鄭娟梅，王 警，陳寧周，莫紫梅，王海波

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530021)

山茶油又名野山茶油、茶籽油等，為山茶科山茶屬油茶樹(shù)的種子壓榨而得的植物油。茶籽的含油率約為干重的25%～35%。山茶油中油酸和亞油酸含量高達(dá)80%，其脂肪酸的組成和比例與橄欖油相近，有“東方橄欖油”之美稱[1]。我國(guó)是世界上最大的山茶油生產(chǎn)基地，其主要分布在廣西、江西、湖南。

氣相色譜法(GC)、拉曼光譜法、高效液相-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(UPLC-ELSD)等是脂肪酸類成分定性、定量檢測(cè)常用的分析方法，但這些方法存在一定局限性，對(duì)于成分復(fù)雜、存在多種同分異構(gòu)體、含量較低的脂肪酸，其分析效能不能令人滿意。本研究建立54種脂肪酸的GC-MS定性定量分析方法，以期能對(duì)一些脂肪酸的同分異構(gòu)體進(jìn)行識(shí)別，并考察山茶油中脂肪酸的成分及含量，為山茶油的加工企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

54種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.0%，購(gòu)自BePure公司；甲醇、正庚烷，色譜純，默克股份有限公司；異辛烷、正己烷、乙醚、無(wú)水硫酸鈉、硫酸氫鈉、氫氧化鉀，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；所有試劑除標(biāo)注外，均為分析純。

山茶油：購(gòu)于廣西巴馬長(zhǎng)壽之都健康食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8040氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；S300H型超聲清洗儀，德國(guó)Elmasonic公司；電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；高速離心機(jī)，德國(guó)Sartorius公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Milli-pore公司。

1.3 方法

1.3.1溶液的配制

分別精密稱取54個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品50.00 mg置10 ml容量瓶中，用正庚烷定容至刻度，其濃度為5.00 mg/ml，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封后置于-10℃以下冰箱，有效期3個(gè)月。

1.3.2樣品前處理

精密稱取樣品100 mg 于25 ml 比色管中，加入5 ml正己烷溶解試樣，振搖2 min，試樣溶解后加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.5 ml，搖勻，40℃超聲波處理20 min；加5 ml純水于比色管中，反復(fù)搖勻；轉(zhuǎn)移至離心管中，在25℃下10 000 r/min 離心3 min；吸取上層脂肪酸甲脂，加入2.0 g無(wú)水硫酸鈉干燥，振搖混勻靜置，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，置于進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行GC-MS分析[2]。

1.3.3分析條件

色譜條件：色譜柱，TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；載氣，氦氣(99.999%)；流速，1.0 ml/min；進(jìn)樣量，1.0 μl，分流比，10∶1；進(jìn)樣口溫度，250℃；程序升溫，80℃保持2 min，以30℃/min速率升溫至140℃，保持1 min，以2℃/min速率升溫至240℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI電離方式；采集方式，Q3 Scan；質(zhì)量掃描范圍m/z為40～450；離子源溫度：220℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲：5.5 min。獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò) NIST 14 質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索，根據(jù)保留時(shí)間來(lái)確定各組分種類，并采用面積歸一化法計(jì)算各組分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1甲酯化方法的選擇

