柯仲成+楊楠+侯雪峰+王愛東+封亮+賈曉斌

[摘要]為研究腸道菌群對芍藥苷在體內(nèi)吸收和代謝的影響，該課題在離體培養(yǎng)的大鼠腸道菌群中，加入芍藥苷進行厭氧孵育，分析芍藥苷在48 h內(nèi)的變化過程，探討體外大鼠腸道菌群對芍藥苷的代謝轉化。采用UPLC監(jiān)測芍藥苷在不同孵育時間點的變化，色譜條件為：WelchromTM C₁₈色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm），流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，流速0.4 mL·min^-1，柱溫30 ℃；同時運用UPLC-Q-TOF-MS/MS對轉化產(chǎn)物進行分析鑒定（ESI離子源，正離子模式檢測），結合化合物精確相對分子質(zhì)量和MS裂解碎片信息，并輔以保留時間及文獻數(shù)據(jù)對代謝產(chǎn)物進行結構解析，分析芍藥苷腸道代謝規(guī)律。結果發(fā)現(xiàn)孵育24 h后，芍藥苷已經(jīng)完全被代謝轉化，得到的代謝產(chǎn)物包括芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯苷元、脫酰基-芍藥內(nèi)酯苷、脫?；?芍藥內(nèi)酯苷元和芍藥內(nèi)酯B等。通過代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，離體的大鼠腸道菌群先將芍藥苷轉化成芍藥內(nèi)酯苷，然后通過脫葡萄糖、脫苯甲?；退脑h(huán)裂解重排等多個途徑被進一步代謝，將芍藥苷逐步轉化生成相對分子質(zhì)量更小、疏水性更強的代謝產(chǎn)物，從而更好被腸道吸收。

[關鍵詞]芍藥苷； 腸道菌群； 生物轉化

[Abstract]In order to clarify the effect of intestinal flora on the absorption and metabolism of paeoniflorin in vivo， the metabolism of paeoniflorin by rat intestinal flora was studied under the in vitro anaerobic condition. Paeoniflorin was incubated with rat anaerobic intestinal flora for 48 h， and UPLC was used to detect the changes of paeoniflorin at different incubation time points under the following chromatographic conditions：WelchromTM C₁₈ chromatographic column （4.6 mm×100 mm， 5 μm）， with 0.1% formic acid（A）-acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min^-1， and column temperature was 30 ℃. UPLC-Q-TOF-MS with positive ion mode（ESI ion source） was applied to investigate the structural characterization of metabolic products. The structures of the metabolites were identified by accurate molecular weight， TOF-MS/MS fragmentation information， combined with retention time and literature data review， and the intestinal metabolic rules were then analyzed. After incubation for 24 h， the paeoniflorin was metabolized completely， and the resulting metabolites（albiflorin， albiflorinaglycone， deacylate albiflorin， deacylate albiflorin aglycone and paeonilactone-B） were detected in rat intestinal flora. The metabolic pathway analysis showed that the isolated rat intestinal flora first transformed peoniflorin into albiflorin， and then further metabolized by glucose removal， phenyl group removal， or four-membered ring pyrolysis and rearrangement. Paeoniflorin was gradually transformed into more hydrophobic metabolites with smaller molecular mass， which were better absorbed by the intestinal tract.

[Key words]paeoniflorin； intestinal bacteria； metabolism

doi：10.4268/cjcmm20162021

赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍P. veitchii Lynch.的干燥根，性苦，微寒，具有清熱涼血、散瘀止痛、清瀉肝火之功，可用于溫毒發(fā)斑，血熱吐衄，肝郁脅痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，目赤腫痛，癰腫瘡瘍^[1]。赤芍總苷是其主要活性部位，而芍藥苷則為代表性成分，研究表明其對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)均有顯著保護作用，還有抗腫瘤、保肝、抗炎、抗氧化等藥理活性^[2]。從結構上來說，芍藥苷是一個糖苷類化合物，腸道吸收較差，口服生物利用度偏低，可能是通過葡萄糖苷酶代謝成苷元而發(fā)揮療效^[3-4]；而其結構母核——蒎烷型單萜的四元環(huán)張力較大，容易斷裂，引起生物轉化。芍藥苷在腸道中發(fā)生降解或生物轉化的性質(zhì)，可能類似“前體藥物”。本試驗采用離體代謝研究的方法^[5-6]，用富含大鼠腸道菌群的培養(yǎng)液與藥物在厭氧條件下共同孵育，考察腸道菌對芍藥苷的分解代謝作用，探討其在腸道中生物轉化的一般規(guī)律，為芍藥苷的腸道轉化吸收提供科學依據(jù)，為赤芍的臨床應用及開發(fā)提供參考。

