劉俊澤，趙靚瑜，黃凱，金曉明，李照見(jiàn)，李延森，李春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

新生仔豬的體重和健康狀況在很大程度上受到子宮內(nèi)環(huán)境的影響[1]。胎兒的生長(zhǎng)高度依賴于胎盤，有研究表明，胎兒的體重與胎盤的重量成正比[2-3]。促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)是胎盤的重要功能之一[4]。胎兒的生長(zhǎng)在很大程度上取決于養(yǎng)分的供應(yīng)，而養(yǎng)分的供應(yīng)則取決于胎盤的運(yùn)輸能力。因此，胎盤在調(diào)節(jié)母胎資源分配，影響胎兒生長(zhǎng)和后代的長(zhǎng)期健康方面起著至關(guān)重要的作用。

妊娠后期是胎兒增重的關(guān)鍵階段，在妊娠后期對(duì)母豬進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)胎盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是提高仔豬初生重的重要手段。多項(xiàng)研究表明，妊娠期添加微生物發(fā)酵飼料能夠提高母豬的產(chǎn)仔性能。經(jīng)乳酸桿菌、丁酸梭菌和雙歧桿菌發(fā)酵的基礎(chǔ)日糧提高了母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重[5]。益生菌發(fā)酵飼料提高了母豬的窩產(chǎn)活仔數(shù)和初生窩重[6]。在母豬日糧中添加8%的發(fā)酵豆粕可以顯著提高仔豬的出生窩重[7]。

豆渣是大豆在生產(chǎn)豆奶、豆腐、豆?jié){等大豆產(chǎn)品時(shí)的主要副產(chǎn)物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的脂質(zhì)、蛋白和膳食纖維[8]。考慮到蛋白質(zhì)飼料資源的短缺，本試驗(yàn)選擇豆渣進(jìn)行微生物發(fā)酵，參與發(fā)酵的微生物包括枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、釀酒酵母和糞腸球菌。在本試驗(yàn)中，我們假設(shè)發(fā)酵豆渣可能會(huì)增加胎盤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，并改善母豬的生殖性能。因此，我們研究了胎盤的生長(zhǎng)，母豬的繁殖性能以及胎盤氨基酸、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在江蘇宿遷立華種豬場(chǎng)進(jìn)行，根據(jù)體況選擇24頭妊娠85 d的PIC母豬，胎次為4～5胎，隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。在試驗(yàn)期間，對(duì)照組(CON)飼喂基礎(chǔ)日糧，3個(gè)處理組飼喂添加了3%(FBD 3)，6%(FBD 6)，9%(FBD 9)發(fā)酵豆渣的基礎(chǔ)日糧。本試驗(yàn)中使用的發(fā)酵豆渣是以40%的豆渣和60%的麥麩作為底物，原料消毒后接種混合菌液，接種比例為6%。混合菌液中嗜酸乳桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌比例為2∶2∶1∶1。發(fā)酵初始含水量為45%，發(fā)酵池密封處理，發(fā)酵溫度30～37 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。發(fā)酵豆渣的化學(xué)組成如表1所示。

表1 發(fā)酵豆渣營(yíng)養(yǎng)水平

基礎(chǔ)日糧根據(jù)NRC(2012)配制，發(fā)酵豆渣在添加時(shí)以濕樣形式添加，計(jì)算營(yíng)養(yǎng)水平時(shí)以風(fēng)干水平計(jì)算。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

2)代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值

飼喂從妊娠85 d開(kāi)始，直到分娩。從妊娠85至111 d，每頭母豬每天提供3 kg日糧，在早上7:00和下午3:00分2次飼喂。之后每天飼喂量減少0.5 kg，分娩當(dāng)天不飼喂。在分娩前一周，將母豬由妊娠舍(長(zhǎng)2.2 m×寬0.65 m)轉(zhuǎn)入分娩舍(長(zhǎng)2.2 m×寬1.5 m)。

1.2 數(shù)據(jù)記錄與樣品采集

在分娩的當(dāng)天，記錄每頭母豬生產(chǎn)的仔豬總數(shù)，活仔數(shù)和仔豬個(gè)體重。記錄母豬產(chǎn)出第1只仔豬到最后1只仔豬的時(shí)間，同時(shí)記錄出生間隔。測(cè)量仔豬體長(zhǎng)(每頭仔豬枕骨到尾根的距離)。體重指數(shù)的計(jì)算公式如下[9]：

