李玉燕，李貴陽(yáng)，沈巍，鞏新民,祝永華，張霞,沈霞，王傳堂，張承新，劉曉陽(yáng)，郭龍宗*

(1. 山東益生畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 250000；2. 青島英賽特生物科技有限公司，山東 煙臺(tái) 250000 )

支原體感染是雞群中普遍存在的一種感染，在大型養(yǎng)殖公司的集約化飼養(yǎng)的雞群，支原體感染尤為嚴(yán)重。對(duì)雞群有明顯致病性的支原體主要有二種，即滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae, MS)和雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)[1]。MG是致病性最強(qiáng)、引起經(jīng)濟(jì)損失最大的家禽支原體病原[2]。臨床以胸、腹氣囊炎病變?yōu)橹?，可引起商品代雛雞死淘率增高、料重比增加和蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)減少，且常與其他呼吸道病原混合感染，造成更大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)在 20 世紀(jì)60 年代開(kāi)展對(duì)此病的研究，20 世紀(jì)90年代的調(diào)查顯示，我國(guó)雞群 MG 陽(yáng)性感染率為 50%～80%[3]。該病可垂直和水平傳播，其中種雞的垂直傳播會(huì)給下游企業(yè)帶來(lái)持續(xù)不斷的感染，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，在行業(yè)內(nèi)引起廣泛重視，也是可凈化的一種重要垂直傳播性疾病，該病在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)實(shí)現(xiàn)凈化，而國(guó)內(nèi)該病的感染還十分嚴(yán)重。

控制支原體疾病一般采用活疫苗或活疫苗+滅活苗結(jié)合免疫，應(yīng)用較為廣泛的活疫苗菌株有F株、6/85株、TS-11等，而環(huán)境中支原體感染性強(qiáng)毒株有R株、S株等。TS-11、F株MG疫苗株可在雞的上呼吸道終生攜帶，并會(huì)干擾臨床樣品PCR的檢測(cè)結(jié)果，因此，無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR方法評(píng)估雞群中支原體的控制和凈化狀況。另外，在疫苗的應(yīng)用過(guò)程中其回復(fù)突變導(dǎo)致一定的毒力，基于弱毒活疫苗的有效性及安全性考慮，建立有效鑒別不同MG疫苗株和野毒株的方法十分重要。本研究對(duì)臨床免疫M(jìn)G活疫苗(6/85、TS-11)的雞群，采集咽喉拭子和毛蛋氣囊拭子、氣管、肺等疑似支原體感染樣品進(jìn)行MG的PCR檢測(cè)，建立了MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)與野毒株(S株、R株)的PCR鑒定方法，并對(duì)臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，以期對(duì)MG的防控與凈化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCR引物由青島英賽特生物科技有限公司設(shè)計(jì)與合成，核酸提取試劑盒購(gòu)自青島英賽特生物科技有限公司。PCR反應(yīng)試劑盒、瓊脂糖、TAE均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。 MG TS-11和F疫苗株(批號(hào)為MGS 170911A)作為TS-11陽(yáng)性對(duì)照，購(gòu)自澳大利亞生物資源；MG 6/85疫苗株(批號(hào)為02408208)，購(gòu)自默沙東(中國(guó))有限公司(MSD)，野毒株S6和R株陽(yáng)性對(duì)照由南京天邦生物科技有限公司惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)針對(duì)MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)與野毒株(S6株、R株)的引物，對(duì)臨床免疫M(jìn)G活疫苗TS-11的種雞群(A～I(xiàn)場(chǎng))的后代啄殼死亡的毛蛋氣囊拭子、臨床送檢免疫6/85的雞群(J場(chǎng))的氣管、肺、腹膜等疑似支原體感染樣品采用MG通用引物進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)陽(yáng)性DNA再分別用TS-11、F株、6/85、S6株、R株的特異性引物進(jìn)行鑒別診斷。種雞群TS-11在5周齡進(jìn)行滴眼方式免疫，種雞群6/85疫苗株在7周齡進(jìn)行噴霧方式免疫。對(duì)A場(chǎng)父母代后代死亡啄殼毛蛋持續(xù)存在氣囊炎的種雞群，同時(shí)采集咽喉拭子進(jìn)行MG的檢測(cè)，分析種雞群與后代雞群的MG流行感染狀態(tài)。采集山東益吉達(dá)SPF雞群咽喉拭子作為陰性對(duì)照組。最后對(duì)臨床采集樣品MG的PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 樣品的采集與處理