1 材料

螺口厭氧試管（亨蓋特，16 mm×125 mm）；C-31-CX密封培養(yǎng)罐（日本三菱，2.5 L）；Pyramid 2200氣密隔離保護罩（法國Erlab）；Triple Q-TOF 5600質(zhì)譜儀（AB Sciex公司），配有電噴霧離子源ESI系統(tǒng)；LC-20AD型高效液相色譜（日本島津公司）；數(shù)據(jù)采集和處理分別采用 Analyst TF 1.6和Markerview1.2軟件。

芍藥苷（阿拉丁，純度>98.0%，批號1523046），乙腈為色譜純（美國Fisher），甲酸（德國CNW），MGC厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣袋（日本三菱），水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 離體大鼠腸道菌對芍藥苷的代謝

2.1.1 TSB 培養(yǎng)液的配制 胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，用純化水配制而成，調(diào)節(jié) pH為7.2，經(jīng)121 ℃壓力下，蒸氣滅菌4 min后使用。

2.1.2 厭氧條件的建立 將所用的試劑、螺口厭氧試管、密封培養(yǎng)罐、厭氧產(chǎn)氣袋等置于氣密隔離保護罩，向保護罩內(nèi)充入氮氣，厭氧操作均在隔離罩內(nèi)進行。

2.1.3 腸道菌液的制備 取6只大鼠的新鮮糞便溶于20%甘油和1.8%的氯化鈉混合溶液中（1∶5），加入玻璃珠渦旋 5 min，混勻后-80 ℃保存待用。試驗前，取適量菌液，加入TSB培養(yǎng)液（1∶8）混勻，置于37 ℃恒溫搖床中，厭氧環(huán)境下溫孵12 h。

2.1.4 體外溫孵試驗 取芍藥苷適量，分別用腸道菌液或雙蒸餾水為溶劑，配制得到芍藥苷質(zhì)量濃度為0.25 g·L^-1的腸道菌溫孵組和藥物對照組；并將不含芍藥苷的腸道菌液設為菌液空白組。分別在厭氧下將各組樣品置于37 ℃的恒溫震蕩搖床中（100 r·min^-1），分別孵育0，2，4，8，12，24，48 h。取溫孵的樣品500 μL，立即加入甲醇3 mL終止反應，渦旋5 min，12 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，氮氣吹干^[7]，進樣前加入500 μL流動相復溶，12 000 r·min^-1離心5 min，取10 μL上清用UPLC-MS/MS檢測。

2.2 HPLC-MS 色譜條件

色譜條件：WelchromTM C₁₈色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm）；流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～5 min，2%～8% A；5～30 min，8%～20% A；30～45 min，20%～35% A；45～60 min，35%～60% A；60～65 min，60%～100% A，流速0.4 mL·min^-1，柱溫 30 ℃。色譜圖見圖1，藥物對照組并沒有新的色譜峰出現(xiàn)，而當與腸道菌液孵育4 h后，芍藥苷（t_R17.18 min）濃度逐漸降低，并同時在t_R15.32，50.32 min左右出現(xiàn)明顯吸收峰；當溫孵24 h后，只剩下50.32 min處吸收峰。

質(zhì)譜條件：正離子檢測；離子噴射電壓 5.0 kV；毛細管溫度 350 ℃；毛細管電壓3 kV；鞘氣（N₂）流速0.414 MPa；輔助氣流速0.035 MPa?？偺崛‰x子流圖見圖2，藥物對照組并沒有新的質(zhì)譜峰出現(xiàn)，而腸道菌孵育4 h后出現(xiàn)若干個峰，t_R15.32 min峰的m/z為481，t_R24.91，27.88 min峰的m/z215，t_R5.03 min峰的m/z319，當溫孵24 h后，t_R17.18 min吸收峰消失。

