葛含靜

（陜西學(xué)前師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，陜西西安 710100）

在釀制葡萄酒的過(guò)程中，酵母的種類(lèi)與性能對(duì)成品的品質(zhì)具有無(wú)可替代的影響。不同種類(lèi)、不同來(lái)源的酵母，其代謝途徑必有差異，導(dǎo)致所釀酒的色澤和風(fēng)味便會(huì)有所不同[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)葡萄酒企業(yè)獲取葡萄酒釀造酵母的主要途徑有2 種，即利用當(dāng)?shù)靥赜械钠咸奄Y源選育優(yōu)良的本土酵母，或進(jìn)口國(guó)外優(yōu)良的葡萄酒釀造酵母。自然發(fā)酵葡萄酒時(shí)，附著在葡萄果實(shí)、果梗，甚至葉片上的酵母都會(huì)參與酒的發(fā)酵，從而使酒液具有獨(dú)特的地域性品質(zhì)[3]。各年份各批次之間酒的品質(zhì)不能穩(wěn)定，存在或多或少的差異[4]。為了使葡萄酒品質(zhì)穩(wěn)定，許多酒企大量使用國(guó)外優(yōu)良酵母進(jìn)行發(fā)酵，這樣雖能穩(wěn)定發(fā)酵速度和風(fēng)味，但極大降低了本土酵母的貢獻(xiàn)，導(dǎo)致產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重，難以凸顯酒的地域特色[5-7]。研究利用本土特有葡萄資源，通過(guò)自然發(fā)酵篩選出的優(yōu)勢(shì)釀造酵母對(duì)當(dāng)?shù)匚h(huán)境的適應(yīng)性非常好，易于在釀造過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，并能很好地保證產(chǎn)區(qū)的典型 性[4，8]。因而，本土釀造酵母的選育研究成為當(dāng)下葡萄酒行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一[9]。

西安擁有多個(gè)成熟、規(guī)?；钠咸逊N植基地，本土化的葡萄酒釀造酵母資源極為豐富。作為西安地區(qū)特有的兼鮮食與釀造的葡萄品種，戶太八號(hào)果粒深紫味道甜美，是釀造葡萄酒的優(yōu)質(zhì)原料。對(duì)前期篩選出的適合戶太八號(hào)桃紅葡萄酒釀造的菌株NJ7進(jìn)行鑒定，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)所釀酒樣品質(zhì)進(jìn)行分析，并將之與商品釀酒酵母D254 所釀酒樣的品質(zhì)進(jìn)行比較，為釀造出具有西安本土特色的葡萄酒提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)基

1.1 試驗(yàn)材料

成熟戶太八號(hào)葡萄，2017 年9 月采集于西安市白鹿原產(chǎn)區(qū)，破碎、壓榨后自然釀制；商品釀酒酵母D254。

1.2 培養(yǎng)基

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[10]，無(wú)機(jī)鹽類(lèi)KH2PO40.55 g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，F(xiàn)eCl30.025 g/L，MnSO40.0025 g/L，溴酚綠0.022 g/L，pH 值5.5。

保藏培養(yǎng)基、活化培養(yǎng)基，均為YPD 培養(yǎng)基。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃下高壓滅菌15 min 后備用，所有試劑均為分析純或生物純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種鑒定

表型鑒定[11-12]：菌株NJ7 接種于WL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于25 ℃條件下培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定[13-14]：珠磨法提取菌株NJ7 基因組DNA，以之為模板，NL1 和NL4 為引物，對(duì)26S rRNA D1/D2 區(qū)域擴(kuò)增并測(cè)序，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株NJ7 的生物學(xué)地位。

2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

在1 L 葡萄鮮漿中按3%接種量（V/V） 接入菌株NJ7 種子液，并加40 mg/L 二氧化硫溶液，恒溫發(fā)酵72 h，依據(jù)酒樣酒精度優(yōu)化菌株NJ7 的最適發(fā)酵溫度和pH 值。

