張麗萌，李閏婷，聶曉寧，陳龍欣，邢真真，劉愛菊，房曉歡，韓紅葉，馬潤林*，田樹軍,3*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2. 鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實驗室，河南 鄭州 450000；3. 河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000)

隨著養(yǎng)羊生產(chǎn)向集約化方向的快速發(fā)展，產(chǎn)羔性狀作為養(yǎng)羊生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟性狀對養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的影響巨大[1-2]。卵巢作為動物繁殖的重要生殖器官，直接影響胎產(chǎn)羔性能。本實驗室對綿羊卵巢組織轉(zhuǎn)錄組的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2(Four and a half LIM domains protein 2)在產(chǎn)單胎和產(chǎn)多胎的綿羊卵巢組織中的表達量差異顯著，推測FHL2在綿羊繁殖機能調(diào)控發(fā)揮重要作用。FHL2屬于LIM-Only蛋白家族中的一員，蛋白分子量為32 kD[3]，可以作為轉(zhuǎn)錄共激活子或轉(zhuǎn)錄共抑制子，與多種蛋白和因子互作，影響細胞的增殖分化、遷移、周期、凋亡以及激素分泌，還可以與信號因子結(jié)合參與基因表達的調(diào)控、信號傳遞通路等諸多過程[4-7]。然而，F(xiàn)HL2調(diào)控綿羊卵巢生殖機能的作用機制目前尚不清楚。

酵母雙雜交技術(shù)是一種研究蛋白互作的方法，其主要是在建立宿主細胞酵母cDNA文庫的基礎(chǔ)上，構(gòu)建包含特定基因的誘餌質(zhì)粒，使其與文庫雜交后，在選擇性培養(yǎng)基上，篩選宿主細胞蛋白，能夠與目的基因編碼的蛋白發(fā)生相互作用。該技術(shù)不但可以檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，而且可以篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白[8]。酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于蛋白與宿主細胞的互作機制、蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等眾多生物學(xué)領(lǐng)域的研究[9-10]。利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在人內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中，F(xiàn)HL2可以作為轉(zhuǎn)錄共抑制子與核受體Nur77互作[11]。對人和小鼠的研究則發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2作為轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)因子，在卵泡發(fā)育中調(diào)控重要功能基因的表達[11-12]?？梢?，成功構(gòu)建綿羊卵巢組織細胞酵母雙雜交cDNA文庫，將成為探究FHL2調(diào)控綿羊卵巢繁殖機能的基本工具。

本研究以綿羊卵巢組織細胞的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，長鏈PCR(LD-PCR)擴增雙鏈cDNA，與載體pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187感受態(tài)細胞，通過SMART技術(shù)構(gòu)建綿羊卵巢組織細胞cDNA文庫，旨在為進一步研究FHL2與宿主細胞間的互作機制提供重要的研究工具，也將為提高綿羊繁殖性能和治療卵巢疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及主要試劑

綿羊卵巢組織樣本為實驗室采集的小尾寒羊卵泡期和黃體期的卵巢組織。TRIzol購自Invitrogen公司，Green Taq Mix聚合酶購自Vazyme公司，Trans2K plus DNA Marker購自北京全式金公司，SD/-Leu 酵母營養(yǎng)篩選培養(yǎng)基、Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System cDNA文庫構(gòu)建系統(tǒng)、CHROMA SPINTTM+TE-400 Columns 純化柱、酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒、Aureobasidin A(Aba)、X-α-gal均購自Clontech公司；RNeasy Plus Mini Kit(50)試劑盒購自QIAGEN公司。

1.2 cDNA文庫引物設(shè)計合成

根據(jù)質(zhì)粒 pGADT7-Rec序列設(shè)計1對擴增文庫插入片段的通用鑒定引物。引物序列如下：PF：5′-TA- ATACGACTCACTATAGGG-3′，PR：5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′。由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 綿羊卵巢組織總RNA 提取

按照RNeasy Plus Mini Kit試劑盒說明書提取綿羊卵巢組織的總RNA。微量紫外分光光度計NanoDrop 2000測定總RNA純度及質(zhì)量濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。

