甲醛、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、無水乙酸鈉、硫酸鎂、牛肉膏、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、氫氧化鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸等，以上藥品均為分析純；琥珀酸、草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、乙酸，以上藥品均為色譜純。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GZ-250-HS Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱；SW-CJ-IFD潔凈工作臺；GR60DF立式自動壓力蒸汽滅菌鍋；BH200生物顯微鏡；CP214電子天平；DZKW-4電子恒溫水浴鍋；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Starter 2C實驗室pH計；78HW-1恒溫磁力攪拌器；超聲波清洗機；高效液相色譜儀；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；固相微萃取裝置(包括手柄、導(dǎo)向桿、85 μm CAR-PDMS萃取纖維頭)。

1.2 試驗方法

1.2.1 功能菌菌懸液的制備[5]

分別將實驗室保藏的異常威克漢姆酵母、乳酸片球菌和產(chǎn)酸芽孢桿菌在相應(yīng)的MRS平板培養(yǎng)基或YPD平板培養(yǎng)基上活化。將活化菌株接種于相應(yīng)的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)后期，用無菌生理鹽水洗脫，使其濃度達到108CFU/mL，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 豆豉制備[6]

浸豆：稱取6份黃豆，每份100.0 g，將黃豆洗凈，放入40 ℃的溫水中恒溫浸泡3.5 h(重量增加約2.1倍，豆粒脹起無皺紋)，放掉浸泡水，瀝干。

蒸豆：把浸泡后瀝干水分的大豆放至壓力鍋中，蓋好鍋蓋，121 ℃蒸30 min，大豆蒸熟。

前發(fā)酵：將蒸熟的大豆拿出鍋，冷卻，添加功能菌，拌勻，放于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大豆的厚度約為3 cm，發(fā)酵12 h后每9 h翻一次，使每顆大豆都松散、不結(jié)塊。

添加功能菌：第一份加入0.0300 g米曲霉，記為1號樣；第二份加入0.0300 g米曲霉和2 mL異常威克漢姆酵母菌懸液，記為2號樣；第三份加入0.0300 g米曲霉和2 mL乳酸片球菌菌懸液，記為3號樣；第四份加入0.0300 g米曲霉和2 mL產(chǎn)酸芽孢桿菌菌懸液，記為4號樣；第五份加入0.0300 g米曲霉、1 mL異常威克漢姆酵母菌懸液和1 mL乳酸片球菌菌懸液，記為5號樣；第六份加入0.0300 g米曲霉和3種菌的混合菌懸液2 mL，記為6號樣。

洗曲：用約50 ℃清水把豆豉成品表面的霉菌以及污物清洗干凈，清洗4～6次，注意不要破皮。

后發(fā)酵：將大豆瀝干(每份的質(zhì)量大約為167 g，重量增加至干黃豆的1.67倍)，加入12.0 g食鹽，拌勻，壓實裝罐密封，在37 ℃培養(yǎng)箱中進行后發(fā)酵，每隔2天測定其總酸和氨基酸態(tài)氮含量。

干豆豉：豆豉后發(fā)酵完成后，將豆豉放入真空干燥箱35 ℃干燥12 h，即為成熟豆豉。

1.2.3 豆豉中總酸的測定[7]

準(zhǔn)確稱取5.0000 g的豆豉用研缽磨碎，加適量的蒸餾水，浸泡3 h，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并定容，搖勻，過濾，去其初濾液(20 mL左右)，取濾液20 mL于燒杯中，按GB/T 5009.39-2003中4.2.1.4從“置于200 mL燒杯中加入60 mL水……可計算總酸含量”依次操作。計算參照GB/T 5009.39-2003中4.4.5。

1.2.4 豆豉中氨基酸態(tài)氮的測定

取上述濾液20 mL于燒杯中，按GB/T 5009.39-2003中4.2.1.4自“置于200 mL燒杯中加入60 mL水……”起依次操作。同時做空白試驗，計算參照GB/T 5009.39-2003中4.2.1.5。

1.2.5 豆豉中有機酸的測定

1.2.5.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取磨碎的2.5 g豆豉，研磨后轉(zhuǎn)入到100 mL離心管中，加入50 mL超純水，于超聲波清洗機中提取30 min，溫度為60 ℃，使有機酸充分浸出，冷卻后4000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，殘渣加入25 mL超純水再提取，合并上清液，加入2 mL的10.6%亞鐵氰化鉀溶液和2 mL的30%硫酸鋅溶液沉淀蛋白，用超純水定容至刻度，搖勻，靜置30 min。吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾，濾液供HPLC檢測[8]。

1.2.5.2 色譜條件[9,10]

色譜柱：Agilent ZORBAX-SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相A為0.5%磷酸氫二銨，并用H3PO4調(diào)節(jié)pH為2.5，流動相B為甲醇，流動相A∶流動相B為95∶5；流速為0.400 mL/min；檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃。