咽喉拭子樣品的采集：將棉棒插入喉頭口及上顎裂處來(lái)回刮3～5次取咽喉分泌液，將樣品端插入離心管剪下或折斷，放入含有0.8～1.0 mL PBS的離心管中，備用。

氣囊拭子樣品的采集：將滅菌棉簽插入雛雞或毛蛋氣囊內(nèi)側(cè)，來(lái)回刮3～5次，將樣品端插入離心管，棉簽剪下或折斷，放入含有0.8～1.0 mL PBS的離心管中，備用。

分別采集病雞的肺臟、氣管、腹膜，加入2倍滅菌生理鹽水研磨，直至成為勻漿液。將懸液移至離心管中充分搖震后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min。取上清用0.22 μm濾器過(guò)濾，備用。

父母代和祖代雞群支原體病原監(jiān)測(cè)周齡為1、4、11、13、16、21、26、30、34、40、46、52及58周，每舍采集30對(duì)咽喉拭子。

祖代和父母代種雞群開(kāi)產(chǎn)后，在30、32、34、37、40、43、46、49、52、55及58周檢測(cè)20～30枚啄殼死亡毛蛋，觀察氣囊是否渾濁，進(jìn)行氣囊評(píng)估，同時(shí)采集氣囊拭子進(jìn)行MG的PCR檢測(cè)。

毛蛋氣囊拭子DNA提取參照青島英賽特生物科技有限公司開(kāi)發(fā)的咽喉拭子基因組DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明，從咽喉拭子和氣囊棉拭子擠出并離心的上清液提取DNA。

1.4 PCR引物

參照趙杰等[4]篩選出的針對(duì)MG序列的套式PCR引物，作為檢測(cè)MG的通用引物，由青島英賽特生物科技有限公司合成，擴(kuò)增片段為300 bp。MG疫苗株(TS-11、F、6/85)與野毒株(S6、R)的引物由青島英賽特生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列為：MG-TS11-F：GGTAAAAATCAATACAGTGTT-TTTC，MG-TS11-R:TGGACTCATATTTCTTTCTTTTGC；MG-F-F：ATCATTCTAAATGCTTCTCAACG,MG-F-R: TCTAATAGATCCGTTTGAGG；MG-6/85-F:TTTTATCCAGTAGTGGGTGC，MG-6/85-R: TGTGGTCTGAAACCTGCTCTTGGTTG；MG-S6-F: ACTCCTCGTCCATTCATTGCTAT， MG-S6-R: TCCCGATGTAATCGATAATCAAG；MG-R-F: AGGTCATACTTACGCTTGGAAAC，MG-R-R: TCGATAGAGTTAATTGACTATGAAAAG。MG疫苗株TS-11的目的片段為600 bp、MG疫苗株F株的目的片段為347 bp、MG疫苗株6/85的目的片段為500 bp、野毒株S6株的目的片段為310 bp、野毒株R株的目的片段為324 bp。

1.5 目的基因片段的擴(kuò)增

第1對(duì)引物反應(yīng)體系為25 μL。2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL，提取的DNA模板3 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

第2對(duì)引物套式PCR反應(yīng)體系同第1對(duì)引物，模板為第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(3 μL)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)與野毒株(S6株、R株)的引物反應(yīng)體系同MG套式PCR第1對(duì)引物反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束，取7 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外光線下觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群MG-PCR檢測(cè)