1.4 cDNA第一鏈的合成

根據(jù)Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System cDNA文庫構(gòu)建系統(tǒng)說明書，取2μL總RNA于PCR管中，利用試劑盒中的CDSⅢ PCR Primer將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.5 ds cDNA 擴增及純化

利用長鏈 PCR(LD-PCR)將上述cDNA第一鏈反應(yīng)物合成ds cDNA，反應(yīng)體系按照試劑盒說明書進行操作，選擇擴增22個循環(huán)。之后將LD-PCR產(chǎn)物用CHROMA SPINTTM+TE-400柱純化。并分別取純化前后的ds cDNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6制備Y187酵母感受態(tài)細胞

挑取30℃培養(yǎng)3 d的Y187酵母單菌落，接種于加入50 μg/mL卡那霉素(Kan)20 mL的YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600>1.5(約24 h)，取菌液接種至100 mL新的YPDA液體培養(yǎng)基中，使菌液OD600為0.2～0.3，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。將100 mL菌液700×g離心5 min，用30 mL無菌ddH2O重懸菌體，700×g再次離心5 min，加入1.5 mL 1.1×TE/LiAC重懸菌體，12 000 r/min離心15 s，再用600 μL 1.1×TE/LiAC重懸菌體，此菌體即為Y187酵母感受態(tài)細胞。

1.7 綿羊卵巢組織酵母雙雜交文庫構(gòu)建

將純化后的ds cDNA 和pGADT7-Rec按比例共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用0.9% NaCl(W/V)重懸后，涂布于SD/-Leu篩選固體缺陷培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。收集文庫：將平板在4 ℃冷卻6 h，用無菌刮鏟收集菌落，加入無菌的凍存液(含25%甘油的YPDA 液體培養(yǎng)基)，充分混勻后分裝至無菌的1.5 mL 離心管，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 文庫插入片段鑒定

取共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物做102、104稀釋，涂布于90 mm SD/-Leu平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，進行菌落計數(shù)，計算文庫容量和滴度。計算公式：文庫滴度=每板平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)；文庫總?cè)萘?cfu)=平均滴度(cfu/mL)×cDNA文庫總體積(mL)。在SD/-Leu培養(yǎng)平板上隨機挑取23個單菌落，用pGADT7-Rec設(shè)計的通用測序引物進行菌落 PCR鑒定。反應(yīng)體系：Green Taq Mix 12.5 μL，T7和3′AD引物(10 μmol/L)各1 μL，菌液1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 15 min，72 ℃ 1min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，分析文庫插入片段的大小以及重組率。

2 結(jié)果

2.1 綿羊卵巢組織細胞總RNA的提取

利用卵泡期和黃體期的卵巢組織提取總RNA，NanoDrop 2000測定總RNA 濃度為1 900 ng/μL，OD260/OD280為1.96。1%瓊脂糖電泳后可看到清晰的28S、18S和5S 3條亮帶，28S/18S ≈2/1，如圖 1所示。說明提取的綿羊卵巢組織總RNA質(zhì)量和純度較高，滿足構(gòu)建文庫的要求。

M. DNA分子量標(biāo)準(Trans2K plus DNA Marker)；1. 總RNA樣品圖1 綿羊卵巢組織總RNA電泳結(jié)果

2.2 擴增及純化ds cDNA

總RNA在引物作用下通過SMART MMLVRverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一條鏈，利用LD-PCR擴增ds cDNA，并對產(chǎn)物進行純化處理，同時以試劑盒提供的小鼠ds cDNA產(chǎn)物作為陽性對照，對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，第一鏈cDNAs擴增后的PCR產(chǎn)物在泳道內(nèi)彌散狀分布，且純化處理后條帶在250～3 000 bp(見圖2)，ds cDNA純化后，較純化前去除了小于400 bp的片段，主要集中在500～3 000 bp之間，并且在大約1 000～2 000 bp密集分布 (見圖3)。以上結(jié)果表明，ds cDNA分布較為完整，適合用于cDNA文庫構(gòu)建。

