張志超，黃 勇，徐可成，宋 紅，楊俊譽(yù)，張 彧，黃 瓊，3，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部生物多樣性與病蟲害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201； 2.云南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，云南 昆明 650034； 3.云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測木質(zhì)部寄生屬信號肽

張志超1，黃 勇2，徐可成1，宋 紅1，楊俊譽(yù)1，張 彧1，黃 瓊1，3，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部生物多樣性與病蟲害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201； 2.云南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，云南 昆明 650034； 3.云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

利用已經(jīng)公布的木質(zhì)部寄生屬(Xylellafastidiosa)2 766個(gè)基因組數(shù)據(jù)信息，運(yùn)用在線計(jì)算機(jī)預(yù)測軟件，分析了木質(zhì)部寄生屬(Xylellafastidiosa)的分泌蛋白組。運(yùn)用SignalP version 2.0 預(yù)測得到204個(gè)開放閱讀框架具有編碼蛋白質(zhì)的N-端信號肽；運(yùn)用TMHMM、GPI-anchored預(yù)測具有非跨膜蛋白(或者在N-端信號肽只有1個(gè)跨膜區(qū))，不具有錨定位點(diǎn)的173個(gè)，運(yùn)用TargetP預(yù)測除去分泌到線粒體以及位置不確定的分泌蛋白，最終得到X.fastidiosa的分泌蛋白為149個(gè)。分泌類信號肽(Sec-type)114個(gè)和具雙精氨酸結(jié)構(gòu)的信號肽(RR-motif)32個(gè)，分別占分泌蛋白的76.5%和21.5%，脂蛋白信號肽3個(gè)，僅占2%，沒有預(yù)測到類前菌毛信號肽和細(xì)菌素及外激素信號肽。

木質(zhì)部寄生屬；分泌蛋白；信號肽

木質(zhì)部寄生屬(Xylella)菌體短桿狀，單生，大小為(0.25～0.35)μm ×(0.90～3.50)μm，細(xì)胞壁波紋狀，無鞭毛，不能運(yùn)動。革蘭氏染色反應(yīng)陰性，好氣性，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性。對營養(yǎng)要求十分苛刻，要求有生長因子。營養(yǎng)瓊脂上菌落有兩種類型：一種是枕狀凸起，半透明，邊緣整齊；另一種是臍狀，表面粗糙，邊緣波紋狀。DNA中G+C含量為 49.5%～53.1%。

寄生木質(zhì)部的類立克次體(rickettsia-like organism，RLO)或木質(zhì)部難養(yǎng)菌 (xylem limited bacterium，XLB)可引起葡萄皮爾氏病(PD)，也易導(dǎo)致梅、榆樹、槭樹、櫪屬、懸鈴木、桑樹、咖啡、苜蓿、柑橘、桃等感染病害[1-2]，近年來該菌已獲得純培養(yǎng)并接種成功，鑒定為木質(zhì)部寄生屬(X.fastidiosa)。該菌由葉蟬類昆蟲傳播，侵染木質(zhì)部后在導(dǎo)管中生存、蔓延，使全株表現(xiàn)葉片邊緣焦枯、葉灼、早落、枯死，生長緩慢、生長勢弱、結(jié)果減少和變小、植株萎蔫等癥狀，最終導(dǎo)致全株死亡。侵染這些植物的X.fastidiosa都屬于同一個(gè)種，但在寄主范圍和致病性上有差異，RFLPs、DNA (RAPD)-PCR、RFLP和DNA-DNA雜交研究顯示，PD菌株與侵染桃、梅以及小長春花三種植物的菌株有明顯差異[3]。用RAPD-PCR及16S-23S rDNA分析可將X.fastidiosa分為葡萄、桑樹、榆樹、懸鈴木、柑橘5個(gè)親緣關(guān)系相近的遺傳類群[4-5]。在原有研究基礎(chǔ)上，本文利用已公布的葡萄皮爾氏病的全基因組序列分析預(yù)測信號肽的比例和類型[6]，運(yùn)用在線計(jì)算機(jī)預(yù)測軟件，分析木質(zhì)部寄生屬X.fastidiosa的分泌蛋白組。

