李 瑩，陶運(yùn)娟，徐 杰，任亞璐，陳 旭

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城 224000；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215000

洋蔥伯克霍爾德菌是一種常見的醫(yī)院獲得性感染條件致病菌，包括新洋蔥伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、多噬伯克霍爾德菌、越南伯克霍爾德菌、穩(wěn)定伯克霍爾德菌、污染伯克霍爾德菌等[1]。洋蔥伯克霍爾德菌可引起免疫缺陷患者的嚴(yán)重感染，尤其是在囊性纖維化患者中；還可引起以壞死性肺炎、敗血癥和整體預(yù)后差為特征的“洋蔥綜合征”[2]。由于臨床上抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛使用，使得洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)抗菌藥物多重耐藥甚至全耐藥[2-3]。碳青酶烯類亞胺培南及3代頭孢菌素的使用會(huì)增加洋蔥伯克霍爾德菌檢出和定植的發(fā)生。本研究以微量肉湯稀釋法為參考方法，評(píng)估紙片擴(kuò)散法和E-test法檢測洋蔥伯克霍爾德菌體外抗菌藥物藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1臨床菌株 收集2017年3月至2018年8月從蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的洋蔥伯克霍爾德菌30株，從鹽城市第三人民醫(yī)院分離1株，共31株為研究對(duì)象。其中來自痰15株(48.39%)，咽拭子10株(32.25%)，全血3株(9.68%)，引流液1株(3.23%)，傷口1株(3.23%)，分泌物1株(3.23%)。通過質(zhì)譜儀鑒定31株伯克霍爾德菌屬，其中多噬伯克霍爾德菌15株(48.39%)，洋蔥伯克霍爾德菌13株(41.93%)，越南伯克霍爾德菌1株(3.23%)，污染伯克霍爾德菌1株(3.23%)，新洋蔥伯克霍爾德菌1株(3.23%)。同一患者同一標(biāo)本中多次分離的相同菌株不重復(fù)計(jì)數(shù)。

1.2質(zhì)控菌株 銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922。

1.3儀器與試劑 法國梅里埃公司的VITEK MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定儀和法國梅里埃公司的VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，微量肉湯稀釋法和E-test法藥敏試劑均購自溫州市康泰生物科技有限公司，紙片擴(kuò)散法藥敏試劑購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.4藥敏結(jié)果判定及標(biāo)準(zhǔn) 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100 28th抗微生物藥敏試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作及藥敏結(jié)果判讀，其中頭孢哌酮/舒巴坦紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法、E-test法最低抑菌濃度(MIC)值參考腸桿菌頭孢哌酮折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。以微量肉湯稀釋法為參考方法，基本一致率(EA)為被評(píng)估方法的MIC值與微量肉湯稀釋法MIC值相差不超過1個(gè)稀釋度的菌株百分比；分類一致率(CA)為被評(píng)估方法的藥敏結(jié)果(敏感、中介、耐藥)與微量肉湯稀釋法一致的菌株百分比；非常重大誤差(VME)為被評(píng)估方法將耐藥報(bào)告為敏感；重大誤差(ME)為被評(píng)估方法將敏感報(bào)告為耐藥；小誤差(MI)為被評(píng)估方法將中介報(bào)告為耐藥或敏感，或?qū)⒛退?、敏感?bào)告為中介?？山邮芊秶篊A≥90.0%，EA≥90.0%，VME≤1.5%，ME≤3.0%，MI≤10.0%[4]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料以率(%)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1抗菌藥物MIC值和敏感率 復(fù)方磺胺甲噁唑是體外抗洋蔥伯克霍爾德菌群最有效的抗菌藥物50%MIC(MIC50)為1.00 μg/mL，敏感率為100.0%；然后是米諾環(huán)素，MIC50為1.00 μg/mL，敏感率高達(dá)96.8%；美羅培南MIC50為4.00 μg/mL，敏感率為90.3%；頭孢他啶和左氧氟沙星MIC50分別為2.00、1.00 μg/mL;敏感率均為83.8%；而頭孢哌酮/舒巴坦MIC50為16.00 μg/mL，僅僅只能抑制61.3%的洋蔥伯克霍爾德菌生長。復(fù)方磺胺甲噁唑、米諾環(huán)素和美羅培南3種檢測方法的體外敏感率比較接近，且敏感率均>90.0%；而頭孢他啶和頭孢哌酮/舒巴坦的微量肉湯稀釋法敏感率卻低于E-test法和紙片擴(kuò)散法；左氧氟沙星的微量肉湯稀釋法敏感率高于E-test法。見表1。

表1 31株洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)6種抗菌藥物的MIC和敏感情況

2.26種抗菌藥物的誤差率 以微量肉湯稀釋法為參考方法，紙片擴(kuò)散法檢測6種抗菌藥物中美羅培南和復(fù)方磺胺甲噁唑的誤差最小，VME和ME均為0.0%，MI為9.7%；米諾環(huán)素的VME最高，達(dá)6.5%；頭孢哌酮/舒巴坦的ME為12.9%，MI為16.1%；頭孢他啶MI為12.9%，略高于標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

