陳澤田，陸凌雪，白靜文，梁子豪，張 坤，潘 韻

(1.河南邑鴻善成生物技術(shù)有限公司，河南 焦作 454950；2.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

δ-氨基乙酰丙酸(δ-ALA)是生物體內(nèi)四氫吡咯合成的前體，在各種生物中廣泛存在，是合成葉綠素、血紅素、維生素B12的必需因子，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物及植物等生物機(jī)體活細(xì)胞中的非蛋白質(zhì)氨基酸，是動(dòng)植物生命活動(dòng)必需的、代謝活躍的生理活性物質(zhì)，可以通過生物途徑合成，也可以人工化學(xué)合成，沒有毒副作用，易降解無殘留。δ-ALA由于其獨(dú)特的性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用在手術(shù)[1]以及癌癥和其他疾病的治療上[2-3]。在動(dòng)物上的應(yīng)用近年來也開始有報(bào)道。東京大學(xué)的Sato等在肉雞上使用0.001%的δ-ALA，結(jié)果表明，其可以預(yù)防免疫刺激引起的分解代謝變化，雞只在21日齡和50日齡的體重明顯增加[4]。得克薩斯大學(xué)的Mateo等在21日齡斷奶仔豬上使用0.05%的δ-ALA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加δ-ALA增加了紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，且對(duì)斷奶仔豬無不良影響[5]。東京大學(xué)的Ivane等在凡納對(duì)蝦上使用15 mg/kg的δ-ALA，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)了凡納對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的免疫反應(yīng)，上調(diào)了免疫和防御相關(guān)的基因表達(dá)，增強(qiáng)了有氧能量代謝[6]。而酵母菌是人類最早利用、公認(rèn)安全且應(yīng)用最廣泛的微生物，是全球目前唯一年產(chǎn)量超過百萬t的微生物。酵母類飼料是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)飼料。

國內(nèi)對(duì)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)δ-ALA的研究已有許多報(bào)道，但絕大多數(shù)均作為原料藥物研究，且宿主基本都是細(xì)菌，如嗜酸紅假單胞菌[7]、大腸桿菌[8]、谷氨酸棒狀桿菌[9]、科氏葡萄球菌[10]等。本研究2018年通過基因工程方法對(duì)酵母菌進(jìn)行改造，成功獲得一株能大量積累δ-ALA的菌株P(guān)RS-416。在獲得基因工程菌之后，對(duì)其固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究，并針對(duì)酵母代謝產(chǎn)物δ-ALA的測(cè)定分析比較了分光光度法、高效液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)結(jié)果的影響，確定了一種酵母代謝產(chǎn)物δ-ALA的測(cè)定方法，對(duì)酵母類飼料產(chǎn)品建立新的標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料與菌株

玉米，購自沁陽市金玉米種植專業(yè)合作社；玉米蛋白粉，購自內(nèi)蒙古伊品生物科技有限公司；豆粕，購自焦作市三福飼料有限公司；大米粉,購買原陽大米粉碎制備；發(fā)酵前，所有原料均粉碎后過40目篩;菌株,釀酒酵母PRS-416，由天津大學(xué)構(gòu)建。

1.2 測(cè)試樣品

測(cè)試的4種酵母類產(chǎn)品分別為:(1)釀酒酵母培養(yǎng)物，河南邑鴻善成生物有限公司提供；(2)PRS-416釀酒酵母菌體，河南邑鴻善成生物有限公司提供；(3)市售高活性干酵母，產(chǎn)地湖北；(4)市售飼料用酵母水解物，產(chǎn)地廣西。

1.3 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀Agilent 1220，美國安捷倫公司；Waters ACQUITY-UPLC配置 ACQUITY SQ檢測(cè)器，美國Waters公司；分光光度計(jì)UV-1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