體重指數(shù)(kg/m2) = 體重(kg)/身長(zhǎng)(m)2

產(chǎn)出所有胎盤后，記錄其重量。平均胎盤重為胎盤總重量和窩產(chǎn)仔豬的比值，包括死胎[10]。胎盤效率為初生窩重和胎盤總重量的比值。將排出的胎盤在室溫下彼此分開(kāi)，隨機(jī)選取其中3個(gè)，平鋪在方格紙上(長(zhǎng)75 cm×寬50 cm),用中性筆描繪輪廓并計(jì)算表面積。收集距臍帶約5 cm處的胎盤組織(2 cm×2 cm)并在液氮中速凍，然后在-80 ℃下保存用于RNA提取。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

用Trizol裂解液提取豬胎盤中的總RNA，并使用NanoDrop 2000 檢測(cè)其濃度，再使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成cDNA。引物參考NCBI中GenBank公布的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表3。

表3 目的基因及內(nèi)參基因引物

反應(yīng)體系為20 μL。目的基因上、下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L),SYBY Green real time PCR Master Mix(TaKaRa) 1 μL， DEPC水 8 μL，cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃ 60 s)；擴(kuò)增(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s)，40個(gè)循環(huán)；溶解(95 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，差異顯著時(shí)做Tukey組間多重比較；試驗(yàn)結(jié)果以平均值和固定效應(yīng)下的總標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬的產(chǎn)仔性能和胎盤效率的影響

由表4可知，隨著日糧中發(fā)酵豆渣含量的提高，體重指數(shù)(二次項(xiàng)，P=0.031)呈二次增加趨勢(shì)，個(gè)體胎盤重方面，F(xiàn)BD 9組的個(gè)體胎盤重較對(duì)照組和其他2個(gè)處理組的個(gè)體胎盤重顯著降低(P<0.05)。FBD 9組的胎盤效率較對(duì)照組和其他2個(gè)處理組有顯著的升高(P<0.05)。日糧中添加發(fā)酵豆渣對(duì)母豬的產(chǎn)程、產(chǎn)仔間隔、窩產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、胎盤面積和胎盤總重量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，對(duì)仔豬的初生窩重和體長(zhǎng)沒(méi)有顯著的影響(P>0.05)。

表4 日糧添加發(fā)酵豆渣對(duì)初生仔豬狀況和胎盤性能的影響

2.2 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬胎盤組織mTOR信號(hào)通路的影響

如圖1所示，胎盤組織mTOR的mRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 6和FBD 9組顯著高于CON組(P<0.05)，mTOR信號(hào)通路中4EBP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在3個(gè)處理組均顯著高于CON組(P<0.05)；mTOR信號(hào)通路中eIF2αmRNA相對(duì)表達(dá)量在3個(gè)處理組均顯著低于CON組(P<0.05)；同時(shí)mTOR信號(hào)通路中S6K1、eIF4EmRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 6和FBD 9組中顯著高于CON組(P<0.05)；RPS6的相對(duì)表達(dá)量在FBD 6組顯著低于CON組。

字母相同表示不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同圖1 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬胎盤mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬胎盤組織氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)因子mRNA表達(dá)水平的影響

如圖2所示，胎盤組織氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)因子LAT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 9組顯著高于對(duì)照組和FBD 3組(P<0.05)。LAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 9和FBD 6組顯著高于CON組和FBD 3組(P<0.05)。4F2hcmRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 9 組相對(duì)表達(dá)量顯著高于CON和FBD 3組(P<0.05)，但是和FBD 組差異不顯著。SNAT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 9和FBD 6組顯著高于CON組(P<0.05)。

圖2 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬胎盤組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子mRNA表達(dá)水平的影響

如圖3所示，胎盤組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子GLUT1mRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 9組顯著高于CON組和其他處理組(P<0.05)。GLUT3mRNA相對(duì)表達(dá)量在3個(gè)處理組均高于CON組(P<0.05)。GLUT4mRNA相對(duì)表達(dá)量在FBD 6組高于CON組(P<0.05)，但是其他處理組和CON組差異不顯著。