2.3 酒樣品質(zhì)分析

以1.0%接種量（V/V） 接種菌株NJ7 的種子液于裝有10 L 葡萄鮮漿的發(fā)酵罐中，并加入40 mg/L二氧化硫溶液，于25 ℃條件下發(fā)酵5 d 后取樣，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心，測(cè)定所釀酒樣的酒精度、總酸、總糖等理化指標(biāo)，以酒樣的滋氣味、澄清度等作為感官指標(biāo)。采用商業(yè)菌株D254 作對(duì)照菌株。最后，通過(guò)小試試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化后的適合菌株NJ7 的發(fā)酵條件。

2.4 香氣成分分析

GC-MS 分析。取6 mL 酒樣，于40 ℃下水浴加熱15 min，頂空萃取35 min，解析5 min[15]，以D254作對(duì)照。升溫程序與色譜條件同文獻(xiàn)15。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種鑒定

菌株NJ7 的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 菌株NJ7 的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)

菌株NJ7 的菌落呈球形突起且表面光滑，奶油色，略帶淡綠，不透明（圖1（a）），具有典型釀酒酵母的形態(tài)特征；菌體卵圓形，單端芽殖（圖1（b））。

菌株NJ7 的26S rRNA 序列擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖2，菌株NJ7 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

圖2 菌株NJ7 的26S rRNA 序列擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 菌株NJ7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

菌株NJ7 與S. cerevisiaeAB733454.1 同枝，26S rRNA 序列相似度為100%。結(jié)合表型鑒定結(jié)果，菌株NJ7 應(yīng)為釀酒酵母。

3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化與酒樣品質(zhì)分析

菌株NJ7 發(fā)酵溫度優(yōu)化見(jiàn)圖4，菌株NJ7 發(fā)酵pH 值優(yōu)化見(jiàn)圖5。

圖4 菌株NJ7發(fā)酵溫度優(yōu)化

圖5 菌株NJ7發(fā)酵pH 值優(yōu)化

由圖4、圖5 及小試發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)可知，菌株NJ7 最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度24 ℃，pH 值5.0。

菌株NJ7 和D254 所產(chǎn)酒樣的理化指標(biāo)見(jiàn)表1，菌株NJ7 和D254 所產(chǎn)酒樣的感官評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 菌株NJ7 和D254 所產(chǎn)酒樣的理化指標(biāo)

表2 菌株NJ7 和D254 所產(chǎn)酒樣的感官評(píng)定結(jié)果/分

由表1 和表2 可知，2 株菌所產(chǎn)酒樣的各項(xiàng)指標(biāo)非常接近；菌株NJ7 酒樣的色度和花色苷含量略低，其余指標(biāo)均高于D254 酒樣。綜上，菌株NJ7 具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

圖6 菌株NJ7 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖

圖7 D254 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖

3.3 酒樣香氣成分分析

菌株NJ7 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖見(jiàn)圖6，D254 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖見(jiàn)圖7，菌株NJ7 與菌株D254 所釀酒樣主要香氣成分對(duì)比見(jiàn)表3。

由表3 可知，菌株NJ7 和D254 所釀酒樣中分別可檢出揮發(fā)性化合物64 種與53 種，主要香氣成分均為醇、酯和酸；與D254 相比，菌株NJ7 酒樣中優(yōu)勢(shì)含量的香氣成分有16 種，2- 庚醇、壬醛、異戊酸乙酯等香氣良好，正己醇、苯乙醇、乙酸異戊酯等香氣優(yōu)雅；各種香氣成分與特有組成比例形成了菌株NJ7 所釀酒液的獨(dú)特風(fēng)味。

4 結(jié)論

前期研究中獲得的優(yōu)良菌株NJ7 經(jīng)鑒定是釀酒酵母，發(fā)酵釀制的戶太八號(hào)酒樣理化指標(biāo)均接近商品釀酒酵母D254，發(fā)酵性能良好，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力，可作為西安地區(qū)葡萄酒釀制的特征酵母商品化的出發(fā)菌。