表2 紙片擴(kuò)散法檢測的誤差率和CA

以微量肉湯稀釋法為參考方法，E-test法檢測6種抗菌藥物中美羅培南、米諾環(huán)素和復(fù)方磺胺甲噁唑無誤差，頭孢他啶的誤差比較小，ME為3.2%，MI為6.5%；頭孢哌酮/舒巴坦的誤差最大，ME為12.9%，MI為12.9%；左氧氟沙星的誤差率略高，MI為6.5%,VME為6.5%。見表3。

表3 E-test法檢測的誤差率和CA

2.36種抗菌藥物的EA%和CA% 在log2(-1～1)范圍內(nèi)，以微量肉湯稀釋法為參考方法，E-test法檢測美羅培南和復(fù)方磺胺甲噁唑的EA為>90.0%,頭孢哌酮/舒巴坦的EA為80.5%，米諾環(huán)素和頭孢他啶的EA為74.1%、77.4%，左氧氟沙星僅為67.7%。美羅培南、復(fù)方磺胺甲噁唑和米諾環(huán)素3種方法的CA均>90.0%，左氧氟沙星的CA范圍為83.8%～100.0%，頭孢他啶的CA范圍為83.8%～87.1%。見表2～4。

表4 在log2(-1～+1)范圍內(nèi)E-test法基本一致率

3 討 論

洋蔥伯克霍爾德菌是引起醫(yī)院感染的重要致病菌[5]，包括菌血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、傷口感染、膿腫等，同時(shí)也是引起肺囊性纖維化和慢性肉芽腫的重要致病菌[6]。目前，臨床上分離到的洋蔥伯克霍爾德菌越來越多，在非發(fā)酵革蘭陰性桿菌中位于第4位，僅次于不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌[7]。洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)許多抗菌藥物天然耐藥，且耐藥機(jī)制比較復(fù)雜。一些國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為洋蔥伯克霍爾德菌的耐藥機(jī)制主要為[2,8-9]：(1)細(xì)胞膜滲透性降低；(2)細(xì)胞的主動(dòng)外排；(3)通過底物裂解或化學(xué)修飾使酶失活；(4)點(diǎn)突變引起的靶點(diǎn)改變、減少或缺失；(5)以耐藥靶替代易感目標(biāo)，進(jìn)行代謝旁路；(6)通過增加轉(zhuǎn)錄或基因增殖使產(chǎn)生的靶點(diǎn)過量；(7)特異性結(jié)合蛋白的藥物隔離作用。為及時(shí)準(zhǔn)確地報(bào)告藥敏結(jié)果，指導(dǎo)臨床合理用藥，本研究采用法國梅里埃公司的VITEK MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定儀鑒定并確認(rèn)洋蔥伯克霍爾德菌。通過微量肉湯稀釋法、E-test和紙片擴(kuò)散法來檢測洋蔥伯克霍爾德菌的藥敏結(jié)果。

微量肉湯稀釋法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。紙片擴(kuò)散法具有操作簡單、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，在日常的藥敏試驗(yàn)工作中應(yīng)用非常廣泛。本研究顯示，紙片擴(kuò)散法和E-test法檢測洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑無論是MIC50、敏感率、誤差率、EA,還是CA結(jié)果都很好，但從操作和經(jīng)濟(jì)方面考慮，紙片擴(kuò)散法最適宜。復(fù)方磺胺甲噁唑和米諾環(huán)素敏感性最好，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11-12]。但是米諾環(huán)素紙片擴(kuò)散法的VME較高(6.5%)，與茅國峰等[13]研究報(bào)道紙片擴(kuò)散法結(jié)果不一致，主要原因?yàn)椋?1)四環(huán)素類藥物紙片擴(kuò)散法存在中介和耐藥假性增高的問題，這是由四環(huán)素類藥物的化學(xué)性決定的；(2)此次研究的菌株數(shù)量比較少，可能存在隨機(jī)誤差。因此，為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)該擴(kuò)大研究菌株的數(shù)量。同時(shí)，有資料表明，米諾環(huán)素對(duì)人體的傷害性較大，臨床用此藥應(yīng)當(dāng)慎重[14]。左氧氟沙星由于2017年CLSI取消了紙片擴(kuò)散法的折點(diǎn)，所以只能測定其MIC值。頭孢他啶盡管紙片擴(kuò)散法MI略高，為12.9%，但是MIC50、敏感性、CA和誤差比較小，可能是標(biāo)本量比較少的原因，存在隨機(jī)誤差。頭孢哌酮/舒巴坦的CA<90.0%，與茅國鋒等[13]研究結(jié)果一致，頭孢哌酮/舒巴坦的ME>3.0%，MI>10.0%,可能與沒有具體的CLSI折點(diǎn)有關(guān)。

綜上所述，臨床上有洋蔥伯克霍爾德菌感染者，E-test法、紙片擴(kuò)散法檢測洋蔥伯克霍爾德菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同的方法檢測可能存在不同的誤差，應(yīng)合理選擇藥敏檢測方法，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。