脂肪酸甲酯化常用方法有如下幾種：硫酸-甲醇法、KOH-甲醇法、三氟化硼-甲醇法等，其各有優(yōu)缺點(diǎn)，適用范圍和測(cè)定結(jié)果各不同。硫酸-甲醇法一般用于游離型和甘油三酯型脂肪酸；KOH-甲醇法一般適用于甘油三酯型；三氟化硼-甲醇法與前2種方法相比步驟繁瑣，操作復(fù)雜，而且溶液毒性較強(qiáng)，易于揮發(fā)，因此本研究不選擇此法。當(dāng)采用KOH-甲醇法時(shí)，檢測(cè)出山茶油中含有11種脂肪酸，各組分能很好的分離。當(dāng)采用硫酸-甲醇法時(shí)，檢測(cè)出山茶油中含有9種脂肪酸，有可能是脂肪酸在酸性條件下與甲醇發(fā)生了酯化反應(yīng)，但體系中有水的存在抑制其反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)生的可能[3]。結(jié)果表明，樣品在堿性條件下萃取，經(jīng)甲酯化處理后，能有效的減少長(zhǎng)碳鏈脂肪酸在高溫下的裂解的情況[4]，為了檢測(cè)山茶油中更多種脂肪酸的種類，我們選擇KOH-甲醇法對(duì)山茶油進(jìn)行甲酯化。

2.1.2甲酯化催化劑濃度的選擇

精密稱取樣品100 mg于25 ml比色管中，加入5 ml正己烷溶解試樣，振搖2 min，試樣溶解后分別加入0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和4.0 mol/L KOH-甲醇溶液，后續(xù)操作按1.3.2進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 KOH-甲醇溶液濃度對(duì)甲酯化的影響

由圖1可知，隨著KOH-甲醇溶液濃度的增加，總峰面積先增后減，當(dāng)KOH-甲醇溶液濃度為0.5 mol/L時(shí)總面積最大。這是因?yàn)镵OH-甲醇溶液濃度低于0.5 mol/L時(shí)，脂肪酸未完全甲酯化；當(dāng)KOH-甲醇溶液濃度高于0.5 mol/L時(shí)，會(huì)引起脂肪酸甲酯皂化。故選用0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液作為甲酯化催化劑。

2.1.3甲酯化溫度的選擇

精密稱取樣品100 mg 于25 ml比色管中，加入5 ml正己烷溶解試樣，振搖2 min，試樣溶解后加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.5 ml，搖勻，超聲溫度依次為20、30、40、50、60℃，超聲波處理20 min，后續(xù)操作按1.3.2進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)甲酯化的影響

由圖2可知，超聲溫度為40℃時(shí)，脂肪酸總峰面積達(dá)到最大，且分離效果最好。這是因?yàn)楫?dāng)溫度低于40℃時(shí)，脂肪酸甲酯化不完全，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，脂肪酸甲酯化會(huì)發(fā)生皂化等副反應(yīng)，造成總峰面積的減少[5]，故選用40℃作為甲酯化的超聲溫度。

2.1.4甲酯化時(shí)間的選擇

精密稱取樣品100 mg 于25 ml比色管中，加入5 ml正己烷溶解試樣，振搖2 min，試樣溶解后加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.5 ml，搖勻，40℃超聲處理時(shí)間分別為10、20、30、40 、50 min，后續(xù)操作按1.3.2進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)甲酯化的影響

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，脂肪酸總峰面積達(dá)到最大，超聲時(shí)間超過(guò)20 min后，皂化等副反應(yīng)的發(fā)生，破壞了這種平衡，則脂肪酸總峰面積減少，故選用超聲甲酯化的時(shí)間為20 min。

2.2 GC-MS條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

本研究為了獲得最大的峰容量與分離度，對(duì)GC-MS中的色譜柱進(jìn)行選擇，因要考慮54種脂肪酸都能達(dá)到很好的分離效果，故我們選擇了CP-Sil 88(50 m×0.25 mm×0.2 μm)、CP-Sil 88(100 m×0.25 mm×0.2 μm)和TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.2 μm)3根柱子進(jìn)行探討。柱長(zhǎng)度增加一倍，分離度提高一倍以上，碳鏈越短，出峰越快；飽和脂肪酸甲酯先出峰，不飽和脂肪酸甲酯后出峰；反式先出峰，順式后出峰，故選擇柱長(zhǎng)為100 m的色譜柱。CP-Sil 88的固定相為100%二氰丙基-聚硅氧烷，最高溫度可達(dá)到240℃；而TR-FAME極性固定相為70% 氰丙基聚硅亞苯基硅氧烷，與其他色譜柱相比，能耐受更高的操作溫度，最高溫度可達(dá)到260℃，且流失低，適用于 GC-MS分析脂肪酸甲酯，包括順式和反式異構(gòu)體。所以本研究選用TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.2 μm)色譜柱進(jìn)行分析。

