張維 任錦麗 楊嬌 廖章伊 張雅琴

摘要：目的：探討燕麥β葡聚糖（oat βglucan，OG）對糖尿病大鼠腎功能及腸道菌群的影響。方法：采用單側(cè)腎切除+鏈脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射方式構(gòu)建糖尿病腎?。╠iabetes nephropathy，DN）大鼠模型，將造模成功32只SD雄性大鼠隨機分為4組：模型對照組（蒸餾水灌胃）和低、中、高燕麥β葡聚糖干預(yù)組（分別用0275、055、11g/kg·BW燕麥β葡聚糖灌胃），每組8只。另取16只大鼠行假手術(shù)并隨機分組：正常對照組（蒸餾水灌胃）和燕麥β葡聚糖對照組（055g/kg·BW 燕麥β葡聚糖灌胃）。飼養(yǎng)8周，在第8周末采集血液、尿液和糞便，進(jìn)行血糖、腎功能檢測，用HE染色進(jìn)行腎臟形態(tài)學(xué)觀察，16S rDNA檢測分析腸道菌群多樣性。結(jié)果：高劑量燕麥β葡聚糖能顯著降低DN大鼠血糖（P<005），低、中劑量燕麥β葡聚糖能顯著降低DN大鼠血尿素氮、肌酐;中、高劑量燕麥β葡聚糖能降低DN大鼠的尿酸/肌酐比值（P<005）;高劑量燕麥β葡聚糖對DN大鼠的腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變形、脫落，系膜細(xì)胞增生有顯著改善作用;高劑量燕麥β葡聚糖能顯著升高DN大鼠腸道菌群豐度和多樣性、厚壁菌門/擬桿菌門的比值（P<005）。結(jié)論：燕麥β葡聚糖能改善糖尿病大鼠腎功能，增加腸道菌群豐度和多樣性及升高厚壁菌門/擬桿菌門的比值，這可能是其延緩DN的機制之一。

關(guān)鍵詞：燕麥β葡聚糖;糖尿病腎病;腸道菌群

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要病因之一[1]。研究證實，燕麥的主要功能成分是β葡聚糖，燕麥β葡聚糖（oat βglucan，OG）是一種水溶性膳食纖維，主要存在于燕麥胚乳和糊粉層細(xì)胞壁中，由β（1，3）和β（1，4）糖苷鍵連接形成一種不可消化的βD葡聚糖，而這一特殊結(jié)構(gòu)使得燕麥β葡聚糖具有降低血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[25]。近年來，DN與腸道菌群的相關(guān)性引起了科學(xué)界的關(guān)注，腸道菌群的變化與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[68]。因此，我們推測改善腸道菌群是從源頭上減少DN的發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)，本研究建立DN大鼠模型，觀察燕麥β葡聚糖對糖尿病大鼠腎功能及其腸道菌群的影響。

1材料與方法

11實驗動物及受試物

56只雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于SPF級動物室，溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，動物自由進(jìn)食與飲水，基礎(chǔ)飼料為（American Institute of Nutrition1993 Maintenance），AIN93M配方。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗，本項目經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)動物倫理委員會審查通過。燕麥β葡聚糖（陜西森弗天然制品有限公司）純度70%，HPLC級。

12糖尿病腎病大鼠模型建立與分組

選擇40只大鼠行左側(cè)腎切除術(shù)，術(shù)后一次性腹腔注射65mg/kg鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（001mol/L pH 45檸檬酸鈉檸檬酸緩沖液配制）。尾靜脈采血檢測血糖水平，7d后空腹血糖>111mmol/L確定DN模型成功。造模成功的32只DN大鼠，隨機分為4組：模型對照組（蒸餾水灌胃）和低、中、高燕麥β葡聚糖干預(yù)組（分別用0275、055、11g/kg·BW燕麥β葡聚糖灌胃），每組8只。另取16只大鼠行假手術(shù)并隨機分組：正常對照組（蒸餾水灌胃）和燕麥β葡聚糖對照組（055g/kg·BW 燕麥β葡聚糖灌胃）。飼養(yǎng)8周，實驗結(jié)束后采集血清、尿液及新鮮糞便，股動脈采血（禁食12h）后處死大鼠，迅速取出右側(cè)腎臟轉(zhuǎn)入凍存管，-80℃下保存待測。