1 材料與方法

木質(zhì)部寄生屬2 766個(gè)基因序列來源于Superfamily(http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY/cgi-bin/gen_list.cgi？genome=xf)。我們將N-端信號肽，無跨膜區(qū)，無GPI-錨定位點(diǎn)，位于線粒體或其他細(xì)胞器的蛋白質(zhì)無分泌信號的歸為水溶性分泌蛋白，滿足以上條件者作為計(jì)算機(jī)預(yù)測的分泌蛋白。

我們應(yīng)用Internet上SignalPv2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)確定N-端信號肽，TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM)預(yù)測跨膜區(qū)，TargetP v1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) 預(yù)測GPI-錨定位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

木質(zhì)部寄生屬的2 766個(gè)基因，蛋白長度范圍為30～3 455個(gè)氨基酸。采用SignalP 2.0對2 766個(gè)蛋白序列進(jìn)行信號肽預(yù)測，用SignalP的Smean和Cmax判定能分泌的蛋白質(zhì)的有效性[7]。用SignalP確定N-端信號肽204個(gè)，Smean和Cmax均大于0.5；TMHMM分析整個(gè)基因組發(fā)現(xiàn)，2 207個(gè)蛋白序列無跨膜區(qū)，356個(gè)蛋白序列有1個(gè)跨膜區(qū)，83個(gè)蛋白序列有2個(gè)跨膜區(qū)，120個(gè)蛋白序列有2個(gè)以上的跨膜區(qū)。TargetP分析結(jié)果表明，S型分泌途徑為640個(gè)，486個(gè)分泌到線粒體，1 640個(gè)分泌位置不確定。對SignalP確定的204個(gè)N-端信號肽分析發(fā)現(xiàn)，其中31個(gè)信號肽具有2個(gè)和2個(gè)以上的跨膜區(qū)，105個(gè)信號肽沒有跨膜區(qū)，68個(gè)信號肽具有1個(gè)跨膜區(qū)，且跨膜區(qū)位于N-端55個(gè)氨基酸的前40個(gè)氨基酸的位置，因此，173個(gè)信號肽具有潛在的分泌蛋白。由于原核生物細(xì)胞通常分泌蛋白進(jìn)入細(xì)胞器，較少分泌到胞外，采用TargetP分析這173個(gè)分泌蛋白，除去分泌到線粒體的13個(gè)分泌蛋白和分泌位置不確定的6個(gè)分泌蛋白，S型分泌途徑為154個(gè)。對154個(gè)S型分泌途徑的蛋白進(jìn)行GPI-錨定位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)具有GPI-錨定位點(diǎn)，因此保留沒有GPI-錨定位點(diǎn)的154個(gè)分泌蛋白，并對其中5個(gè)無法歸類的可疑分泌蛋白，進(jìn)行PSORT II Prediction(http://psort.nibb.ac.jp/form2.htmlPSORT II Prediction (experimental)Lastupdate:November24， 1999)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不具有N-端信號肽，最終預(yù)測到149個(gè)N-端信號肽。占全基因組總量的6%。預(yù)測信號肽的步驟如圖1。

2.1 信號肽長度及氨基酸組成

對149個(gè)分泌蛋白的信號肽長度及組成信號肽的氨基酸種類進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2和圖3。信號肽長度分布范圍為18～50個(gè)氨基酸，主要集中分布于長度為19～26個(gè)氨基酸，約占全部信號肽的66%。其中，信號肽長度出現(xiàn)頻率最高的為20、22、23、24和26個(gè)氨基酸，均為9%。

圖1 木質(zhì)部寄生屬信號肽預(yù)測分析流程Fig.1 Flowchart of strategy used to predict X. fastidiosa

組成信號肽的氨基酸種類統(tǒng)計(jì)分析表明，組成信號肽的氨基酸中非極性氨基酸占45%，極性氨基酸占15%，酸性氨基酸占31%，堿性氨基酸占8%，最多的4種氨基酸依次為亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、纈氨酸(T)和絲氨酸(S)，分別占氨基酸總量的19%、14%、 8%和8%。而天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)的含量極少，組成信號肽的氨基酸總量為3 752個(gè)，而天冬氨酸、谷氨酸則分別為11和12個(gè)。

