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        檢測PCV2抗體水平的兩種ELISA方法對比分析

        2020-08-14 06:23:50王洪利隋兆峰于淼姜平王志遠(yuǎn)
        畜牧與獸醫(yī) 2020年8期
        關(guān)鍵詞:血清檢測

        王洪利,隋兆峰,于淼,姜平,王志遠(yuǎn)

        (1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,山東 濰坊 261061;2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

        豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬,是導(dǎo)致斷仔奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。PMWS主要特征是消瘦、呼吸困難、皮膚及可視黏膜蒼白或黃疸、腹股溝淋巴結(jié)腫大等,該病自1991年在加拿大出現(xiàn)以來,很快波及所有主要養(yǎng)豬國家,嚴(yán)重影響著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。我國在2000年通過血清學(xué)調(diào)査發(fā)現(xiàn),北京、上海、天津、河北、江蘇等地的豬群中存在PCV2感染抗體[2]。

        防控PCV2感染和流行,特定的血清學(xué)檢測必不可少。ELISA方法具有靈敏、快速、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),對實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員要求不高,是適合于大規(guī)模檢測的方法。目前用于PCV2抗體檢測的方法主要是阻斷ELISA法和間接ELISA法。間接ELISA法有兩種,一種是以細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2全病毒作抗原的間接ELISA,另一種是以PCV2重組Cap蛋白作為包被抗原的間接ELISA。因后一種使用的包被抗原表達(dá)產(chǎn)量高,能有效區(qū)分PCV1與PCV2抗體,故得到了更為廣泛的應(yīng)用;阻斷ELISA法是以PCV2的細(xì)胞培養(yǎng)物為抗原,應(yīng)用重組Cap蛋白單克隆競爭試劑,可特異性檢測PCV2抗體,適合大規(guī)模的檢測應(yīng)用[3-4]。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白,且具有型特異性。

        本研究采用的以PCV2重組Cap蛋白作為包被抗原的間接ELISA試劑盒和阻斷ELISA試劑盒,為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室試制,對PCV2人工感染豬和自然感染豬抗體水平進(jìn)行檢測和分析,比較兩種ELISA試劑盒檢測效果,為PCV2感染的流行病學(xué)診斷、疫苗免疫效果評價提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 毒株與佐劑

        PCV2 SH株(106.0TCID50/mL),為上海某豬場分離株,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存與提供。

        1.2 檢測試劑盒

        PCV2阻斷ELISA抗體檢測試劑盒,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室試制(批號為1101);PCV2間接ELISA抗體檢測試劑盒(商品名:豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒),購自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司。

        1.3 試驗(yàn)動物

        1.3.1 PCV2人工感染試驗(yàn)用豬

        30~35 d健康豬15頭,PRRSV和PCV2病毒陰性及其抗體陰性,購自江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司。

        1.3.2 PCV2自然感染豬

        來自浙江某規(guī)模豬場保育豬群。8周齡時部分保育仔豬陸續(xù)發(fā)病,主要癥狀為肌肉無力、呼吸困難、貧血、黃疸、下痢、生長發(fā)育不良。病理剖檢見淋巴結(jié)顯著腫大,切面硬、呈白色;肺臟腫脹,堅(jiān)硬或似橡皮;肝萎縮;脾腫大及大面積梗死;腎腫大,被膜下有壞死灶;結(jié)腸水腫,腸黏膜充血或淤血,胃潰瘍。發(fā)病率為4%,病死率為43%。根據(jù)臨床表現(xiàn),判斷該豬場發(fā)生了PMWS。PCR檢測患病豬血液樣品,證實(shí)了PCV2感染。該場未免疫PCV2疫苗。選擇亞臨床感染豬和發(fā)病豬各20頭。

        1.4 PCV2人工感染試驗(yàn)

        將15頭試驗(yàn)豬隨機(jī)分為3組,每組5頭,分別為對照組、PCV2攻毒組(PCV2)、PCV2攻毒后佐劑刺激組(PCV2+KHL)。PCV2組和PCV2+KHL組每頭豬接種PK15細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2 SH株(106.0TCID50/mL),滴鼻和肌肉注射各2 mL,分別隔離飼養(yǎng);PCV2+KHL組于攻毒后3 d,肌肉多點(diǎn)注射KHL各2 mL;空白對照組接種未感染病毒的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物上清液,滴鼻和肌肉注射各2 mL。