2.3 代謝物的結構鑒定

代謝物a正離子模式的質(zhì)譜圖見圖3，在m/z代謝物c正離子模式的質(zhì)譜圖見圖5，在m/z377處發(fā)現(xiàn)準分子離子峰，為[M+H]⁺， 且在m/z359，341，215發(fā)現(xiàn)碎片離子峰，分別為 [M+H- H₂O]⁺，[M+H-2H₂O]⁺，[M+H-Glc]⁺，推測其為脫苯甲?；炙巸?nèi)酯苷。

代謝物d正離子模式的質(zhì)譜圖見圖6，發(fā)現(xiàn)在t_R24.91 min處有m/z215的準分子離子峰，為[M+H]⁺，且在m/z197，185，179，167發(fā)現(xiàn)碎片離子峰，分別為[M-H₂O]⁺，[M-CH₂O]⁺，[M-2H₂O]⁺，[M-CH₂O-H₂O]⁺，推測d可能是脫苯甲?；炙巸?nèi)酯苷元。

代謝物e正離子模式的質(zhì)譜圖見圖7，在t_R27.88 min處有m/z215，197的準分子離子峰，為[M+H+H₂O]⁺，[M+H]⁺， 且在m/z179，167，153發(fā)現(xiàn)碎片離子峰，分別為[M-H₂O]⁺，[M-CH₂O]⁺，[M+H-CO₂]⁺，結合文獻[9-10]及芍藥內(nèi)酯苷元的類型，推測e可能為芍藥內(nèi)酯B。

2.4 芍藥苷腸道菌群代謝途徑分析

對轉化產(chǎn)物進行分析，結合化合物精確相對分子質(zhì)量和MS裂解碎片信息進行化合物結構解析，分析腸道代謝規(guī)律。從芍藥苷自身的質(zhì)譜裂解規(guī)律，分析大鼠腸道代謝產(chǎn)物，得到芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯苷元、脫酰基芍藥內(nèi)酯苷、脫?；炙巸?nèi)酯苷元、芍藥內(nèi)酯B等。經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，結合化合物精確相對分子質(zhì)量和MS裂解碎片信息^[11]，鑒定了芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯苷元、苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷、脫苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷元和芍藥內(nèi)酯B，代謝產(chǎn)物分析見表1，代謝途徑見圖8。

3 討論

本試驗中，大鼠腸道菌對芍藥苷的代謝產(chǎn)物經(jīng)UPLC-MS檢測分析，發(fā)現(xiàn)2 h時就有芍藥內(nèi)酯苷轉化生成，隨著時間延長，芍藥內(nèi)酯苷元、脫?；炙巸?nèi)酯苷、脫酰基芍藥內(nèi)酯苷元逐漸增加，24 h后檢測不到芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥內(nèi)酯苷元，48 h后則以脫苯甲?；炙巸?nèi)酯苷元和芍藥內(nèi)酯B為主，說明芍藥內(nèi)酯苷元被腸道菌群的代謝，轉化為極性較小的代謝產(chǎn)物， 有利于其在腸道內(nèi)的跨膜轉運， 并能加快吸收入血而發(fā)揮藥效，水解是芍藥苷代謝的主要途徑，包括半縮醛酸、酯鍵和糖苷鍵水解；另外，蒎烷型雙環(huán)單萜四元環(huán)的開環(huán)裂解和遷移重排是腸道菌群代謝的另一途徑。

對于糖苷類成分而言，苷元是腸道菌群代謝的主要產(chǎn)物^[12]。但在前期實驗中，大鼠口服芍藥苷或赤芍提取物后，在血漿中發(fā)現(xiàn)芍藥苷，但并未發(fā)現(xiàn)芍藥苷元或芍藥內(nèi)酯苷元。可能是由于酯鍵以及蒎烷型單萜的特殊四元環(huán)結構的不穩(wěn)定性，導致苷元在動物體內(nèi)的快速生物轉化，受腸道菌群影響的同時，還可能被肝臟微粒體快速代謝^[13]，有待進一步深入研究。