2.2 信號肽的種類

依據(jù)信號肽酶的識別序列，氨基末端信號肽分為4種類型：第一類為分泌型信號肽(I型)，包括分泌類信號肽(Sec-type)和雙精氨酸-基序(RR-motif)信號肽。分泌類信號肽(Sec-type)：N-區(qū)平均含有1～2個(gè)正電荷的賴氨酸(K)或精氨酸(R)，H-domain由平均19aa構(gòu)成，C-區(qū)含有SPasesⅠ酶剪切位點(diǎn)，即從-3位到-1位，一般序列為A-X-A，其中X代表任意氨基酸，具有Sec-信號肽的分泌蛋白；雙精氨酸-基序(RR-motif)信號肽：信號肽中含有RR×##(##指疏水氨基酸)的保守序列，通過Tat途徑運(yùn)送。第二類為脂蛋白信號肽(Ⅱ型)：通常比分泌型信號肽短，切割位點(diǎn)后一個(gè)氨基酸為C，這樣就形成保守的L-(A/S)-(A/G)-C的lipobox。第三類是由類似前菌毛蛋白(Prepilin-like)(Ⅳ型)的信號肽組成，能被前菌毛蛋白專化的信號肽酶ComC剪切。第四類信號肽是在核糖體合成細(xì)菌素和外激素中發(fā)現(xiàn)，合成的細(xì)菌素和外激素是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送[8]，這類信號肽缺乏疏水的H-區(qū)。

圖2 木質(zhì)部寄生屬信號肽的長度與分布Fig.2 Length distribution of predicted signal peptide in X. fastidiosa

圖3 木質(zhì)部寄生屬信號肽的氨基酸的組成Fig.3 Frequencies of amino acid in signal peptide of X. fastidiosa

根據(jù)信號肽的分類方法，對149個(gè)分泌蛋白的信號肽進(jìn)行了分類。其中146個(gè)分泌蛋白信號肽的N-區(qū)平均含有1～2個(gè)正電荷的賴氨酸(K)或精氨酸(R)，其中含一個(gè)正電荷氨基酸K或R的分泌蛋白信號肽為114個(gè)，占76.5%，具雙精氨酸結(jié)構(gòu)的信號肽為32個(gè)，占21.5%。因此，分泌型信號肽的比例很大，約98%的信號肽為分泌型信號肽，其余3個(gè)為脂蛋白信號肽，僅為2%。沒有發(fā)現(xiàn)Prepilin-like信號肽和細(xì)菌素和外激素信號肽。根據(jù)Xylellafastidiosa9a5c 基因注釋，預(yù)測的149個(gè)信號肽中超過50%的功能未知，表1僅列出功能已知的信號肽。

表1 木質(zhì)部寄生屬基因組中預(yù)測的功能已知的信號肽

Table 1 List of predictedXylellafastidiosasignal peptides of known function

名稱Name蛋白長度LengthofProtein切割位點(diǎn)PositionofCleavageS值SmeanC最大值Cmax跨膜區(qū)TM分泌途徑TP描述Descriptiongi_15838025262200.9480.9950SChitinasegi_15837586603210.6370.8390SGamma-glutamyltranspeptidasegi_15837442612230.710.9991SBeta-galactosidasegi_15838324362230.8180.9550SSugar-phosphatedehydrogenasegi_15836620795240.94710SDipeptidyl-peptidasegi_15837178700250.9060.5270SMetallopeptidasegi_15837447882270.7550.5560SFamily3glycosidehydrolasegi_15837055287270.530.6621SIntegralmembraneproteinasegi_15838421727270.8850.9670STail-specificproteasegi_158384491000270.9580.6591SSerineproteasegi_15837383597240.8960.9590SLipase/esterasegi_15837151702260.7080.6780SMethionyl-tRNAsynthetasegi_15837246230200.81510SPeptidyl-prolylcis-transisomerasegi_15837440464260.7470.9381SPeptidyl-prolylcis-transisomerasegi_15837420592260.9060.9020SEndo-1,4-beta-glucanasegi_15837689652260.8570.9680SCardiolipinsynthasegi_15838205194280.9020.9851SABCtransportervitaminB12uptakepermeasegi_15838222455290.7110.7920SBeta-lactamasegi_15839297356340.8640.9970SEndo-1,4-beta-glucanasegi_15839266721300.6350.9981SL-ascorbateoxidasegi_15838432154190.9110.9110SDisulphideisomerasegi_15838341405310.8820.9991SGlucosedehydrogenaseBgi_15838342294310.7040.9910SDaunorubicinC-13ketoreductasegi_15838775374320.8280.7780SMembrane-boundlytictransglycosylasegi_15837259576390.9060.731SAlkalinephosphatasegi_15837509297220.92911SSolublelyticmureintransglycosylaseprecursorgi_15837018351230.9290.5780SLipoproteinprecursorgi_15836688184260.96711SFimbrialsubunitprecursorgi_15837448891280.9440.9691SBeta-mannosidaseprecursorgi_15836687266310.6960.9981SChaperoneproteinprecursorgi_15837361539350.5480.9980SN-acetylmuramoyl-L-alanineamidaseprecursorgi_15838519242260.8180.9821SSuperoxidedismutase[MN]precursor