        1.5 待檢血清的采集

        分別于接種后的0、2、4、6、8、10周對人工感染豬前腔靜脈采血10 mL;發(fā)病豬場PMWS亞臨床感染豬和發(fā)病豬,于發(fā)病時(8周齡)前腔靜脈采血10 mL。在血液凝固后,離心分離血清,每份血清樣品分裝于4個滅菌1.5 mL離心管中,每管裝入血清0.5 mL以上,-40 ℃保存。

        1.6 檢測方法

        分別采用阻斷ELISA和間接ELISA對采集的血清樣品進(jìn)行PCV2抗體檢測。

        1.6.1 阻斷ELISA抗體檢測

        按試劑盒說明書進(jìn)行操作。取試劑盒置室溫,待盒內(nèi)試劑恢復(fù)到室溫,取10倍濃縮洗滌液,用蒸餾水稀釋為1倍。用血清稀釋液在稀釋板內(nèi)將待檢血清1∶1稀釋,振蕩混勻。取抗原包被板,每孔加入稀釋好的待檢血清100 μL,置37 ℃孵育2 h。甩掉抗原包被板孔中的溶液,每孔加入200~300 μL洗滌液,靜置1 min,倒掉洗滌液,重復(fù)洗板5次,吸水紙拍干抗原包被板。每孔加入100 μL酶標(biāo)鼠單抗工作液,置37℃孵育30 min,洗滌液洗板5次,方法同上。加TMB底物液,100 μL/孔,室溫或37℃避光顯色10~15 min,至陰性對照顯藍(lán)色,陽性對照基本不顯色時,每孔加終止液50 μL。在酶標(biāo)儀上讀取樣品OD450的光密度值。當(dāng)陰性對照OD450值>0.8、陽性對照OD450值<0.4時,試驗(yàn)條件成立。計(jì)算等電點(diǎn)(PI)值:PI值=(陰性對照OD450均值-待檢樣品OD450值)/陰性對照OD450均值。

        結(jié)果判定:PI值≥38%判為陽性,PI值≤30%判為陰性,30%

        1.6.2 間接ELISA抗體試劑盒檢測

        按試劑盒說明書進(jìn)行操作。待試劑盒內(nèi)的試劑恢復(fù)到室溫,取20倍濃縮洗滌液(血清稀釋液),用蒸餾水稀釋為1倍。用血清稀釋液在稀釋板內(nèi)將待檢血清1∶400稀釋(100 μL樣品稀釋液中加0.25 μL待檢血清),振蕩混勻。取抗原包被板,每孔加入100 μL稀釋好的待檢血清,37 ℃孵育30 min。洗板后每孔加入山羊抗豬IgG酶標(biāo)二抗工作液100 μL,置37 ℃孵育30 min,洗滌液洗板。等體積混合顯色液A液、顯色液B液,混勻,100 μL/孔,室溫避光顯色10 min;每孔加終止液50 μL,在酶標(biāo)儀上讀取樣品OD450的光密度值。計(jì)算S/P值:

        S/P值=(待檢樣本OD450均值-陰性對照OD450均值)/(強(qiáng)陽性對照OD450均值-陰性對照OD450均值)。

        結(jié)果判定:S/P值≥0.25判為陽性,S/P值≤0.16判為陰性,0.16

        2 結(jié)果

        2.1 PCV2人工感染豬血清抗體水平

        由圖1和圖2可見,PCV2攻毒組和PCV2攻毒后佐劑KHL刺激組試驗(yàn)豬,用兩種試劑盒檢測結(jié)果基本一致,PCV2抗體均于接種后2~3周出現(xiàn),6~8周達(dá)到最高,直至第16周仍維持較高水平;PCV2攻毒后佐劑刺激組試驗(yàn)豬產(chǎn)生的抗體水平明顯高于PCV2攻毒組。

        圖2 間接ELISA檢測PCV2人工感染豬抗體

        圖1 阻斷ELISA檢測PCV2人工感染豬抗體

        2.2 PMWS豬群中亞臨床感染豬和發(fā)病豬血清抗體水平

        由圖3和圖4可見,用阻斷ELISA試劑盒和間接ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致,發(fā)病豬抗體陽性率為99%,亞臨床感染豬抗體陽性率為95%,PMWS豬群發(fā)病豬PCV2抗體高于亞臨床感染豬。