試劑：甲醇，色譜純；丹磺酰氯、丙酮、冰乙酸、高氯酸、乙酰乙酸乙酯，分析純；無水乙酸鈉、對(duì)-二甲氨基苯甲醛、無水葡萄糖，分析純；δ-ALA鹽酸鹽、YNB、Ura Dropout Powder、酵母浸粉(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Trptone)，BR級(jí)。

1.4 培養(yǎng)基

Sc-Ura選擇培養(yǎng)基：無水葡萄糖20 g/L，YNB 0.067 g/L，Ura Dropout Powder 0.001 3 g/L，pH 5.6；YPD液體培養(yǎng)基：無水葡萄糖20 g/L，酵母浸10 g/L，胰蛋白胨20 g/L。

以上培養(yǎng)基均115℃滅菌30 min后使用。

1.5 釀酒酵母PRS-416的培養(yǎng)

將Sc-Ura選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的菌落挑取一環(huán)于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)12 h后，再按照2%比例轉(zhuǎn)接一次，同樣條件培養(yǎng)12 h后制成種子液(顯微鏡計(jì)數(shù)≥2.0×108CFU/ml)用來進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。

1.6 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.6.1固態(tài)發(fā)酵條件底物篩選

玉米、玉米蛋白粉、豆粕、大米粉以不同質(zhì)量比(4∶1∶0∶0，2∶0∶1∶0，2∶1∶0∶1，3∶0∶2∶2)混勻并稱取200 g，料水比為1∶0.5，菌液接種量50 ml/kg(與發(fā)酵底物的比例)，葡萄糖0.25%(與發(fā)酵底物的比例)，混勻后裝入1 L燒杯中，放入30℃培養(yǎng)箱中，固體發(fā)酵36 h，70℃烘干30 min后用分光光度法測(cè)定其δ-ALA含量。

1.6.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

發(fā)酵底物玉米、玉米蛋白粉(質(zhì)量比4∶1)稱取200 g于1 L燒杯，料水比為1∶0.5，菌液接種量50 ml/kg，放入30℃培養(yǎng)箱中，固體發(fā)酵36 h，70℃烘干30 min后用分光光度法測(cè)定其δ-ALA含量?？紤]接種量(S)、葡萄糖(G)、丁二酸+甘氨酸(D)、酵母浸粉+胰蛋白胨(Y)這4個(gè)因素(將后2種組合成1個(gè)因素看待)，試驗(yàn)方案按照表1設(shè)計(jì)。

表1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基篩選方案

1.6.3發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的確定

發(fā)酵底物玉米、玉米蛋白粉(質(zhì)量比4∶1)稱取200 g于1 L燒杯，料水比為1∶0.5，菌液接種量22.5 ml/kg，葡萄糖0.25%，丁二酸0.5%，甘氨酸0.5%，在燒杯中攪拌均勻，放入30℃培養(yǎng)箱中，分別發(fā)酵24、36、48、60、72 h，70℃烘干30 min后用分光光度法測(cè)定其δ-ALA含量。

1.7 不同檢測(cè)方法檢測(cè)樣品的δ-ALA含量

1.7.1樣品前處理

稱取樣品1、2、3、4各1 g，加入5 ml去離子水震蕩混懸2 min后，4℃ 10 000 r/min離心5 min。取上清1 ml，加入同體積40%三氯乙酸，震蕩，混勻，10 000 r/min，4℃離心10 min，用0.22 μm濾膜過濾。

1.7.2分光光度法測(cè)定δ-ALA含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：參考中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]配制δ-ALA標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。得到δ-ALA回歸方程為y=0.064x+0.006 7。

圖1 分光光度法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定δ-ALA含量[11]：取樣品1 ml置于10 ml離心管中，依次加入1 ml去離子水，2 ml乙酸鹽緩沖液，0.4 ml乙酰乙酸乙酯，沸水浴12 min。冷卻至室溫后，加入4 ml乙酸乙酯萃取，震蕩混勻后靜置直至分層；取2 ml上層乙酸乙酯萃取液，加入2 ml顯色液，混勻，反應(yīng)10 min后，在554 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.3高效液相柱前衍生法[12]測(cè)定δ-ALA含量