13檢測指標(biāo)

（1）體重、進(jìn)食量監(jiān)測：每周進(jìn)行體重、進(jìn)食量監(jiān)測。（2）血糖及腎功能指標(biāo)檢測：采用全自動生化分析儀檢測大鼠血糖、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，CR）的含量。（3）腎臟形態(tài)學(xué)檢測：以10%多聚甲醛固定腎臟組織，將組織脫水、透明、浸蠟，包埋后切片，切片厚度為4μm，進(jìn)行蘇木精伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，用顯微鏡觀察組織形態(tài)。（4）16S rDNA腸道菌群測序：利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA質(zhì)檢，具體步驟按照說明書操作，所提取的DNA于-80℃保存。前引物序列：CCTACGGGRSGCAGCAG;后引物序列：GGACTACVVGGGTATCTAATC。將得到的PCR產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫，采用Illumina Miseq 平臺測序，對高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該部分由上海銳翌生物科技有限公司完成。

14統(tǒng)計分析

采用SPSS 200統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，連續(xù)變量均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

21大鼠進(jìn)食量變化情況

實驗第0周，正常對照組進(jìn)食量[（1134±2258）g]與燕麥β葡聚糖對照組進(jìn)食量[（11517±1942）g]無顯著差異，模型對照組[（18058±2217）g]與低[（17565±2044）g]、中[（17914±2474）g]、高[（1709±1168）g]燕麥β葡聚糖干預(yù)組進(jìn)食量無顯著差異。隨著實驗進(jìn)展，各組大鼠的進(jìn)食量都增加。但正常對照組，燕麥β葡聚糖對照組，低、中燕麥β葡聚糖干預(yù)組進(jìn)食量增加不明顯（P>005），模型對照組、高劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組進(jìn)食量顯著增加（P<005），且3個燕麥β葡聚糖干預(yù)組進(jìn)食量均低于模型對照組（P<005）（圖1）。

22大鼠體重變化情況

實驗第0周，正常對照組體重[（33035±2676）g]與燕麥β葡聚糖對照組體重[（34261±1985）g]無顯著差異。模型對照組[（22530±2432）g]與低[（20760±2629）g]、中[（24121±1916）g]、高[（23120±2665）g]燕麥β葡聚糖干預(yù)組體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。干預(yù)第8周，正常對照組與燕麥β葡聚糖對照組體重均上升，但兩組體重上升趨勢相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）;模型對照組、3個燕麥β葡聚干預(yù)組的體重均下降，各組體重下降趨勢相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）（圖2）。

23燕麥β葡聚糖對大鼠血糖的影響

干預(yù)第8周，與正常對照組相比，模型對照組血糖升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）;與模型對照組相比，3個燕麥β葡聚糖干預(yù)組血糖均下降，且高劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組血糖顯著下降（P<005）（表1）。

24燕麥β葡聚糖對大鼠腎功能的影響

干預(yù)第8周，與正常對照組相比，模型對照組的BUN、CR、UA、尿酸/肌酐均顯著升高（P<005）;與模型對照組相比，低、中劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組BUN、CR顯著下降（P<005）;中、高劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組尿酸/肌酐比值顯著下降（P<001）;燕麥β葡聚糖干預(yù)組對UA無影響（P>005）（表2）。