2.2.2升溫程序的優(yōu)化

選擇合適的柱溫是實(shí)現(xiàn)各種脂肪酸良好分離的關(guān)鍵[6]。因?yàn)?4種脂肪酸的相對(duì)分子質(zhì)量、熔點(diǎn)和沸點(diǎn)分布范圍較廣，所以很難用簡(jiǎn)單的升溫程序得到最佳分離效果。在確保54種脂肪酸具有很好的分離度的前提下，通過(guò)不斷調(diào)節(jié)色譜柱的升溫程序，發(fā)現(xiàn)多階升溫程序?qū)?4種脂肪酸有很好的分離效果。最終確定的升溫程序?yàn)椋?0℃保持2 min，以30℃/min 速率升溫至140℃，保持1 min；以2℃/min速率升溫至240℃，保持5 min；離子源溫度：220℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲：5.5 min。

2.2.3定性分析

將54種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品混合，將全掃描二維譜圖中各峰點(diǎn)質(zhì)譜圖導(dǎo)入NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索而實(shí)現(xiàn)定性分析，對(duì)于譜圖無(wú)法識(shí)別、相近的同分異構(gòu)體則采用單一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣的方式來(lái)進(jìn)行判定。結(jié)果表明，54種脂肪酸都得到了較好的分離，在二維色譜上出現(xiàn)重組的現(xiàn)象(見(jiàn)表1、圖4)?？紤]到脂肪酸同分異構(gòu)體的響應(yīng)值相近，可用面積歸一化法測(cè)定各脂肪酸的相對(duì)含量。

表1 54種脂肪酸的保留時(shí)間、分子量、定量離子和定性離子

圖4 54種脂肪酸甲酯的質(zhì)譜圖

2.3 山茶油脂肪酸組成的測(cè)定

山茶油中脂肪酸的定性是采取標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間并結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行的。山茶油中脂肪酸甲酯化合物名稱及含量見(jiàn)表2，其圖譜見(jiàn)圖5。

1.十四烷酸甲酯；2.十六烷酸甲酯；3.(Z)-9-十六烯酸甲酯(棕櫚油酸甲酯)；4.硬脂酸甲酯；5.(Z)-9-十八烯酸甲酯；6.(Z,Z)-9,12-十八烯二烯酸甲酯；7.亞麻酸甲酯；8.二十烷酸甲酯；9.11-二十碳烯酸甲酯；10.二十二烷酸甲酯；11.二十四烷酸甲酯

表2 山茶油中脂肪酸甲酯化合物名稱及含量(n=3)

利用建立好的54種脂肪酸甲酯的GC-MS方法，按照1.3.2將山茶油樣品進(jìn)行甲酯化，再按照1.3.3色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，利用面積歸一化法計(jì)算其含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤，結(jié)果見(jiàn)表2。本研究的山茶油中約含有11種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占81.62%，亞油酸甲酯、反-9-十八烯酸甲酯、反9,12-十八烯二烯酸甲酯的比例較高；飽和脂肪酸占18.38%，其中十六碳酸甲酯、硬脂酸甲酯、二十二碳酸甲酯占的比例較高。

3 結(jié)論

我們建立了54種脂肪酸的GC-MS定性定量分析方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食品中復(fù)雜基質(zhì)中脂肪酸的檢測(cè)。與傳統(tǒng)的GC法相比，本方法能同時(shí)測(cè)定54種脂肪酸，并且解決了順?lè)词街舅岬臏y(cè)定，可簡(jiǎn)便、有效、快速開(kāi)展大量油脂中脂肪酸的檢測(cè)提供參考。