色譜條件：C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，用流動(dòng)相為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液與色譜純甲醇以35∶65體積混合，分別使用2.5 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至目標(biāo)值。流速1 ml/min，柱溫30℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按照上述的色譜條件，分別配制不同濃度(10、50、100、400 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)3次。以峰面積為縱坐標(biāo)，以δ-ALA的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得到回歸方程y=ax+b，其中，a=2.329 17×10-5，b=-120.648，回歸系數(shù)R2為0.998 867。

測(cè)定方法：0.5 ml樣品與0.45 ml飽和NaHCO3溶液混合，震蕩均勻后加入丹磺酰氯丙酮溶液0.25 ml 90℃避光進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生結(jié)束后加入0.05 ml冰乙酸終止反應(yīng)，0.22 μm膜過濾后進(jìn)樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.4液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)樣品中δ-ALA定性分析

樣品處理方法除未用三氯乙酸處理外其余方法和1.7.1節(jié)樣品前處理方法一樣。樣品上樣前用甲醇稀釋10倍，液相色譜條件為：Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為100%甲醇，柱溫：30℃，流速為0.5 ml/min。質(zhì)譜條件為：Waters ACQUITY SQD；電離模式，(+)ESI；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓20 V，離子源溫度120℃；去溶劑化溫度300℃；脫溶劑氣體流速550 L/h；錐孔氣體流速50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵底物對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響

圖3 不同發(fā)酵底物對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響

1.6.1節(jié)方法中的4個(gè)試驗(yàn)組，均是根據(jù)發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥18%配比。以這4個(gè)配比發(fā)酵后可以看出，玉米∶玉米蛋白粉∶豆粕∶大米粉比例為4∶1∶0∶0和2∶1∶0∶1的試驗(yàn)組發(fā)酵24 h后其δ-ALA含量較高，分別為91.13和79.02 mg/kg。綜合考慮，選取4∶1∶0∶0作為發(fā)酵底物的最佳比例。

2.2 不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響

由圖4可知，第11組δ-ALA含量最高。酵母粉和胰蛋白胨含量增加，反而會(huì)降低δ-ALA含量，所以在后續(xù)試驗(yàn)中不再添加酵母粉和胰蛋白胨；個(gè)別組菌液接種量由22.5 ml/kg增加到45 ml/kg，δ-ALA含量會(huì)有一定的提高，但不顯著。綜合考慮，后續(xù)試驗(yàn)中選取22.5 ml/kg作為菌液接種量的最佳比例；葡萄糖添加量由0.25%增加到1.00%，δ-ALA含量沒有顯著性差異，個(gè)別組甚至降低，后續(xù)試驗(yàn)選取0.25%作為葡萄糖添加的最佳比例；整體趨勢(shì)上，增加丁二酸和甘氨酸的添加量會(huì)使發(fā)酵飼料中δ-ALA含量升高，所以，后續(xù)試驗(yàn)選取0.5%和0.5%作為丁二酸和甘氨酸添加的最佳比例。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響

選擇優(yōu)化好的配方，玉米∶玉米蛋白粉4∶1，料水比為1∶0.5，菌液接種量22.5 ml/kg，葡萄糖0.25%，丁二酸0.5%，甘氨酸0.5%，探究不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，24～48 h，隨發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的增加，δ-ALA含量逐漸升高，48 h δ-ALA含量可達(dá)到338.87 mg/kg；48 h以后，δ-ALA含量增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，甚至到72 h會(huì)呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。綜合考慮，選擇48 h作為固態(tài)發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵飼料中δ-ALA的影響