25燕麥β葡聚糖對大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響

干預(yù)第8周，與正常對照組相比，模型對照組腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變形、脫落，細(xì)胞增生，可見輕度玻璃樣改變（圖3C）;與模型對照組相比，燕麥β葡聚糖干預(yù)組腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變形、脫落，系膜細(xì)胞增生均有改善，高劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組改善最明顯，與正常對照組的腎小球系膜基質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)相近（圖3F），但低劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組仍有輕度玻璃樣改變（圖3D）。

26腸道菌群多樣性分析

干預(yù)第8周，與正常對照組相比，模型對照組腸道菌群豐度和多樣性指數(shù)Chao1和Shannon顯著降低（P<005）;與模型對照組相比，3個燕麥β葡聚糖干預(yù)組腸道菌群豐度指數(shù)Chao1均升高，且高劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組Chao1指數(shù)顯著升高（P<005）;低、中、高劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組多樣性指數(shù)Shannon均升高，且低、中劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組顯著升高（P<005）（表3）。

27菌落的群落結(jié)構(gòu)

干預(yù)第8周，在門水平上（圖4A），與正常對照組相比，模型對照組的厚壁菌門豐度顯著下降、擬桿菌門豐度顯著升高、厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著下降（P<005）;燕麥β葡聚糖干預(yù)組與模型對照組相比，擬桿菌門豐度均降低、厚壁菌門的豐度和厚壁菌門/擬桿菌門比值均升高，低劑量燕麥β葡聚糖干預(yù)組擬桿菌門豐度顯著下降（P<005）、厚壁菌門豐度顯著升高及厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著升高（P<005）。在屬水平上（圖4B），與正常對照組相比，模型對照組Prevotella（普氏菌屬）、Ruminococcus（瘤胃球菌屬）豐度顯著升高（P<005），

3討論

本研究通過單側(cè)腎切除+鏈脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射方式構(gòu)建DN大鼠模型，因其方法簡便易行，對胰島β細(xì)胞損傷特異性高，且死亡率較低而成為當(dāng)前最常見的DN大鼠的造模方式。當(dāng)前研究結(jié)果顯示，單側(cè)腎切除+鏈脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射之后大鼠BUN、CR、UA、尿酸/肌酐比值均升高;HE染色可見大鼠腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變形、脫落，系膜細(xì)胞增生;腸道菌群豐度和多樣性均降低，擬桿菌門豐度升高、厚壁菌門豐度及厚壁菌門/擬桿菌門比值均下降，而正常對照組以上指標(biāo)均無明顯變化。以上說明，在當(dāng)前研究中單側(cè)腎切除+鏈脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射方式成功構(gòu)建了DN大鼠模型。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)燕麥β葡聚糖干預(yù)后的DN大鼠血清中的尿素氮、CR、尿酸/肌酐與未處理的DN大鼠相比有顯著差異;DN大鼠的腎小球、腎小管出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化;腸道菌群豐度和多樣性升高，擬桿菌門豐度下降、厚壁菌門豐度以及厚壁菌門/擬桿菌門比值升高。以上說明，燕麥β葡聚糖對DN大鼠有積極的治療作用。