7周齡免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群于10周齡送檢5只存在氣囊炎病變的雞只，采集氣管、肺、氣囊拭子、腹膜等樣品進(jìn)行MG的PCR檢測(cè)，MG通用引物套式PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性(見(jiàn)圖1)，該引物已在文獻(xiàn)[1]中驗(yàn)證。MG疫苗株6/85 PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性(見(jiàn)圖2)，MG野毒株S6的PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，R引物的PCR檢測(cè)為陰性(見(jiàn)圖3)。這表明，該雞群在免疫后1個(gè)月左右仍能檢出MG 6/85疫苗株，同時(shí)存在MG野毒株S6的共感染。

M. DNA 2000 Marker；1～5.客戶雞群采集樣品；6. 陰性對(duì)照?qǐng)D1 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群(J場(chǎng))樣品MG套式PCR產(chǎn)物

M. DNA 2000 Marker；+. MG疫苗株6/85；-.陰性對(duì)照；1～5. 客戶雞群采集樣品圖2 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的雞群(J場(chǎng))樣品MG疫苗株6/85引物擴(kuò)增產(chǎn)物

M. DNA 2000 Marker；1-5. 客戶雞群采集樣品圖3 免疫M(jìn)G疫苗株6/85的客戶雞群(J場(chǎng))樣品MG野毒S6和R株引物擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場(chǎng))后代啄殼死亡毛蛋的氣囊拭子的 MG-PCR 檢測(cè)

免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場(chǎng))送檢后代啄殼死亡的毛蛋，采集氣囊拭子進(jìn)行MG的PCR檢測(cè)，通用引物套式PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，MG野毒株S6和R株的PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性(見(jiàn)圖4、圖5)。這表明，該雞群后代同時(shí)存在MG野毒株S6和R株的共感染。

M.DNA 2000 Marker；1-4. 雞群(F場(chǎng))采集后代啄殼死亡毛蛋氣囊拭子樣品圖4 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場(chǎng))啄殼死亡的毛蛋氣囊拭子S6引物擴(kuò)增產(chǎn)物

圖5 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11的雞群(F場(chǎng))啄殼死亡的毛蛋氣囊拭子R引物擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 MG疫苗株F株的MG-PCR檢測(cè)

采用MG疫苗株F株驗(yàn)證檢測(cè)方法針對(duì)F株引物的特異性，結(jié)果顯示MG通用引物套式PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，MG疫苗株F株均為陽(yáng)性，TS-11、6/85、S6、R株均為陰性(見(jiàn)圖6)。這表明，設(shè)計(jì)的F株引物針對(duì)MG疫苗株F株的特異性強(qiáng)。

M. DNA 2000 Marker；1-2. F株疫苗株圖6 F株疫苗株各MG鑒別引物F株、TS-11、6/85、S6、R株 PCR產(chǎn)物電泳

2.4 SPF雞群采集咽喉拭子的MG-PCR 檢測(cè)

采集山東益吉達(dá)SPF雞群132份咽喉拭子進(jìn)行MG的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，MG通用引物套式PCR檢測(cè)均為陰性，MG疫苗株F株、TS-11、6/85，野毒株S6、R株均為陰性。表明該MG鑒別引物特異性強(qiáng)。

2.5 免疫M(jìn)G疫苗株TS-11父母代種雞群(A～H場(chǎng))和祖代種雞群(I場(chǎng))后代啄殼的毛蛋氣囊拭子的MG-PCR檢測(cè)

祖代種雞群(I場(chǎng))后代啄殼的447份毛蛋氣囊均無(wú)渾濁，氣囊拭子進(jìn)行MG-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，通用引物套式PCR檢測(cè)均為陰性，MG疫苗株F株、TS-11、6/85，野毒株S6、R株均為陰性(見(jiàn)表1、表2)。同時(shí)祖代種雞群(I場(chǎng))咽喉拭子的MG檢測(cè)也均為陰性。對(duì)A～H場(chǎng)父母代種雞群啄殼的毛蛋渾濁氣囊拭子，進(jìn)行MG-PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