續(xù)表1

gi_15837826為Sec-type信號肽；gi_15837259為RR-motif信號肽；gi_15838494為脂蛋白信號肽。

gi_15837826 was Sec-type signal peptide. gi_15837259 was RR-motif signal peptide. gi_15838494 was lipoprotein signal peptide.

3 討論

如上所述，木質(zhì)部寄生屬是一類重要的植物病原菌，其基因組序列的完成對更深入地研究其生物學(xué)特性和致病特性無疑將起到巨大的推動作用。對于革蘭氏陰性細(xì)菌的大量研究表明，分泌蛋白是病原細(xì)菌重要的致病因子。盡管目前的研究結(jié)果中，革蘭氏陰性細(xì)菌的致病因子主要是由三型分泌途徑進(jìn)行分泌的。對于木質(zhì)部寄生屬來說，還沒有發(fā)現(xiàn)其中有三型分泌途徑(Type III secretory system)的報(bào)道，目前對于通過信號肽識別機(jī)制分泌的蛋白在致病和其他生長過程中的作用也還未知。勿庸置疑的是，這些分泌蛋白在基因組中大量存在，表明其發(fā)揮作用的主要場所是在細(xì)胞外的，是該細(xì)菌與環(huán)境，包括與寄主互作的重要蛋白。因此，對于這類蛋白的研究，有助于全面了解病原菌的生物學(xué)特性和致病特性。在對這些蛋白進(jìn)行試驗(yàn)之前，首先通過生物信息學(xué)方法對其特性進(jìn)行分析，將有助于設(shè)計(jì)試驗(yàn)思路和提高研究效率。本研究采用Internet信號肽分析軟件SignalPv2.0 v、TargetP 1.0 v、big-PI predictor 和TMHMM v2.0預(yù)測木質(zhì)部寄生屬基因組中含有信號肽的分泌蛋白、分析分泌蛋白的運(yùn)送途徑及信號肽類型。預(yù)測結(jié)果表明，基因組中共存在149個(gè)分泌蛋白，占全基因組總基因數(shù)量的6%，與革蘭氏陽性細(xì)菌Bacillussubtilis， 革蘭氏陰性細(xì)菌Sulfolobussolfataricus分泌蛋白相比(表2)，Sec-type分泌蛋白最多，為Sac分泌途徑。Xylellafastidiosa與Sulfolobussolfataricus均為革蘭氏陰性細(xì)菌，均未預(yù)測到Prepilin-like信號肽以及細(xì)菌素和外激素信號肽；而枯草芽孢桿菌有4種信號肽，4種分泌途徑都有[8]，這可能是革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌分泌蛋白的差異。但Xylellafastidiosa中有脂蛋白信號肽，Sulfolobussolfataricus則缺乏該類信號肽。所預(yù)測的信號肽中功能未知的有79個(gè)，占信號肽的53%。因此，快速預(yù)測基因組的信號肽，對蛋白質(zhì)功能研究具有一定參考價(jià)值。從基因注釋可知，預(yù)測具有分泌類信號肽的gi_15837945、gi_15838205具有ABC transporter的功能，可能屬于細(xì)菌素和外激素信號肽。預(yù)測的與實(shí)際的信號肽會有一定的偏差，有待實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