隨著萜類化合物生物活性的深入認識，其血中移行成分及藥物代謝等方面的研究越來越受人們重視。劉鑫鑫等^[14]通過體外實驗研究表明，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠腸內(nèi)菌群的作用下可以發(fā)生互相轉化，也通過體內(nèi)實驗，說明芍藥苷的代謝途徑有水解和氧化等，但并未深入分析和闡述腸道菌對芍藥苷的代謝途徑。另也有文獻報道，在體外腸道菌孵育，芍藥苷能被轉化為paeonimetabolin I^[15-16]，但本實驗并未檢出，但推測有paeonimetabolin I的羥基化產(chǎn)物的存在，說明腸道菌群對藥物代謝易受諸多因素影響，如動物種類及孵育方式等^[17-18]。綜上所述，芍藥苷易被腸道菌群代謝，掌握口服后其在體內(nèi)的代謝轉化規(guī)律，可為深入理解蒎烷型單萜類成分的藥理作用機制提供幫助。

[參考文獻]

[1]張建軍，李偉，王麗麗，等. 赤芍和白芍品種、功效及臨床應用述評[J].中國中藥雜志，2013，38（10）：3595.

[2]陸小華，馬驍，王建，等. 赤芍的化學成分和藥理作用研究進展[J].中草藥，2015，46（4）：595.

[3]張圣潔，郭錦瑞，康安，等. 腸道菌群對中藥糖苷類成分脫糖基代謝的研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38（10）：1459.

[4]房卉，李孟璇，李海波，等. 大鼠腸道菌群對短小蛇根草苷體外代謝轉化研究[J].中國中藥雜志， 2016， 41（10）：1921.

[5]張文秀，楊彪，胡玉梅，等. 離體大鼠腸道菌群對類葉升麻苷代謝的研究[J].中國中藥雜志， 2016，41（8）：1541.

[6]宋瑞，田媛，張尊建.大黃4種飲片水提液體外腸道菌群轉化比較研究[J].中國中藥雜志， 2012， 37（12）：1755.

[7]曹偉宇，王鵬遠，馮斌，等.離體培養(yǎng)人腸道菌群對九節(jié)龍皂苷Ⅰ生物轉化的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2015， 27（8）：1357.

[8]劉鑫鑫， 馬驍馳， 霍長虹，等. 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的微生物轉化[J]. 中國中藥雜志， 2010， 35（7）：872.

[9]Kadota S， Terashima S， Basnet P， et al. Palbinone， a novel terpenoid from Paeonia albiflora； potent inhibitory activity on 3 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase[J]. Chem Pharm Bull （Tokyo）， 1993， 41（3）：487.

[10]Kim S H， Lee M K， Lee K Y， et al. Chemical constituents isolated from Paeonia lactiflora roots and their neuroprotective activity against oxidative stress in vitro[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2009，24（5）：1138.

[11]李坤平， 高崇凱， 李衛(wèi)民.牡荊苷和異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷的電噴霧飛行時間質(zhì)譜研究[J]. 中國中藥雜志，2011，36（2）：180.

[12]張蔚， 江曙， 錢大瑋，等. 腸道細菌對柚皮苷的代謝研究[J]. 藥學學報， 2013， 48 （12）：1817.

[13]譚妍， 莊笑梅， 沈國林，等. 川芎嗪的肝微粒體代謝動力學及代謝表型研究[J]. 藥學學報，2014， 49（3）：374.

[14]劉鑫鑫. 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝研究[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學， 2009.

[15]He J X， Akao T， Tani T. Influence of co-administered antibiotics on the pharmacokinetic fate in rats of paeoniflorin and its active metabolite paeonimetabolin-I from Shaoyao-Gancao-tang[J]. J Pharm Pharmacol， 2003， 55（3）：313.

[16]Heikal O A， Akao T， Takeda S， et al. Pharmacokinetic study of paeonimetabolin I， a major metabolite of paeoniflorin from paeony roots[J]. Biol Pharm Bull， 1997， 20（5）：517.

[17]常佩亮.腸道菌群對芹菜素的代謝及影響因素的研究[D].哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學，2009.

[18]宋瑞，田媛，張尊建.大黃4種飲片水提液體外腸道菌群轉化比較研究[J].中國中藥雜志，2012， 37（12）：1755.

[責任編輯 曹陽陽]