MG-套式PCR通用引物檢測(cè)均為陽(yáng)性；A場(chǎng)和D場(chǎng)渾濁氣囊拭子中野毒S6的PCR陽(yáng)性率均為100%；B場(chǎng)父母代渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽(yáng)性率均為80%，S6 株P(guān)CR可疑率20%；C場(chǎng)父母代渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽(yáng)性率分別為25%、75%，S6 株P(guān)CR可疑率75%；E場(chǎng)父母代渾濁氣囊拭子中只檢出TS-11，其余均為陰性；F場(chǎng)和H場(chǎng)渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽(yáng)性率均為100%；G場(chǎng)渾濁氣囊拭子中野毒S6和R株的PCR陽(yáng)性率均為100%。不同父母代雞群后代啄殼的毛蛋渾濁氣囊陽(yáng)性率有差別，H場(chǎng)父母代陽(yáng)性率最低，為1.13%；F場(chǎng)父母代的陽(yáng)性率最高，達(dá)16.89%(見(jiàn)表1)。

表1 父母代種雞和祖代種雞群后代啄殼毛蛋渾濁氣囊陽(yáng)性率

2.6 A場(chǎng)父母代種雞群咽喉拭子和后代啄殼的毛蛋氣囊拭子MG-PCR檢測(cè)

A場(chǎng)父母代種雞群后代啄殼的毛蛋氣囊從50周齡開(kāi)始出現(xiàn)病變，后期一直持續(xù)存在(見(jiàn)表3)。采集的渾濁氣囊拭子經(jīng)MG鑒別引物PCR檢測(cè)，可同時(shí)檢出野毒S6(見(jiàn)表2)。同時(shí)對(duì)A場(chǎng)父母代種雞群采集咽喉拭子，經(jīng)MG鑒別引物PCR檢測(cè)，也可檢出野毒S6。表明種雞群感染MG，可垂直傳播給后代。

表3 A場(chǎng)父母代各周齡后代啄殼毛蛋氣囊評(píng)估檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

在規(guī)模化養(yǎng)殖的雞群中，支原體感染是非常普遍的現(xiàn)象，特別是對(duì)雞致病性高的MG在雞群內(nèi)很容易通過(guò)呼吸道造成橫向傳播。此外，MG還能通過(guò)雞胚從種雞垂直傳播給后代，給下一代造成顯著放大的感染率[1]。目前控制MG的措施包括種群凈化、疫苗接種和藥物治療[3]。發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)良好的生物安全措施，已經(jīng)凈化和控制了MG。山東益生種畜禽股份有限公司首次引進(jìn)的哈伯德(HBD)曾祖代通過(guò)疫苗免疫和嚴(yán)格的生物安全措施，進(jìn)行一個(gè)完整的飼養(yǎng)周期的持續(xù)觀察和檢測(cè)，真正實(shí)現(xiàn)了無(wú)MG和MS感染。這表明，在我國(guó)是完全可以通過(guò)生物安全來(lái)有效控制MG。通過(guò)抗體和病原體檢測(cè)證明，該公司可作為我國(guó)大型種雞場(chǎng)實(shí)現(xiàn)無(wú)MG和MS感染的成功示范[1]。本公司已經(jīng)把曾祖代雞群的成果示范的經(jīng)驗(yàn)推廣向了祖代，通過(guò)對(duì)I場(chǎng)祖代雞群的MG持續(xù)跟蹤檢測(cè)，在采集的種雞群的咽喉拭子和后代啄殼的毛蛋氣囊拭子樣品中，PCR均未檢測(cè)到MG病原。