本研究結(jié)果顯示，燕麥β葡聚糖干預(yù)組血糖、BUN、CR含量及尿酸/肌酐比值均低于模型對照組中的含量且改善了DN引起的腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變形、脫落，系膜細(xì)胞增生的情況。這說明燕麥β葡聚糖對DN具有保護(hù)作用。這與我們之前的研究結(jié)果一致，即燕麥β葡聚糖可能是DN的一種潛在的治療物質(zhì)。此外，在我們的結(jié)果中，燕麥β葡聚糖干預(yù)組腸道菌群Alpha多樣性升高（Alpha 多樣性反映的是單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，利用腸道菌群豐度和多樣性指數(shù)Chao1、Shannon來衡量，此數(shù)值越大說明樣品物種的豐度和多樣性越高[910]）。在門水平上，燕麥β葡聚糖干預(yù)組厚壁菌門豐度相對上升，擬桿菌門豐度相對下降，且厚壁菌門/擬桿菌門比值升高。這提示燕麥β葡聚糖對DN大鼠的治療作用可能與改變其腸道菌群Alpha多樣性，厚壁菌門、擬桿菌門的豐度以及二者之間的比值有關(guān)。已有研究顯示[11]，腸道菌群與2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病密切相關(guān)，其潛在機制與腸道菌群豐度和多樣性的變化有關(guān)。Larsen等[11]研究表明，厚壁菌門/擬桿菌門的比值和2型糖尿病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，且2型糖尿病患者厚壁菌門相對豐度降低，而擬桿菌門等豐度相對升高[1213]，原因可能是厚壁菌門中多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生丁酸鹽菌[14]。丁酸鹽是一種短鏈脂肪酸鹽，它能促進(jìn)腸內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽1（GLP1）和肽YY（PYY），GLP1可改善胰島功能并調(diào)節(jié)胰島素的釋放，從而起到降低血糖的作用[15]。本研究通過構(gòu)建大鼠DN模型進(jìn)一步說明了腸道菌群在2型DN發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用，并提供了燕麥β葡聚糖對DN大鼠具有保護(hù)作用的證據(jù)。

綜上所述，燕麥β葡聚糖能改善DN大鼠血糖及腎功能，其機制可能是調(diào)節(jié)腸道菌群豐富、多樣性以及厚壁菌門/擬桿菌門的比值。◇

參考文獻(xiàn)

[1]Cooper M EPathogenesis，prevention，and treatment of diabetic nephropathy[J].Lancet，1998，352（9123）：213219

[2]汪海波燕麥中β葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶液行為及降血糖作用的機制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004

[3]劉博，林親錄，羅非君燕麥葡聚糖的生理功能研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2016，29（2）：15

[4]Koh A，De Vadder F，Kovatchevadatchary P，et alFrom dietary fiber to host physiology：shortchain fatty acids as key bacterial metabolites[J].Cell，2016，165（6）：13321345

[5]任錦麗，等燕麥β葡聚糖對糖尿病大鼠腎病干預(yù)作用及機制[J].中國公共衛(wèi)生，2018，34（6）：819822

[6]Hu J，Luo H，Wang J，et alEnteric dysbiosislinked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice[J].Exp Mol Med，2017，49（8）：e370

[7]Vaziri N D，et alChronic kidney disease alters intestinal microbial flora[J].Kidney Int，2013，83（2）：308315

[8]Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，et alQiime allows analysis of highthroughput community sequencing data[J].Nat Methods，2010，7（5）：335336

[9]Kemp P F，Aller J YBacterial diversity in aquatic and other environments：what 16S rDNA libraries can tell us[J].FEMS Microbiol Ecol，2004，47（2）：161177

[10]Harris K，Kassis A，Major G，et alIs the gut microbiota a new factor contributing to obesity and its metabolic disorders？[J].J Obes，2012，2012：879151

[11]Larsen N，Vogensen F K，van den Berg F W，et alGut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from nondiabetic adults[J].PLoS One，2010，5（2）：e9085

[12]Karlsson F H，Tremarol V，Nookaew I，et alGut metagenome in European women with normal，impaired and diabetic glucose control[J].Nature，2013，498（7452）：99103

[13]Sato J，et alGut dysbiosis and detection of “l(fā)ive gut bacteria” in blood of Japanese patients with type 2 diabetes[J].Diabetes Care，2014，37（8）：23432350

[14]Zhao L，Zhang F，Ding X，et alGut bacteria selectively promoted by dietary fibers alleviate type 2 diabetes[J].Science，2018，359（6380）：11511156

[15]武欣，李勇，徐美虹燕麥β葡聚糖與疾病關(guān)系[J].中國食物與營養(yǎng)，2019，25（2）：6872

[16]劉欣然，劉思奇，侯超，等燕麥低聚肽對糖尿病大鼠血糖的影響[J].中國食物與營養(yǎng)，2018，24（4）：4650