楊 濤，袁 輝

(新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830011)

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1]，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的幾率很高。它們存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別是容易污染花生、玉米、小麥等糧油產(chǎn)品，是霉菌毒素中毒性最大、對人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。

黃曲霉毒素 B1是黃曲霉毒素的產(chǎn)物中對人體最具威脅的物質(zhì)，具有致癌、致突變和致畸形作用。目前，檢測黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法[2]， 高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4]，以及酶聯(lián)免疫吸附測定法[5]等。本研究按照2016年12月發(fā)布的GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[6]中第一法：同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對小麥粉中黃曲霉毒素B1進(jìn)行測定，并依據(jù) CNAS—GL 06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》和 JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[7-8]規(guī)定的方法建立了數(shù)學(xué)模型，分析了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥粉中黃曲霉毒素B1過程中所引入的不確定度來源，并對各個不確定來源進(jìn)行了分析、量化處理，得出小麥粉中黃曲霉毒素B1含量的擴(kuò)展不確定度，對其最終測定結(jié)果進(jìn)行不確定度評估，為小麥粉中黃曲霉毒素B1的測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，含量標(biāo)示為(100.54±0.3)μg/ml，純度為99%，Pribolab公司；同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，含量標(biāo)示為(0.501 ± 0.008) μg/ml，純度為99.3%，Pribolab公司；甲醇，色譜純，F(xiàn)isher公司；乙酸銨，色譜純，sigma公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，華安麥科；小麥粉為市場購買。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4000+高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，美國AB公司； 色譜柱：島津C18色譜柱，150 mm×2.1 mm，3 μm；Sartorius BSA22025電子天平，感量0.01 g，德國Sartorius公司；固相萃取裝置，美國J2 Scientific公司；5418離心機(jī)，德國Eppendorf；超純水機(jī)，美國millipore公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品1.00 ml于10 ml容量瓶，甲醇定容為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取儲備液0.5 ml于50 ml容量瓶，定容為標(biāo)準(zhǔn)工作液。移取13C17-黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品2 ml于10 ml容量瓶，作為同位素內(nèi)標(biāo)工作液。準(zhǔn)確移取工作液10、100、300、500、1 000 μl至10 ml容量瓶中，加入200 μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液，甲醇定容至刻度，得到內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為2 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣5.00 g于離心管中，加入100 μl內(nèi)標(biāo)，震蕩后靜置30 min。加入(7+3)甲醇水20 ml，超聲提取20 min。6 000 r/min離心10 min，取上清液4 ml，加25 ml水稀釋，將待凈化液注入免疫親和柱中，調(diào)節(jié)壓力以6 ml/min的流速過免疫親和柱，直至2～3 ml空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1 ml色譜甲醇洗脫，流速為1～2 ml/min，收集全部流出液于樣品瓶中，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供測試使用。

1.3.3儀器分析條件

流動相為5 mmol乙酸銨溶液∶甲醇，流速0.3 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量：10 μl。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測條件

1.3.4數(shù)學(xué)模型的建立與不確定度來源的分析

1.3.4.1不確定度的評估

不確定度的評估需要明確測量值的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而分析其可能的不確定來源。本實(shí)驗中黃曲霉毒素B1的數(shù)學(xué)計算模型如式(1)所示：

(1)

式中，X為試樣中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；m為試樣質(zhì)量，g；V1為 樣品提取液總體積，20 ml；V2為免疫親和柱上樣體積，4 ml；V3為樣品定容體積，1 ml；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測得試液中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度，ng/ml；f為樣品加標(biāo)回收率，%。

1.3.4.2不確定度分量的主要來源及其分析

該方法前處理過程主要為手工操作，受人為因素影響較大。根據(jù)檢測方法和實(shí)際操作情況，高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1不確定度主要有以下幾個來源：一是標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過程引入的不確定度，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度；二是樣品前處理過程引入的不確定度，包括樣品稱量、提取溶劑的總體積、免疫親和柱上樣體積和最終定容體積以及提取效率和樣品回收率引入的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度(c)[9-11]

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自身純度、標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋配制過程以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等引入。

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自身純度引入的不確定度(s)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書可得知，黃曲霉毒素B1和同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1的含量分別為100.54±0.3 μg/ml和0.501±0.008 μg/ml(k=2)，按照均勻分布計算，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對不確定度分別為：

urel(s1)=0.03÷(100.54×2)=0.001 49

urel(s2)=0.008÷(0.501×2)=0.007 98

因此，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度為：

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中移液器和玻璃量器引入的不確定度(D)

2.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中體積引入的不確定度(V)

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的過程中使用了一系列的移液器和玻璃量器，依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[12-13]所明示，對本實(shí)驗中所使用的移液器和玻璃量器均有相應(yīng)的最大允許誤差，按照矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中移液器和玻璃量器引入的相對不確定度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度

在標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過程中，使用10 ml容量瓶7次，100 ml容量瓶1次， 1 000 μl移液器移取1 000 μl體積4次，1 000 μl移液器移取500 μl體積1次，300 μl移液器移取300 μl體積1次，100 μl移液器移取100 μl體積1次，10 μl移液器移取10 μl體積1次，200 μl移液器移取200 μl同位素內(nèi)標(biāo)體積5次。由表2中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中，移液器和玻璃量器引入的相對不確定度為：

=0.053

2.1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中溫度波動引入的不確定度(T)

移液器和玻璃量器的鑒定是在20℃下進(jìn)行，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的溫度要控制在(20±5)℃，因此，可以通過估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)，計算由溫度波動引入的不確定度。由于玻璃的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于液體的膨脹系數(shù)，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略不計。標(biāo)準(zhǔn)溶液是用甲醇稀釋配制的，甲醇在20℃時的膨脹系數(shù)為1.19 ×10-3ml/℃，溫度變化按照矩形分布，各移液器和玻璃量器因溫度波動引入的不確定度見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度引入的不確定度