MG的活疫苗研究始于20世紀(jì)70年代，目前應(yīng)用的MG的活疫苗毒株包括TS-11、6/85和F株等，國(guó)內(nèi)使用的活疫苗為MG康涅狄克F株疫苗，我國(guó)也有MG活苗F36株。F株是應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)和最廣泛的疫苗，能明顯提高患病雞的產(chǎn)蛋量。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)其具有引發(fā)感染的潛在威脅，F(xiàn)株免疫沒(méi)有取代其他毒株反而感染了未接種雞群，并可經(jīng)蛋傳播給子代雞[5]。MG 疫苗株TS-11是由澳大利亞田間分離株80083株經(jīng)化學(xué)誘變和溫度敏感(33 ℃)篩選方式研制的疫苗，具有毒性小、不易傳播的特點(diǎn)。對(duì)49日齡雞的疫苗安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)TS-11菌株在體重、病變和臨床表現(xiàn)方面均具有良好安全性[6]。MG 6/85 株是由美國(guó)研發(fā)的疫苗，主要用于預(yù)防蛋雞產(chǎn)蛋下降，對(duì)產(chǎn)蛋率、蛋重和蛋殼強(qiáng)度影響不大，是目前比較安全的活疫苗[7]。目前我國(guó)市售活疫苗菌株主要是F36株，TS-11和6/85弱毒制作的疫苗比F株毒力更弱，對(duì)雞和火雞均無(wú)毒力，疫苗對(duì)未受MG感染的雞有較好的免疫效果，也可用于火雞的免疫接種[8]。因此，近年來(lái)TS-11株和MG 6/85株更多的被作為商品化弱毒苗用于雞和火雞。試驗(yàn)證明，用 TS-11、6/85 兩種疫苗接種的雞群，主要是細(xì)胞免疫起重要作用，雖然也能產(chǎn)生保護(hù)作用，但血清中檢測(cè)不到抗體，不易判斷免疫效果[3]。另外，TS-11、F株疫苗株可在雞的上呼吸道終生攜帶，常規(guī)方法不易區(qū)分。

本研究建立的方法可有效區(qū)分MG疫苗毒(TS-11、6/85、F株)和野毒(S6、R株)，通過(guò)采集SPF雞群進(jìn)行MG鑒別引物的PCR結(jié)果顯示，該鑒別引物特異性強(qiáng)，不存在假陽(yáng)性的弊端。MG 6/85疫苗株一般在呼吸道中存在一個(gè)月左右，本研究對(duì)7周齡免疫6/85的雞群，在10周齡采集氣囊炎病變的樣品進(jìn)行MG鑒別引物的PCR結(jié)果顯示，MG 6/85疫苗株檢測(cè)均為陽(yáng)性，但該雞群也同時(shí)存在S6的野毒感染。通過(guò)采集免疫TS-11疫苗株(A～H場(chǎng))雞群后代啄殼的毛蛋進(jìn)行觀察，氣囊渾濁毛蛋的陽(yáng)性率存在極大的差別，H場(chǎng)父母代陽(yáng)性率最低，為1.13%，而F場(chǎng)父母代的MG陽(yáng)性率高達(dá)16.89%。在相同的免疫程序下，這種差別與每個(gè)場(chǎng)區(qū)的生物安全管理緊密相關(guān)。郭龍宗等[1]論述了生物安全對(duì)凈化MS和MG支原體的重要性，這一點(diǎn)在飼養(yǎng)規(guī)模較大的父母代場(chǎng)區(qū)中的作用尤為重要。同時(shí)采集免疫TS-11疫苗株雞群的后代啄殼毛蛋氣囊拭子進(jìn)行MG鑒別PCR 的檢測(cè)，結(jié)果顯示：渾濁氣囊拭子中野毒株S6和R株的陽(yáng)性率的比例較高，部分場(chǎng)區(qū)可同時(shí)檢出這兩種野毒。通過(guò)對(duì)A場(chǎng)父母代種雞群采集咽喉拭子和后代啄殼毛蛋氣囊拭子進(jìn)行MG鑒別引物PCR檢測(cè)，結(jié)果表明種雞群MG的感染，可通過(guò)垂直傳播感染其后代。

綜上，本試驗(yàn)建立的MG疫苗株和野毒株的PCR鑒別方法，可快速鑒別出臨床樣品的MG 疫苗株和野毒株，盡早發(fā)現(xiàn)MG野毒感染雞群，對(duì)MG 發(fā)病雞群盡快采取防治措施，最終為凈化MG 提供實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。