謝曉東，李濤，袁海文，文明,3，周碧君,2，楊美,3，程振濤,3*

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008；3. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025 )

牛支原體(Mycoplasmabovis)是引起牛支原體肺炎的主要病原，M.bovis感染除引起牛支原體肺炎外，還會引起耳炎、結膜角膜炎、關節(jié)炎、生殖道炎癥、乳腺炎、流產等癥狀，嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[1]。牛支原體黏附素主要以膜蛋白形式存在于細胞表面，對牛支原體的致病性起重要作用。而在牛支原體膜表面蛋白眾多研究熱點當中，Vsp蛋白因為其抗原表位和大小都具有高頻的變異性而研究資料較多[2-3]。Vsp 蛋白家族是一組與牛支原體黏附性密切相關的膜脂質蛋白，它能夠協助牛支原體黏附在宿主細胞上，從而產生相關的致病性。此外，牛支原體還有pMB67、P26抗原、28 kD蛋白等其他黏附相關蛋白[4]。牛支原體膜表面蛋白的研究對揭示該病原致病與免疫機理有重要意義[5]，p81蛋白為牛支原體的表面膜蛋白，研究資料認為其也是一種特異性抗原蛋白，p81蛋白有高度的保守性且種間差異較大[7]，如牛支原體PG45株的p81蛋白與無乳支原體的p81蛋白的同源性只有64%。2009年，我國學者李媛等[6]選用p81基因設計引物，建立了牛支原體雙重PCR方法。此方法特異性強、靈敏度高，因而牛支原體p81基因可以作為靶向基因用來診斷牛支原體。本文通過對牛支原體貴州株p81基因的克隆，測序及生物信息學分析，獲取牛支原體貴州株p81基因分子特征，為基于p81蛋白致病性、免疫防控和診斷研究提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 菌株

M.bovisGZ01、M.bovisGZ02由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室分離并保存；M.bovis標準株PG45(ATCC25533)購自美國典型菌種保藏中心。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購自Biomiga公司，2×Taq PCR Master Mix、200 bpDNA Maker購自北京天根生化科技有限公司，pMD-19T載體購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒均購自Omega公司，DNA限制性內切酶購自Thermo公司。

1.3 目的基因擴增

根據NCBI公布牛支原體基因序列設計一對引物，上游引物p81-p1：5′-TTATTTAAGAATTTGACTTGAT-3′；下游引物p81-p2：5′-GAAAAATAAATTAATGATTGGGCTT-3′，預擴增片段長2 187 bp，由大連寶生物工程有限公司合成。提取2株牛支原體貴州分離株和牛支原體標準株PG45基因組，應用引物p81-p1/ p81-p2對目的基因進行擴增。

1.4 p81基因克隆及序列分析

將PCR擴增的目的基因膠回收與純化，純化的基因與pMD-19T載體連接轉化入宿主菌，對重組載體進行PCR及酶切鑒定。陽性重組質粒由英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。采用DNAStar 7.1和Mega 5.0軟件對牛支原體貴州株p81基因進行氨基酸推導及進化關系分析。

1.5 p81基因生物信息學分析

采用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/compute PI/MW)和Protparam(http://web.expasy.org/protparam)分析預測編碼蛋白質的性質及氨基酸組成；采用在線軟件Protscale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/)分析蛋白疏水性與親水性；采用在線軟件SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services.SingnalP)和TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白信號肽以及預測蛋白質跨膜結構；采用在線軟件NetNGlyc 1.0、NetPhos 2.0和NetPhosk 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預測蛋白潛在N糖基化位點、潛在磷酸化位點以及保守的特異性蛋白激酶作用位點；采用在線軟件PHD sec(http://www.predictprotein.org/)和(Immune Epitope Database,IEDB)(http://www.iedb.org/)預測蛋白質的二級結構和三級結構；利用DNAStar 7.1提供的蛋白質氨基酸序列抗原表位在線預測工具，進行B細胞抗原表位預測和分析。

2 結果與分析

2.1 p81基因PCR 擴增

以提取的牛支原體培養(yǎng)物DNA為模板，PCR擴增獲得牛支原體貴州株p81基因，PCR產物電泳結果見圖1。PCR擴增獲得大小約為2 187 bp目的條帶(圖1)，與預期擴增片段相符。

M.DL 2000 Marker；1、2. 牛支原體GZ01；3、4. 牛支原體GZ02；5、6. 牛支原體PG45；7.空白對照圖1 p81基因片段PCR擴增結果

2.2 p81基因PCR 克隆及序列分析

2.2.1 陽性重組質粒篩選

牛支原體GZ01、牛支原體GZ02 p81目的基因經膠回收純化、連接轉化至感受態(tài)細胞，提取重組質粒后進行質粒PCR鑒定(圖2)，可見從重組質粒中擴增獲得約為2 187 bp的目的條帶，與目的基因大小一致。