1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取各有機酸標(biāo)準(zhǔn)品0.2000 g(或0.2 mL)以超純水溶解并定容至100 mL備用。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)混合母液，用超純水稀釋成0.500，0.200，0.100，0.020，0.010 mg/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。進樣檢測，分別測定不同標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間，及其不同濃度所對應(yīng)的峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照定量計算。

1.2.5.4 樣品測定

各待測樣品處理后上機檢測，記錄數(shù)據(jù)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照定量計算。

1.2.6 豆豉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定[11,12]

1.2.6.1 樣品處理

取3 g豆豉樣品磨碎，放入20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，蓋上密封墊和鋁帽，密閉后于磁力攪拌器上在50 ℃加熱平衡20 min后，將萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，恒溫吸附30 min，然后縮回萃取纖維頭，插入氣相色譜進樣口解吸5 min。

1.2.6.2 色譜條件

色譜柱Rtx-5MS為非極性毛細管柱；載氣為He，流速1.0 mL/min，不分流進樣；程序升溫：柱初溫55 ℃保持1 min，升溫速率：6 ℃/min，終溫230 ℃保持5 min。電離方式：電子電離；電離能：70 eV；電壓：350 V；接口溫度：230 ℃；掃描范圍：35～400 u。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 功能菌對豆豉中總酸和氨基酸態(tài)氮合成的影響

2.1.1 功能菌對豆豉中總酸合成的影響

豆豉發(fā)酵的酸度會直接影響微生物的生長代謝及種類，對豆豉的品質(zhì)好壞有一定的影響[13]。本試驗在后發(fā)酵期間每隔3 d分別在6個豆豉樣品中取樣，然后用電位滴定法測定不同樣品不同時期的總酸變化情況，見圖1。

圖1 總酸的變化趨勢圖Fig.1 Change trend chart of total acids’ content

由圖1可知，豆豉在發(fā)酵過程中總酸一直呈增長趨勢，前期較為迅速，后期緩慢，第7天后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵前期，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物代謝較快，產(chǎn)生大量有機酸，總酸增長迅速；發(fā)酵后期，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機酸的積累，發(fā)酵環(huán)境處于高酸性，低營養(yǎng)狀態(tài)，從而導(dǎo)致微生物代謝緩慢，總酸含量增長緩慢。總酸最終含量分別為：1號樣1.579 g/100 g，2號樣1.904 g/100 g，3號樣1.971 g/100 g，4號樣1.791 g/100 g，5號樣1.771 g/100 g，6號樣1.504 g/100 g。由此可以看出，異常威克漢姆酵母菌和乳酸片球菌對總酸的貢獻較大，其他菌體和混菌對總酸的促進作用不大。

2.1.2 功能菌對豆豉中氨基酸態(tài)氮合成的影響

在豆豉發(fā)酵過程中，氨基酸態(tài)氮含量可以反映蛋白質(zhì)水解程度，其含量是反映豆豉是否成熟的重要指標(biāo)，且氨基酸態(tài)氮是豆豉中主要鮮味作用的一種風(fēng)味物質(zhì)[14]。在每次測定總酸時，同時進行氨基酸態(tài)氮的測定，不同樣品不同時期的氨基酸態(tài)氮變化情況見圖2。

圖2 后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化趨勢圖Fig.2 Change trend chart of amino acid nitrogen content in the post fermentation process

由圖2可知，豆豉在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮一直呈增長趨勢，前期較為迅速，后期緩慢，第7天后趨于穩(wěn)定，和總酸的變化趨勢一樣。由2圖可知米曲霉型豆豉在制曲階段額外加入功能菌并沒有對后發(fā)酵時間造成影響，但是對豆豉中氨基酸態(tài)氮含量有一定的影響，最終含量分別為：1號樣1.712 g/100 g，2號樣1.900 g/100 g，3號樣1.610 g/100 g，4號樣1.470 g/100 g，5號樣1.550 g/100 g，6號樣1.326 g/100 g。由此可以看出，異常威克漢姆酵母菌對氨基酸態(tài)氮貢獻最大，其他菌體和混菌均對其有抑制作用。且總酸和氨基酸態(tài)氮含量最低的都是6號樣，可知并不是加入的功能菌種類越多，總酸、氨基酸態(tài)氮含量就越高，有可能是菌種之間相互影響，氨基酸轉(zhuǎn)換成了其他物質(zhì)。

2.2 功能菌對豆豉中有機酸合成的影響

2.2.1 標(biāo)品有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)品為酒石酸、蘋果酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、草酸、甲酸、琥珀酸、丙酸9種有機酸，分別進行5個濃度梯度的有機酸混標(biāo)檢測，梯度為0.010～0.500 mg/mL，其中各有機酸標(biāo)品濃度為0.500 mg/mL(或0.500 mL/mL)的高效液相色譜圖見圖3，各有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

圖3 有機酸混合標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of organic acid mixing standard samples

由圖3可以清晰地看到不同的時間段出現(xiàn)了9個峰，分別對應(yīng)9種有機酸：草酸、酒石酸、蘋果酸、甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸。