圖3 發(fā)酵豆渣對(duì)母豬胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

仔豬初生重依賴于胎盤。有研究報(bào)道，胎兒的體重與胎盤的重量成正比[6,11]。在本研究中，F(xiàn)BD 9組的仔豬初生窩重平均值較對(duì)照組高了3.8 kg，但是沒(méi)有達(dá)到顯著的水平，隨著母豬日糧中發(fā)酵豆渣含量的提高，仔豬的初生窩重有線性增加的趨勢(shì)(P=0.057)。但是胎盤總重量以及個(gè)體胎盤重的數(shù)據(jù)卻呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。有報(bào)道稱當(dāng)胎盤重量減少時(shí)，機(jī)體存在著補(bǔ)償機(jī)制來(lái)維持胎兒的體重[12]，推測(cè)是這種補(bǔ)償機(jī)制發(fā)揮了作用。胎盤效率是用來(lái)度量每克胎盤產(chǎn)生了多少克的胎兒的單位，是通過(guò)胎兒質(zhì)量與胎盤重量之比來(lái)計(jì)算的[13]。胎盤效率可以通過(guò)改變母體的營(yíng)養(yǎng)攝入量和組成來(lái)改變[14]。發(fā)酵豆渣中含有較高含量的酸溶蛋白和益生菌，利于母豬的消化吸收。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)BD 9組的胎盤效率要顯著高于對(duì)照組，表明FBD 9組的母豬以相同重量的胎盤可以生產(chǎn)更高體重的胎兒。因此推測(cè)通過(guò)在母豬日糧中添加發(fā)酵豆渣，改善母豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而提高胎盤效率。

哺乳動(dòng)物胎盤的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)主要依賴mTOR信號(hào)通路。mTOR信號(hào)通路整合母體各種調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的信號(hào)，包括生長(zhǎng)因子、壓力、能量水平、氧氣和氨基酸[15]。mTOR信號(hào)通路在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的微絨毛膜接收母體信號(hào)，并將信息傳遞至下游以改變基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯，從而導(dǎo)致涉及胎兒生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)發(fā)生改變。在本試驗(yàn)中，母豬日糧添加6%和9%的發(fā)酵豆渣均使mTOR下游相關(guān)基因發(fā)生了顯著的變化，所以我們進(jìn)一步對(duì)母豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)。

胎盤效率高表明胎盤營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸效率較高[16]，葡萄糖和氨基酸是胎兒生長(zhǎng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng)素，每種營(yíng)養(yǎng)素都通過(guò)特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穿過(guò)胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。胎盤表達(dá)超過(guò)15種不同的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，每一種都負(fù)責(zé)攝取不同的氨基酸[17]。其中研究最多的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是系統(tǒng)A和系統(tǒng)L。系統(tǒng)A是依賴鈉的累積轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可以將丙氨酸、絲氨酸和甘氨酸之類的中性小氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。妊娠晚期的胎盤表達(dá)系統(tǒng)A的3種亞型：SNAT1、SNAT2和SNAT4。系統(tǒng)L是用于轉(zhuǎn)運(yùn)大型中性氨基酸的交換器，它將非必須氨基酸交換為帶有分支或大側(cè)鏈的主要必需氨基酸。系統(tǒng)L主要包括以下4種亞型：LAT1、LAT2、LAT3和4F2hc。對(duì)胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)因子mRNA的定量結(jié)果顯示，日糧中添加9%發(fā)酵豆渣，提高了母豬胎盤中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體LAT1、LAT3、4F2hc和SNAT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。表明母豬胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的能力得到了改善。

葡萄糖是胎兒和胎盤生長(zhǎng)所需的主要能量底物。胎兒的糖異生很少[18]，所以胎兒幾乎完全依賴于來(lái)自母體的葡萄糖。胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的豐度隨著胎盤效率的變化而變化。胎盤效率越高，胎盤中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子的表達(dá)量越高，尤其是GLUT1和GLUT3基因的表達(dá)[14]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1和GLUT3是將葡萄糖由母體轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]。而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GLUT4與GLUT3具有95%的同源性[20]。GLUT5是一種果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，它能夠在快速分裂的胚胎中表達(dá)來(lái)加強(qiáng)果糖的吸收以進(jìn)行核酸的合成。在本試驗(yàn)中，母豬日糧中添加9%的發(fā)酵豆渣提高了胎盤GLUT1和GLUT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。表明母豬胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力得到了改善。總的來(lái)說(shuō)，本次試驗(yàn)的結(jié)果表明在妊娠后期母豬日糧中添加發(fā)酵豆渣可以提高胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子的表達(dá)，從而提高胎盤效率。

4 結(jié)論

在妊娠后期母豬日糧中，添加9%發(fā)酵豆渣可以促進(jìn)母豬胎盤組織中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)母體營(yíng)養(yǎng)向胎兒運(yùn)輸，從而提升胎盤效率，最終提高仔豬初生窩重。