M.DL 2000 Marker；1、2、3. 牛支原體GZ01 p81基因重組質粒；4、5、6. 牛支原體GZ02 p81基因重組質粒；7.陰性對照圖2 陽性重組質粒PCR鑒定

2.2.2 陽性重組質粒雙酶切鑒定

提取重組質粒，用限制性內切酶KpnⅠ和SalⅠ對重組質粒進行雙酶切鑒定，酶切產物電泳電泳結果見圖3。重組質粒雙酶切可見約2 187 bp的目的基因條帶和2 962 bp的載體條帶，結果證實，目的基因克隆成功。

M.DL 2000 Marker；1. 牛支原體GZ01 p81基因重組質粒；2. 牛支原體GZ02 p81基因重組質粒；2、4.陰性對照圖3 陽性重組質粒雙酶切鑒定

2.2.3p81基因推到氨基酸序列分析

經PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質粒進行測序，對氨基酸序列進行推導分析。由圖4可見，p81基因序列編碼728個氨基酸，推導氨基酸55 位、230 位、485 位、558位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但對于牛支原體p81基因為色氨酸，如進行蛋白表達需進行位點突變。將2株M.bovis貴州株氨基酸序列與參考株PG45氨基酸序列進行比較顯示, 2株分離自貴州省不地區(qū)的M.bovis貴州株氨基酸序列完全相同，但與PG45株p81蛋白氨基酸序列發(fā)生110位點突變。此結果表明，貴州省內M.bovis菌株p81蛋白保守，但相較于標準株PG45株已出現明顯進化。

圖4 牛支原體貴州株p81基因推導的氨基酸序列

2.3 p81蛋白理化性質的分析

應用ExPASy(Compute PI/MW)、Protparam在線分析軟件預測編碼蛋白質的理化性質及氨基酸組成。p81蛋白分子質量為 81.629 6 kD，分子結構式為C3643H5795N963O1133S13。理論等電點為9.15。其氨基酸組成中Lys(K)最多，占13.5%，含有1個Cys(C)(0.1%)，堿性氨基酸有3種(Arg、His、Lys)，共121個，占16.6%；推測p81為堿性蛋白。該蛋白溶液中不穩(wěn)定指數為29.15，低于閾值40，在溶液中性質穩(wěn)定。這些指數提示p81蛋白應具有較好的抗原性。

2.4 p81蛋白疏水性及親水性的預測與分析

應用Protscale在線預測牛支原體貴州流行株p81氨基酸序列的親疏水性，結果見圖5。

圖5 p81基因親疏水性分析

圖中縱坐標大于0的為疏水區(qū)，得分越高疏水性越強；反之，則為親水區(qū)。p81基因編碼的蛋白多肽鏈第18位具有最高分，為2.156(疏水性最強)，在616位具有最低分，為-3.178(親水性最強)。Scale分析得知，整個多肽鏈表現為親水性，較好的親水性也預示著較高的可溶性。

2.5 p81蛋白信號肽及跨膜區(qū)預測

應用在線軟件SignalP 4.0和TMHMM 2.0分析此蛋白信號肽以及預測蛋白跨膜結構，結果見圖6。牛支原體貴州株p81基因所編碼氨基酸在24～25間具有分泌信號肽的特征，因此表達時建議該蛋白基因進行修飾。由圖7可知，該蛋白不具有明顯的跨膜螺旋結構，有利于提升p81基因表達效果。

圖6 p81信號肽分析

圖7 p81跨膜區(qū)分析

2.6 p81蛋白修飾結構的預測

應用在線軟件采用在線軟件NetNGlyc1.0、NetPhos 2.0和NetPhosk1.0 預測蛋白潛在N糖基化位點、潛在磷酸化位點以及保守的特異性蛋白激酶作用位點。由圖8可知，p81蛋白在第167，314，328，493和559個氨基酸處共存在5個N糖基化位點；p81蛋白有59個絲氨酸、29個蘇氨酸及11個酪氨酸可能被磷酸化。上述磷酸化位點所對應的磷酸激酶預測結果顯示，在p81蛋白上可能有PKC，UNSP，PKA，CKⅠ，DNAPK，RSK，INSR，CKⅡ，PKG，SRC，cdc2，ATM，EGFR共13種保守的特異性蛋白激酶的結合位點，其中在451處unsp得分最高為0.997。這些分析結果提示p81蛋白與牛支原體致病性存在相關關系。