        圖3 阻斷ELISA檢測PMWS豬群中亞臨床感染豬與發(fā)病豬PCV2抗體

        圖4 間接ELISA檢測PMWS豬群中亞臨床感染豬與發(fā)病豬PCV2抗體

        3 討論

        目前,用于檢測PCV2抗體的方法主要是間接免疫熒光法(IFA)和ELISA法。ELISA法主要包括阻斷ELISA和間接ELISA。Walker等[4]以PCV2的細(xì)胞培養(yǎng)物為包被抗原,PCV2特異性單克隆抗體作為競爭試劑,首次建立了用于檢測PCV2抗體的阻斷ELISA方法,使用該方法與IFA對豬群的484份血清以及PCV2人工感染豬血清連續(xù)抗體檢測結(jié)果證明,阻斷ELISA的敏感性和特異性都比較高,與IFA僅存在微小差異,但ELISA操作較IFA簡單,更適合于在大規(guī)模場開展監(jiān)測??刂芇CV2感染的最常用和最有效的策略是接種疫苗,通過疫苗接種引發(fā)的抗體主要針對PCV2 Cap蛋白,它是病毒的唯一且高度免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白[5]。間接ELISA由于血清樣品的成分復(fù)雜(例如類風(fēng)濕因子),易和其他動物血清成分的特異性抗體作用而導(dǎo)致假陽性率較高。與間接ELISA相比,應(yīng)用重組Cap蛋白單克隆抗體作為競爭試劑的阻斷ELISA具有明顯的優(yōu)勢,能有效反映豬群感染狀況或疫苗效力[5]。由此分析,本研究使用的阻斷ELISA抗體檢測法可能具有更廣泛的應(yīng)用前景。

        兩種試劑盒對PCV2攻毒后佐劑KHL刺激組試驗(yàn)豬抗體消長規(guī)律的檢測結(jié)果均顯示,PCV2攻毒后,佐劑KHL刺激組試驗(yàn)豬產(chǎn)生的抗體水平明顯高于PCV2攻毒組。KHL是一種具有高度免疫原性的大分子蛋白,已證實(shí)KHL能增強(qiáng)PCV2在豬體內(nèi)的復(fù)制、加重感染豬PMWS的臨床體征[6-7]。由此分析,PCV2攻毒后使用KHL刺激試驗(yàn)豬,可提高PCV2在豬體內(nèi)的復(fù)制,從而提高了抗體產(chǎn)生量。

        PCV2單獨(dú)感染一般只能引起試驗(yàn)豬輕度至中度病變,不易復(fù)制出PMWS的明顯病癥[8-9],往往需要其他致病因子的共同參與才能促使PMWS發(fā)生[8,10]。但PCV2感染量的多少是決定著PMWS發(fā)生的主要原因,PMWS發(fā)生往往需要一定水平PCV2的感染量[11-12]。本次檢測的PMWS發(fā)病豬場,發(fā)病豬陽性率為99%,亞臨床感染豬陽性率為95%,表明在PMWS發(fā)病豬場中,感染發(fā)病豬和亞臨床癥狀豬均感染了PCV2。PMWS豬群發(fā)病豬PCV2抗體高于亞臨床感染豬,推測感染發(fā)病豬的PCV2量高于亞臨床感染豬。個別亞臨床感染豬PCV2抗體較高但未發(fā)生PMWS,可能取決于其他致病因子參與和個體仔豬的免疫力狀況。由此分析,通過ELISA對豬群PCV2抗體監(jiān)測,不僅能有效反映豬群PCV2感染狀況或疫苗效力,也能通過PCV2抗體異常增高結(jié)合發(fā)病豬的臨床表現(xiàn)反映PMWS發(fā)生狀況。

        綜上,本次使用的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒(試制)和間接ELISA抗體試劑盒不僅能有效反映豬群PCV2感染狀況或疫苗效力,也能通過PCV2抗體異常增高并結(jié)合發(fā)病豬的臨床表現(xiàn)及時發(fā)現(xiàn)PMWS的發(fā)生。阻斷ELISA抗體檢測法較間接ELISA法可能具有更廣泛的應(yīng)用前景。

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