2.3 文庫建立及滴度測定

將純化后的ds cDNA 和pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)后獲得綿羊卵巢組織酵母雙雜交文庫。取共轉(zhuǎn)化的文庫菌液進行102和104倍稀釋，取50 μL涂于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，分別統(tǒng)計稀釋102和104后長出的單克隆數(shù)目。所構(gòu)建的cDNA 文庫104平板菌落統(tǒng)計結(jié)果共長了約100個克隆。經(jīng)計算，文庫滴度為2×107cfu/mL。共計15 mL的轉(zhuǎn)化后原始菌液，根據(jù)計算公式得出本次構(gòu)建的cDNA文庫容量為3×108cfu。

M.DNA分子量標(biāo)準(Trans2K plus DNA Marker)；1. 綿羊卵巢組織細胞的ds cDNAs擴增；2. 陽性對照ds cDNAs擴增圖2 綿羊卵巢組織細胞雙鏈cDNA擴增

M.DNA分子量標(biāo)準(Trans2K plus DNA Marker)；1. 純化后的ds cDNA圖3 純化后ds cDNA

2.4 cDNA文庫插入片段鑒定結(jié)果

從SD/-Leu 平板上隨機挑取23個SD/-Leu單菌落進行PCR鑒定。圖5的結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物長度大小主要集中在500～2 000 bp，平均長度約為1 000 bp。23個克隆中僅有1個克隆擴增出多條非特異性條帶，由此計算出文庫重組率為96%(22/23)。上述結(jié)果表明，cDNA文庫質(zhì)量合格，可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗。

M.DNA分子量標(biāo)準(Trans2K plus DNA Marker)；1～23. 插入片段PCR 產(chǎn)物圖5 PCR檢測文庫插入片段

3 討論

蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，綜合分析蛋白與蛋白之間的互作能夠更加深入探究蛋白質(zhì)的具體功能[13-14]。目前研究蛋白質(zhì)互作，常用的是酵母雙雜交技術(shù)，該技術(shù)可以直接在酵母細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)互作，可以從cDNA文庫中篩選到多種與誘餌蛋白有相互作用的已知或未知蛋白，具有能檢測到一些微弱的蛋白質(zhì)互作，以及在酵母細胞內(nèi)驗證互作而無需純化蛋白質(zhì)等優(yōu)點，成為目前篩選互作蛋白的主要方法[15]；缺點是假陽性高，需要在不同缺陷培養(yǎng)基中篩除大量的假陽性互作蛋白[16]。

構(gòu)建一個質(zhì)量合格的cDNA文庫對于酵母雙雜交篩選至關(guān)重要，這就與總RNA提取的純度和完整性密切相關(guān)[17]。同時，在純化ds cDNAs過程中，使用CHROMA SPINTM+TE-400 Columns純化柱，對擴增后的cDNAs進行純化，主要是為了排除小片段，避免其在后續(xù)試驗中產(chǎn)生不必要的干擾[18]。鑒于此，本試驗使用Make Your Own“Mate&PlateTM”Library System cDNA文庫構(gòu)建系統(tǒng)，利用SMART 技術(shù)和同源重組技術(shù)，高效地將純化的ds cDNA和線性化的pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細胞，獲得滿足酵母雙雜交篩選的綿羊卵巢組織細胞cDNA文庫。

判斷酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量好壞的關(guān)鍵因素是插入片段的大小和文庫容量。統(tǒng)計結(jié)果顯示，本試驗所構(gòu)建的酵母雙雜交文庫插入片段的平均長度約為1 000 bp，滴度為2×107cfu/mL，均符合SMART文庫構(gòu)建的要求。同時，研究結(jié)果顯示，該酵母雙雜交文庫具有較好的cDNA片段多態(tài)性和完整性，可用于進一步的文庫篩選。構(gòu)建的cDNA文庫的總庫容量為3×108cfu，具有很高的重組率和隨機性。cDNA文庫的構(gòu)建為進一步研究FHL2與宿主細胞的相互作用機制提供工具。

綜上，本研究利用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了綿羊卵巢組織酵母雙雜交cDNA文庫。文庫容量為3×108cfu，滴度為2×107cfu/mL，重組cDNA 片段大小主要集中在500～2 000 bp，重組率為96%。