表1 9種有機酸標(biāo)品測定的線性相關(guān)性Table 1 The linear correlation of the determination of 9 organic acid standard samples

將濃度在0.01～0.500 mg/mL(mL/mL)范圍內(nèi)的系列混標(biāo)溶液進行HPLC分析，對各測得值進行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析。結(jié)果表明：除乙酸的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.929之外，其余的都大于0.990，說明各種有機酸組分的峰面積和有機酸組分濃度的線性相關(guān)性總體上很好，在誤差允許范圍內(nèi)可以很好地測定有機酸的含量。

2.2.2 6個樣品中有機酸測定的結(jié)果

6個樣品中有機酸測定的結(jié)果見表2。

表2 6個樣品中有機酸的比較Table 2 The comparison of organic acids’ content in 6 samples

由表2可知，總體上各功能菌對米曲霉型豆豉混菌發(fā)酵產(chǎn)生有機酸貢獻不大，其中只有3號樣的有機酸種類最多，與1號樣相比，種類上多了一種甲酸；檸檬酸增加了約8.6倍；琥珀酸增加了約23.5倍，并且HPLC色譜圖中還有12個峰的保留時間與標(biāo)品不一致。2號樣雖然與1號樣的有機酸種類一樣，但除酒石酸、蘋果酸、琥珀酸之外，其余的有機酸含量均有所下降。4，5號樣中有機酸的種類和含量都較少，6號樣沒有檢測出標(biāo)品有機酸。所以，3種功能菌中只有乳酸片球菌對米曲霉型豆豉混菌發(fā)酵產(chǎn)生有機酸的貢獻最大。

2.3 功能菌對豆豉揮發(fā)性物質(zhì)合成的影響

豆豉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果見表3和表4。

表3 豆豉中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量Table 3 The content of volatile flavor components in fermented blank beans

續(xù) 表

表4 豆豉樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種類的比較Table 4 The comparison of volatile substances’ types in fermented blank beans samples

由表3和表4可知，6個豆豉樣品中檢測出了8類揮發(fā)性物質(zhì)，分別為芳香烴類、醇類、酚類、呋喃、吡嗪、酮類、酸類和烷烯烴類，共23種風(fēng)味物質(zhì)。共同含有的物質(zhì)有：苯甲醛、2,3-丁二醇、2,3,5-三甲基吡嗪、乙酸4種物質(zhì)。檢測出的成分中沒有酯類，可能是因為干燥時間過長，并且沒有在真空干燥箱中進行，使酯類物質(zhì)揮發(fā)。2號樣中的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，共有16種，與1號樣相比，雖然吡嗪類種類較少，但醇類豐富，醇類的相對含量高達35%，所以異常威克漢姆酵母在醇類風(fēng)味物質(zhì)的形成過程中貢獻最大。3，4，5，6號樣中檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類都少于1號樣，但是這4個樣中都含有2,3-丁二酮和乙偶姻，1，2號樣中均不含這兩種酮。所以乳酸片球菌、產(chǎn)酸芽孢桿菌和多種功能菌共同作用在豆豉酮類風(fēng)味物質(zhì)的形成過程中都有一定的貢獻作用。但綜合分析產(chǎn)酸芽孢桿菌和不同功能菌的組合對豆豉總酸、氨基酸態(tài)氮、有機酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成沒有促進作用。

3 結(jié)論

本試驗采用傳統(tǒng)的米曲霉型豆豉發(fā)酵工藝在制曲階段分別加入了不同種功能菌，進行混菌發(fā)酵，并對其總酸、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性物質(zhì)及有機酸等風(fēng)味物質(zhì)進行測定。結(jié)果顯示：異常威克漢姆酵母對豆豉中氨基酸態(tài)氮的形成有較大的促進作用，含量為1.900 g/100 g。并且在有機酸、醇類風(fēng)味物質(zhì)的形成過程中貢獻最大，形成了異戊醇、5-甲基-3-庚醇、5-甲基-2-環(huán)己醇、2,3-丁烯-2-醇等獨特風(fēng)味物質(zhì)，醇類的相對含量高達35%。乳酸片球菌對豆豉中總酸的形成有較大的促進作用，含量為1.971 g/100 g，在酮類和有機酸風(fēng)味物質(zhì)的形成過程中貢獻最大，生成2,3-丁二酮和乙偶姻獨特風(fēng)味物質(zhì)，使檸檬酸增加了約8.6倍，琥珀酸增加了約23.5倍。產(chǎn)酸芽孢桿菌、異常威克漢姆酵母與乳酸片球菌混合以及3種功能菌混合作用對豆豉中總酸、氨基酸態(tài)氮和風(fēng)味物質(zhì)的貢獻都不明顯。此研究對于傳統(tǒng)曲霉發(fā)酵中接種功能菌對豆豉風(fēng)味的影響奠定了基礎(chǔ)，對在工業(yè)上提升豆豉發(fā)酵工藝有重要意義。