劉欣然 康家偉

摘要：目的：研究核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）干預對db/db糖尿病模型小鼠血糖的影響作用。方法：選擇db/db糖尿病小鼠模型，將其隨機分為3個核桃低聚肽組（220、440、880mg/kg·BW）、糖尿病模型對照組、二甲雙胍對照組、乳清蛋白對照組;并選用db/m小鼠作為非糖尿病小鼠空白對照。經過為期6周的干預，檢測小鼠空腹血糖、餐后血糖以及糖耐量實驗血糖曲線下面積。結果：核桃低聚肽（880mg/kg·BW）可降低db/db糖尿病小鼠空腹血糖水平和餐后血糖水平，同時能有效改善糖耐量（P<005）。結論：核桃低聚肽干預可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，改善糖耐量，具有輔助降血糖功能。

關鍵詞：核桃低聚肽;降血糖;糖耐量;db/db糖尿病小鼠

2017年全球糖尿病相關醫(yī)療支出高達8 500億美元[1]，防治糖尿病及其并發(fā)癥已成為科學工作者研究的重點，而控制血糖水平則是重中之重。研究發(fā)現，許多植物來源的生物活性肽可具有降血糖的功效，如燕麥低聚肽、人參低聚肽和苦瓜多肽等[25]。核桃含有豐富的蛋白質以及人體所需的不飽和脂肪酸、維生素、礦物質、纖維素等。核桃中蛋白質含量最高可達到297%，有著豐富的營養(yǎng)價值及資源開發(fā)前景[67]。目前已有關于核桃及核桃多肽的研究顯示其具有一定的降血糖作用[810]，而低聚肽具有更短小的氨基酸組成，理論上應比多肽更易吸收且活性更強，但目前尚未有關于核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）降血糖的研究。因此，本研究探討WOPs對血糖調節(jié)的作用。

1材料與方法

11受試物

WOPs，淡黃色固體粉末，是利用酶解技術從核桃仁中得到的小分子生物活性肽的混合物，其中相對分子質量小于1 000D的小分子低聚肽占875%。

12實驗動物

選擇12周齡SPF級雄性db/db型糖尿病小鼠（空腹血糖水平≥111mmol/L）48只及與之周齡、性別匹配的非糖尿病健康同窩出生仔畜db/m小鼠（lepr/m）10只。db/db小鼠及正常健康小鼠db/m均由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。動物飼養(yǎng)在北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，動物實驗環(huán)境設施（屏障環(huán)境）合格證書：醫(yī)動字第 012055。動物分籠飼養(yǎng)，每籠2只，均給予普通飼料，飼養(yǎng)環(huán)境符合屏障環(huán)境，溫度為（25±1）℃，相對濕度為50%～60%RH，室內照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。動物喂養(yǎng)及實驗操作嚴格按照《北京市實驗動物管理條例》執(zhí)行，動物合格證號：SCXK（京）2016—0010。

13主要試劑和儀器

葡萄糖，純度：998%，北京金匯太亞化學試劑有限公司;濃縮乳清蛋白Lacprodan 80，純度：792%，北京中柏創(chuàng)業(yè)化工產品有限公司;格華止鹽酸二甲雙胍片國藥準字H20023370，中美上海施貴寶制藥有限公司;三諾安穩(wěn)血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司;三諾安穩(wěn)血糖儀，長沙三諾生物傳感技術有限公司。

14分組、劑量及干預方式

將48只db/db小鼠按空腹血糖水平隨機分為6組：1個模型對照組、1個陽性對照組（220 mg/kg·BW鹽酸二甲雙胍腸溶片水溶液）、1個乳清蛋白對照組（440mg/kg·BW乳清蛋白水溶液）和3個核桃低聚肽劑量組（220、440、880 mg/kg·BW），每組8只。10只db/m小鼠作為空白對照組。各組干預方式均為每日經口灌胃，持續(xù)6周，實驗期間動物自由進食、飲水。分組及干預劑量見表1。

15檢測指標及方法

151一般情況每日觀察各組小鼠狀態(tài)，定期記錄攝食和體重等情況。

152血糖及口服糖耐量實驗于干預第2周、第4周和第6周時禁食5h后取小鼠尾靜脈血，用微量血糖儀檢測空腹血糖。于干預第6周時進行口服糖耐量實驗，具體操作方法為：小鼠禁食6h 后，給予004mL/kg 50%葡萄糖溶液灌胃，于灌胃后第0、05、1、2h 取尾靜脈血測其血糖水平記錄并計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。根據近似梯形面積公式計算，AUC=（0h血糖+05h血糖）×05h/2+（05h血糖+1h血糖）× 05h/2+（1h血糖+2h血糖）× 1h/2。

16數據處理與統(tǒng)計分析

正態(tài)分布數據以均數±標準差（±s）表示，非正態(tài)分布數據采用中位數（四分位間距）表示。采用SPSS 240軟件進行單因素方差分析或獨立樣本非參數檢驗，以P<005表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果與分析

21一般情況

在干預期間，空白對照組小鼠（db/m）毛色黑亮有光澤，精神狀態(tài)良好。模型對照組皮毛松散，體表潮濕，精神狀態(tài)較差，活動量明顯少于空白對照組。而WOPs干預后的小鼠毛色及精神狀況逐漸有所好轉，活動量有所增加，干預時期內極少出現感染癥狀（如尿道感染等）。干預期間，各糖尿病組（db/db）小鼠體重及攝食量均高于空白對照組（db/m）小鼠（圖1），這與2型糖尿病“三多”癥狀相吻合，但糖尿病小鼠各組間差異無統(tǒng)計學意義。