表2 細(xì)菌中不同類型信號肽出現(xiàn)頻率的比較

Table 2 Frequency of different types of signal peptides in bacteria

名稱Name分泌類Sec-type雙精氨酸RR-motif脂蛋白Lipoprotein類前菌毛Prepilin-like細(xì)菌素和外激素Bacteriocin&Peromone百分率Percentage/%Bacillussubtilis18027114437.0Sulfolobussolfataricus11430004.2Xylellafastidiosa114323005.4

[1] HOPKINS D L.Xylellafastidiosa: xylem-limited bacterial pathogen of plants[J].AnnualReviewsofPhytopathology， 1989， 27: 271-290.

[2] PURCELL A H.Xylellafastidiosa， a regional problem or global threat？[J].JournalofPlantPathology， 1997， 79(2): 99-105.

[3] KAMPER S M， FRENCH W J， DEKLOET S R. Genetic relationships of some fastidious xylem-limited bacteria[J].InternationalJournalofSystematicBacteriology， 1985， 35(2):185-188.

[4] POOLER M R， HARTUNG J S， FENTON R G. Genetic relationships among strains ofXylellafastidiosafrom RAPD-PCR data[J].CurrentMicrobiology， 1995， 31(2):134-137.

[5] MARTINATI J C， PACHECO F T H， MIRANDA V F O D， et al. 16S-23S rDNA: polymorphisms and their use for detection and identification ofXylellafastidiosastrains[J].BrazilianJournalofMicrobiology， 2007， 38(1):159-165.

[6] SIMPSON A J G， REINACH F C， ARRUDA P， et al. The genome sequence of the plant pathogenXylellafastidiosa[J].Nature， 2000， 406(6792):151-157.

[7] LEE S A， WORMSLEY S， KAMOUN S. An analysis of theCandidaalbicansgenome database for soluble secreted proteins using computer-based prediction algorithms[J].Yeast， 2003， 20(7): 595-610.

[8] TJALSMA H， BOLHUIS A， JONGBLOED J D H， et al. Signal peptide-dependent protein transport inBacillussubtilis: a genome-based survey of the secretome[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews， 2000， 64(3):515-547.

(責(zé)任編輯 張 韻)

Prediction of signal peptide ofXylellafastidiosabased on internet softwareZHANG Zhichao1， HUANG Yong2， XU Kecheng1， SONG Hong1， YANG Junyu1， ZHANG Yu1， HUANG Qiong1，3，*

(1.KeyLaboratoryofBio-diversityforPlantDiseasesManagementofMinistryofEducation，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China; 2.YunnanInstituteofMedicalEquipment，Kunming650034，China; 3.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofBio-ResourcesinYunnan，Kunming650201，China)

One approach to rapidly predict the functions of an entire proteome is to utilize genomic database information and prediction software. Thus， we used a set of prediction algorithms to computationally define a potential secretome. InXylellafastidiosa， the N-terminal signal peptide was predicted by SignalP version 2.0. Two hundred and four ORFs were predicted to encode proteins with N-terminal signal peptides. Among these， 173 were predicted with no transmembrane domain (or a single transmembrane domain at the extreme N-terminus). TargetP was used to eliminate proteins with 19 mitochondrial targeting signals， and 154 was predicted not to be GPI-anchored. The final computationally-predictedXylellafastidiosasecretome was estimated to consist of up to 149 ORFs. One hundred and fourteen secretary signal peptides and 32 twin-arginine signal peptides which occupied 76.5% and 21.5% of secretome respectively， and 3 lipoprotein signal peptides only occupied 2%， preplan-like， bacteriocin and pheromone signal peptides were not found.

Xylellafastidiosa; secreted protein; signal peptide

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.23

2016-06-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270067)

張志超(1992—)，男，遼寧丹東人，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail: zhangzc927@163.com

*通信作者，黃瓊，E-mail: huangqiong88hs@163.com

S432.4

A

1004-1524(2017)03-0515-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 515-520

http://www.zjnyxb.cn

張志超，黃勇，徐可成，等. 運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測木質(zhì)部寄生屬信號肽[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(3)： 515-520.