2.4 分光光度法測(cè)定δ-ALA

用分光光度法分別測(cè)定釀酒酵母培養(yǎng)物、PRS-416釀酒酵母菌體、高活性干酵母、飼料用酵母水解物中的δ-ALA含量，結(jié)果見表2。

表2 分光光度法測(cè)定樣品結(jié)果

2.5 高效液相柱前衍生法測(cè)定δ-ALA

用高效液相柱前衍生法分別測(cè)定釀酒酵母培養(yǎng)物、PRS-416釀酒酵母菌體、高活性干酵母、飼料用酵母水解物中的δ-ALA含量，結(jié)果見圖6和表3。

圖6 4種樣品的液相色譜圖

表3 高效液相柱前衍生法測(cè)定樣品結(jié)果

由圖6可知，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的出峰時(shí)間均在5.5 min。與分光光度法測(cè)定結(jié)果相比，1、2、3號(hào)樣品測(cè)定結(jié)果比較相近，樣品4用2種方法測(cè)定的結(jié)果相差較大。因此，繼續(xù)將這4種樣品用液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性測(cè)定。

2.6 液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定δ-ALA

用液相色譜-質(zhì)譜法分別測(cè)定釀酒酵母培養(yǎng)物、PRS-416釀酒酵母菌體、高活性干酵母、飼料用酵母水解物中的δ-ALA含量，結(jié)果見圖7。

圖7 4種樣品的液相色譜-質(zhì)譜圖

由圖7可知，(a)中標(biāo)準(zhǔn)溶液δ-ALA的出峰時(shí)間在0.45 min，分子量為132的信號(hào)最強(qiáng)，而標(biāo)準(zhǔn)溶液附近的115、133、173以及219等分子量的信號(hào)，推測(cè)是δ-ALA電離時(shí)產(chǎn)生的碎片。這和Drugbank中介紹δ-ALA時(shí)的液相色譜圖(Drugbank ID：DB00855)結(jié)果一致。(b)、(c)中1、2號(hào)樣品δ-ALA的出峰時(shí)間都在0.49 min，1號(hào)樣品的132分子量的信號(hào)稍弱，但也能顯示出該樣品中含有δ-ALA，2號(hào)樣品中132分子量的信號(hào)比較強(qiáng)，1號(hào)和2號(hào)樣品液相色譜-質(zhì)譜法的測(cè)定結(jié)果和前兩種方法的結(jié)果也比較吻合；(d)中3號(hào)樣品雖然在0.46 min出峰，但找不到132分子量的信號(hào)；(e)中4號(hào)樣品δ-ALA沒有出峰，在0.45～0.5 min時(shí)出現(xiàn)的是雜亂無章的峰，也找不到132分子量的信號(hào)。

3 討論

3.1 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)發(fā)酵底物優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)玉米∶玉米蛋白粉∶豆粕∶大米粉比例為4∶1∶0∶0組效果更佳，可能是酵母更易利用玉米中的碳源及玉米蛋白粉的氮源供其自身生長(zhǎng)及發(fā)酵。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母浸粉和胰蛋白胨為酵母發(fā)酵補(bǔ)充有機(jī)氮源，并提供酵母生長(zhǎng)所需的各種維生素、氨基酸和生長(zhǎng)因子等，但添加量高反而降低δ-ALA合成，可能是由于發(fā)酵底物中玉米蛋白粉中的氮源足夠其有效利用，額外增加有機(jī)氮源反而會(huì)抑制其自身的生長(zhǎng)發(fā)酵。

培養(yǎng)基添加葡萄糖為酵母發(fā)酵補(bǔ)充碳源，不過葡萄糖添加量由0.25%增加到1.00%，沒有顯著性差異，甚至個(gè)別組增加葡萄糖添加量會(huì)降低δ-ALA含量，可能是發(fā)酵底物提供的碳源足夠滿足酵母生長(zhǎng)發(fā)酵。

酵母合成δ-ALA的代謝途徑是C4途徑，δ-ALA合成的前體物質(zhì)包括丁二酸和甘氨酸，所以在固態(tài)發(fā)酵當(dāng)中適當(dāng)添加這2種物質(zhì)的量，可以提高產(chǎn)品中δ-ALA的產(chǎn)量。但隨著前體物質(zhì)增加，會(huì)反饋性抑制δ-ALA合成酶的活性，進(jìn)而使δ-ALA的產(chǎn)量不再增加。故選取0.5%和0.5%作為丁二酸和甘氨酸添加的最佳比例。