22WOPs對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

干預前，空白對照組小鼠空腹血糖均值為754mmol/L，而db/db 2型糖尿病模型小鼠空腹血糖值均大于111mmol/L，符合2型糖尿病的標準，在干預期間，模型對照組小鼠空腹血糖也并無明顯變化，這說明該試驗所采用的db/db 2型糖尿病模型小鼠血糖較為穩(wěn)定，符合后續(xù)研究的需要。由圖2可見，干預期間db/db糖尿病小鼠空腹血糖均明顯高于正常組小鼠，具有統(tǒng)計學差異（P<005）;而相比模型對照組小鼠，WOPs干預的3組小鼠空腹血糖均有所降低，特別是WOPsHG組小鼠空腹血糖的降低具有統(tǒng)計學意義（P<005）。從數值上來看，干預2、4、6周時WOPsHG組小鼠空腹血糖較模型對照組血糖下降率分別為294%、401%、350%，說明WOPs對糖尿病小鼠有較好的降低空腹血糖作用。

23WOPs對糖尿病小鼠餐后血糖及血糖曲線下面積的影響

干預后（6周）進行糖耐量實驗，以給予葡萄糖后2h的血糖值作為餐后血糖指標;同時通過糖耐量實驗得到的給予葡萄糖后0、05、1、2h的血糖值計算曲線下面積（表2）?？瞻讓φ战M及WOPsHG組餐后血糖及血糖曲線下面積均顯著低于糖尿病模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）;陽性對照組的血糖曲線下面積也顯著低于糖尿病模型對照組（P<005）。

3討論

研究WOPs的血糖調節(jié)作用首先需要依賴于糖尿病動物模型。目前國內外主要使用的糖尿病模型動物主要分為自發(fā)性模型動物、轉基因模型動物和誘發(fā)性模型動物等。在諸多動物模型中，db/db小鼠是屬于自發(fā)性模型動物中比較優(yōu)質的用來研究2型糖尿病的模型小鼠，價格也比較昂貴，它是由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而來。純合的自發(fā)突變小鼠在3～4周齡時產生可以辨認的肥胖表型;出生后10～14d，血漿胰島素和血糖開始升高，并出現多飲、多食、多尿的“三多”癥狀，其存活壽命為10個月左右。db/db小鼠的糖尿病發(fā)生發(fā)展近似人類糖尿病病理改變過程，適合用于外物干預下的糖尿病降糖作用研究，模型持續(xù)時間長，可為后續(xù)的研究奠定穩(wěn)固的基礎[11]。

糖尿病患者糖調節(jié)受損（IGR）可分為兩種狀態(tài)，即空腹血糖受損（IFG）和糖耐量受損（IGT）[12]?？刂瓶崭寡堑钠椒€(wěn)降低對于防治糖尿病及其并發(fā)癥有著重要的意義，本研究發(fā)現，最高劑量WOPs干預后的小鼠空腹血糖顯著低于模型對照組，說明WOPs可以有效降低空腹血糖;同時鑒于WOPsHG組血糖也低于陽性對照組和乳清蛋白對照組，由此對比說明此劑量下的降糖作用與額外添加的氨基酸無關，體現出了生物活性肽比蛋白質具有更強的功能優(yōu)勢。而針對IGT，本研究關注了WOPs干預后的小鼠餐后血糖和血糖曲線下面積變化，發(fā)現WOPsHG組餐后血糖顯著低于模型對照組及乳清蛋白對照組，鑒于餐后血糖反映的是機體糖負荷后的耐受，此結果也說明了WOPs干預可以有效改善胰島β細胞的儲備功能。血糖曲線下面積也是一種反映血糖水平的指標，相較于單點的血糖值，血糖曲線下面積能更全面地分析血糖變化的時間和程度，體現了動態(tài)波動的情況。而從結果來看，WOPsHG組的曲線下面積顯著低于糖尿病模型組，說明WOPs可以有效控制短時間內的血糖波動，促進血糖快速回歸較低水平。雖然結果中WOPsHG組血糖曲線下面積低于陽性藥物對照組，但數值上較為接近，仍可以說明WOPs的干預對于改善IGT具有重要的作用。

近年來研究發(fā)現，越來越多的生物活性肽都具有降血糖的作用[23，1314]，并且低聚肽比蛋白質和多肽更易消化，吸收速度甚至高于氨基酸，耗能低，可減輕腎臟代謝負擔，具有獨特的生理功能和理化性質，這是蛋白質或氨基酸所不具備的，且低聚肽分子量越小其功能特性越明顯。本研究已經證明了WOPs具有輔助降血糖作用，具有重要的科學意義和臨床應用價值，但目前有關WOPs對于血糖影響的機制研究暫無，通過本研究得到的結果以及前人關于核桃蛋白及核桃多肽降血糖的研究，推測WOPs的降血糖機制可能與抑制α葡萄糖苷酶、提高葡萄糖消耗能力等機制有關[89]，需要今后開展更深入的探究討論其降糖機制。

4結論

本研究以db/db小鼠為糖尿病模型小鼠，設立不同劑量的WOPs干預組和多種對照組，探討WOPs對糖尿病小鼠的血糖調節(jié)作用。結果顯示，WOPs具有降低糖尿病小鼠空腹血糖、餐后血糖及血糖曲線下面積的作用，這對于降低糖尿病患者血糖以及防治糖尿病有著重要意義?！?/p>

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