圖8 p81蛋白修飾結構預測

2.7 p81蛋白二級結構及三級結構預測

應用在線軟件PHD sec和SWISSMODEL預測蛋白質的二級結構和三級結構。結果顯示，Sec預測組p81蛋白多肽鏈二級結構的3種類型分別是α-螺旋(H)、β-折疊(S)和無規(guī)則卷曲(L)，比率分別為27.61%、11.40%和60.99%，以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊較少。利用SWISS-MODEL預測p81基因編碼蛋白的三級結構，結果如圖9所示，與二級結構預測結果相似。

圖9 p81蛋白三級結構模型

2.8 p81蛋白B細胞抗原表位分析

采用Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Jamson-Wolf以及Emini方法，分別對p81蛋白的表面可及性、抗原指數、親水性、柔韌性進行預測。由圖10可見，該蛋白存在豐富的親水性區(qū)域，主要集中在27～168、312～546、645～716。p81蛋白有多個表面可及性程度高的肽段，分別是31～142、557～628。其他部分表面可及性較小，但均為正值。骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，且分布相對均勻。該蛋白整體抗原指數較高，120～168、428～484較大，其中25～169、196～292、426～628區(qū)域抗原優(yōu)勢明顯，上述區(qū)域可作為蛋白表達選擇的目標區(qū)域。

圖10 p81蛋白B細胞抗原表位預測結果

3 討論

牛支原體感染可造成養(yǎng)牛業(yè)巨大的經濟損失，且其感染已呈現世界性分布[8]，因此國內外均加強了牛支原體地方流行株的研究。牛支原體感染的主要癥狀為咳嗽、呼吸困難，從開始流清亮鼻液到后期轉為黏性或者膿性鼻液，剖檢可見胸腔積液、與肺部發(fā)生粘連、肺臟質地變硬并出現壞死灶[9-10]。目前對牛支原體診斷較為困難，常用方法主要為牛支原體病原分離鑒定和基因檢測[11-12]。但在病原分離培養(yǎng)時，由于牛支原體對營養(yǎng)需求較高，耗時長，臨床分離易受其他微生物污染，因此不能作為臨床快速診斷手段[13]；而針對牛支原體基因和血清抗體檢測，因其高通量、高靈敏性和快速高效特性，常被應用于臨床診斷技術，但此方法以特異性基因和抗原蛋白的選擇為基礎。因此，開展牛支原體相關功能蛋白基因的生物信息學分析，是有效選擇靶標蛋白的手段，也是構建亞單位疫苗或基因工程疫苗的必備步驟。吳燕等[14]通過對綿羊支原體肺炎p113基因生物信息學分析，發(fā)現p113蛋白可能是潛在信號通路分子，也是一種良好的抗原結構蛋白；對豬支原體A1基因編碼蛋白進行預測分析，發(fā)現該蛋白存在跨膜區(qū)域，具有良好抗原性[15]。因此，本研究選擇牛支原體p81基因，開展目的基因的序列分析，推導分析氨基酸的特性，為基于牛支原體p81基因的表達、亞單位疫苗構建、診斷試劑和致病性研究提供可行性分析資料。

牛支原體不具有細胞壁，其細胞膜由脂質雙分子層和膜蛋白組成，牛支原體主要通過支原體細胞膜成分發(fā)揮致病作用，包括支原體黏附、增殖、入侵宿主細胞、免疫應答等[16-18]。目前的研究資料認為，p81應為牛支原體膜蛋白[19]，具有開展診斷試劑、基因工程疫苗、亞單位疫苗研究的可能性。本文通過對牛支原體貴州株p81基因擴增，并分別進行推導氨基酸編碼蛋白的理化性質、跨膜結構、預測二級與三級結構以及B細胞抗原表位分析，結果均提示，p81蛋白具有作為抗原蛋白的優(yōu)勢。本研究還發(fā)現，55位、230位、485位、558位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但牛支原體p81基因為色氨酸，如進行蛋白表達需進行位點突變；高黎萍[20]在進行p25、p33蛋白表達時，為使基因能在在大腸桿菌中進行正確表達而將TGA突變?yōu)榫幋a色氨酸的TGG，最終成功或獲得p25、p33目的蛋白。針對抗原蛋白的體外表達，需要考慮表達量、表達蛋白區(qū)段抗原指數、信號肽區(qū)域、跨膜結構區(qū)域等因素選擇合適的表達區(qū)段。本文對M.bovisp81蛋白的B細胞抗原表位、信號肽區(qū)域、跨膜結構區(qū)域分析顯示，p81蛋白在24～25位氨基酸區(qū)域存在信號肽，不存在跨膜結構，其中25～169、196～292、426～628區(qū)域抗原優(yōu)勢明顯，綜上分析，認為對p81蛋白表達如選擇N端區(qū)域，需考慮去除信號肽，并對可能存在TGA進行突變。而如選擇包含426～628的C端進行表達，則需對存在的TGA進行突變。