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，以及移液器和玻璃量器使用次數(shù)，合成標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中，溫度變化引入的相對不確定度：

=0.015

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中移液器和玻璃量器引入的不確定度為：

=0.055

2.1.3最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度(q)

標(biāo)液系列的質(zhì)量濃度為0.1、1、3、5、10 ng/ml，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為2 ng/ml，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上對五個校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液各測量3次，共計15次，得到各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所對應(yīng)的峰面積比值。標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)如表4，用最小二乘法擬合各標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與峰面積比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表4 內(nèi)標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)

對被測樣品溶液中的的黃曲霉毒素B1共測量2次，即p=2。根據(jù)峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到樣品中黃曲霉毒素B1平均質(zhì)量濃度為x=4.3 ng/ml。于是由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度u(q)為

=0.176 6

其中：

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對不確定度為：

urel(q)=u(q)/x=0.041

因此，樣品在測定過程中，由標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度為：

2.2 樣品前處理過程引入的不確定度[10,14]

2.2.1樣品稱量過程引入的不確定度(m)

天平校準(zhǔn)的允許最大誤差為0.01 g，標(biāo)準(zhǔn)要求稱樣質(zhì)量為5.00 g，按矩形分布原則，稱樣時由天平的最大允許誤差導(dǎo)致的樣品質(zhì)量不確定度為

2.2.2添加內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度(I)

采用100 μl移液器加入內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，由移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(I)=uT6rel=0.011 5

2.2.3樣品提取液總體積(V1)

樣品提取液使用25 ml量筒量取(7+3)甲醇水20 ml，JJG196—2006《常用玻璃量器》[12]規(guī)定：20℃時25 ml量筒的容量允許誤差為±0.25 ml，按矩形分布，則量筒量取提取液體積引來的不確定度分量為：

2.2.4免疫親和柱上樣體積(V2)

使用5 ml移液器移取4 ml提取液進(jìn)行免疫親和柱法，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[13]：20℃時5 ml移液器在5 ml檢定點(diǎn)的最大允許誤差為0.6%，按矩形分布，則免疫親和柱上樣體積引來的不確定度分量為：

2.2.5樣品定容體積(V3)

樣品最終定容使用1 ml單標(biāo)線移液管移取色譜級甲醇進(jìn)行定容，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[13]：20℃時1 ml移液器在1 ml檢定點(diǎn)的最大允許誤差為0.1%，按照矩形分布，則樣品定容體積引來的不確定度分量為：

2.2.6提取效率和過小柱得到的回收率影響(f)

如1.3.2所述，測定小麥粉中的黃曲霉毒素B1的前處理需經(jīng)過對樣品的稱量、提取、上柱凈化、洗脫定容等步驟后經(jīng)儀器分析測試。在這冗長的過程中必然會造成樣品的測定值偏離真值。本實(shí)驗對樣品進(jìn)行6次平行測試，根據(jù)6次結(jié)果進(jìn)行計算，回收率結(jié)果見表5。

表5 回收率結(jié)果統(tǒng)計

根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%，因此由樣品回收率引入的相對不確定度為：

urel(f)=0.040

2.3 分析儀器引入的不確定度(E)

本實(shí)驗所采用的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的擴(kuò)展不確定度為5%，k=2(由新疆自治區(qū)計量測試研究院出具的校準(zhǔn)證書)，則由液相色譜-串聯(lián)質(zhì)樸儀引入的相對不確定度為：

urel(E)=0.05÷2=0.025

2.4 測量不確定度的評定與報告

2.4.1合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對不確定度分量見表6。

表6 各相對不確定度分量匯總表

由表6可以看出，小麥粉中黃曲霉毒素B1的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量貢獻(xiàn)較大的分別是標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及提取效率和過小柱得到的回收率，而樣品稱量、樣品提取液體積等引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對較小。

由表6中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.084

2.4.2擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[15]規(guī)定，在95%置信水平下，取包含因子k為2，小麥粉中黃曲霉毒素B1的測量值為4.3 ng/ml，按照前處理過程，計算得到小麥粉中黃曲霉毒素B1的含量為4.30 μg/kg，則擴(kuò)展不確定度

U= 4.30×0.084×2 =0.72 μg/kg

2.4.3測定結(jié)果

按照該方法測定小麥粉中黃曲霉毒素B1的結(jié)果為：X=(4.30±0.72)μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

在報告測量的結(jié)果時，必須給出相應(yīng)的不確定度，一方面便于使用它的人評定其可靠性，另一方面也增強(qiáng)了測量結(jié)果之間的可比性。

本研究根據(jù)實(shí)驗過程建立數(shù)學(xué)模型，對小麥粉中黃曲霉毒素B1測定過程中的各個不確定度來源進(jìn)行了量化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響黃曲霉毒素B1測定的不確定度的主要因素，主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程，其百分比高達(dá)27.73%；其次是最小二乘法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及提取效率和過小柱的回收率引入的不確定度，均在20%以上；而樣品稱量以及前處理過程中定容體積等引入的不確定度相對而言都比較小。

看似對檢測結(jié)果影響不大的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程，因為有內(nèi)標(biāo)的加入，稀釋的步驟越多，所產(chǎn)生的不確定度越大，從而增大了不確定度因素。因此，在小麥粉中黃曲霉毒素B1測定過程中，要著重加強(qiáng)不確定分量中百分比最大的三個方面的質(zhì)量控制，從而降低測量不確定度，使測定結(jié)果的準(zhǔn)確性得以提高。