3.2 酵母代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法

自2007年農(nóng)業(yè)部公告2038號(hào)將釀酒酵母培養(yǎng)物從《飼料添加劑品種目錄》轉(zhuǎn)入《飼料原料目錄》以來，酵母培養(yǎng)物類產(chǎn)品與日俱增。筆者于2019年對(duì)市場(chǎng)上各種價(jià)格區(qū)間的釀酒酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品測(cè)試發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量參差不齊[13]，生物飼料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟也因此于2018-09-07發(fā)布了《飼料原料 釀酒酵母培養(yǎng)物》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重金屬、霉菌毒素、有害菌等均作出推薦標(biāo)準(zhǔn)[14]。但對(duì)于釀酒酵母代謝產(chǎn)物的種類和含量仍無法作出統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)釀酒酵母培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中確含有釀酒酵母的代謝產(chǎn)物——δ-ALA，且可用分光光度法、液相色譜法等常規(guī)方法定量檢測(cè)。雖然該代謝產(chǎn)物具有特異性(從其他酵母類產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果可看出)，但對(duì)于酵母類產(chǎn)品的檢測(cè)還是有一定的意義。如各生產(chǎn)商可以根據(jù)自身特點(diǎn)，找到一種特征代謝產(chǎn)物并提供其定量檢測(cè)方法，對(duì)于包括釀酒酵母培養(yǎng)物在內(nèi)的酵母類產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)有很大意義，對(duì)于客戶選擇、使用產(chǎn)品也有很大幫助。

目前針對(duì)δ-ALA檢測(cè)方法有很多種，比如高效液相法、基于氣液色譜的電子捕獲檢測(cè)方法，以及電泳耦合紫外檢測(cè)法都有人嘗試過，但是這些儀器在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中并不常用。目前，最常用的定量方法是分光光度法。本研究針對(duì)釀酒酵母培養(yǎng)物、釀酒酵母菌體、高活性干酵母、飼料用酵母水解物采用分光光度法和高效液相柱前衍生法進(jìn)行測(cè)定，并用液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前2種方法測(cè)定的結(jié)果存在一定的差異。這4種樣品用分光光度法和高效液相柱前衍生法測(cè)定的誤差分別在45%、21%、3%和80%。且3、4號(hào)樣品用液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性從質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)，二者無法找到δ-ALA 132 分子量的信號(hào)，說明樣品中也可能含有與δ-ALA結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)導(dǎo)致測(cè)定分光光度法結(jié)果產(chǎn)生假陽性。

分光光度法測(cè)定δ-ALA的原理是利用該過程依賴于5-氨基乙酰丙酸與乙酰乙酸乙酯縮合成吡咯化合物，該化合物用乙酸乙酯提取，后續(xù)與對(duì)二甲氨基苯甲醛作用生成紅色化合物，在554 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定[11]。雖然可以快速地檢測(cè)出δ-ALA含量，但是產(chǎn)生的衍生物極不穩(wěn)定，反應(yīng)過后需要立即測(cè)定，否則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，另外該方法的缺點(diǎn)就是專一性不強(qiáng)，因?yàn)樵噭┖苋菀缀推渌衔镞M(jìn)行反應(yīng)，比如吡咯、氨基酮類和吲哚衍生物會(huì)干擾衍生反應(yīng)而造成結(jié)果假陽性[15]。所以，利用分光光度法測(cè)定δ-ALA含量，會(huì)存在一定的偏差，需要與高效液相柱前衍生法進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，并利用液相-質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行定性，才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。但是在實(shí)驗(yàn)室條件有限的情況下，分光光度法因其測(cè)定成本低，操作簡(jiǎn)便，可以作為參考。