張燕斌,王永東,胡 南,仇曉鈺,丁德馨*

(1.鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001;2.南華大學(xué) 極貧鈾資源 綠色開發(fā)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001)

0 引 言

1 材料與方法

1.1 菌種和低pH值地浸鈾礦山地下水樣品

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)的所用的菌種為瓊氏不動(dòng)桿菌(AcinetobacterJunii)和伯克霍爾德菌(Burkholderiasp)，購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心。

1.1.2 低pH值地浸鈾礦山地下水

低pH值地浸鈾礦山地下水樣品取自新疆某地浸鈾礦山，pH值為3.0，其主要污染物的種類和含量見(jiàn)表1。

表1 新疆某地浸鈾礦山地下水主要物質(zhì)的種類和含量Table 1 Types and contents of main substances in groundwater of an in-situ leaching uranium mine in Xinjiang 單位：mg·L-1

1.2 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

瓊氏不動(dòng)桿菌和伯克霍爾德菌的擴(kuò)大培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基，其配方如下：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為7.0，121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)裝置中(見(jiàn)圖1)，然后按2%的體積比接種菌懸液，往廣口瓶中通氮?dú)?0 min后密封瓶口，將其置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖1 培養(yǎng)裝置Fig.1 Cultivation device

1.3 微生物的耐酸馴化

將低pH值地浸鈾礦山地下水過(guò)濾除菌，將其pH值調(diào)整為7.0，按2%的體積比分別接種瓊氏不動(dòng)桿菌和伯克霍爾德菌，在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，溫度設(shè)置為30 ℃。培養(yǎng)過(guò)程中每隔4 h測(cè)定OD600值，待其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后取菌懸液按2%的體積比接種到pH值為6.0的經(jīng)過(guò)濾除菌的低pH值地浸鈾礦山地下水中，然后依次按照pH值5.0、4.0和3.0的順序進(jìn)行梯度馴化。為穩(wěn)定馴化菌的耐酸性能，在每個(gè)pH值均轉(zhuǎn)接馴化3次，接種的菌懸液均為上一次馴化的對(duì)數(shù)期菌懸液。

1.4 馴化前后瓊氏不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)特性及其去除的性能變化

1.5 馴化前后伯克霍爾德菌的生長(zhǎng)特性及其水解植酸鈉的性能變化

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種馴化

由表2與表3可知，馴化過(guò)程中，隨著pH的降低，瓊氏不動(dòng)桿菌和伯克霍爾德菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的時(shí)間也逐漸延長(zhǎng)，但在同一pH值下進(jìn)行第2次和第3次轉(zhuǎn)接馴化時(shí)，兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)速度較第1次馴化明顯提高。采用在pH為3.0馴化得到的菌株開展后續(xù)研究。

表2 pH值和馴化次數(shù)對(duì)瓊氏不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)的影響Table 2 The influence of pH value and the number of acclimatization on the growth of Acinetobacter janesi 單位：h

表3 pH值和馴化次數(shù)對(duì)伯克霍爾德菌生長(zhǎng)的影響Table 3 The influence of pH value and the number of acclimatization on the growth of Burkholderia 單位：h

2.2 微生物在不同pH值條件下的生長(zhǎng)特性

2.2.1 瓊氏不動(dòng)桿菌在不同pH值條件下的生長(zhǎng)特性

如圖2所示，在pH為7.0和6.0時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌原始菌株的遲緩期短，瓊氏不動(dòng)桿菌能夠快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其OD600值最高分別達(dá)到0.98、0.88。而當(dāng)pH為5.0和4.0時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)速度變緩，遲緩期變長(zhǎng)，分別為25 h和33 h，其OD600值最高分別為0.56、0.36。當(dāng)pH為3.0時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌的遲緩期達(dá)到60 h以上，且其OD600值最高僅為0.10。

圖2 馴化前后的瓊氏不動(dòng)桿菌在不同pH值地浸鈾礦山地下水中的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of Acinetobacter joneii in the groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values before and after domestication

瓊氏不動(dòng)桿菌馴化菌株在pH值為4.0至7.0時(shí)，其生物量與原始菌株相比沒(méi)有明顯變化。但在pH為3.0至5.0時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌馴化菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間比原始菌株提前10 h以上。當(dāng)pH值為3.0時(shí)，瓊氏不動(dòng)桿菌馴化菌株的OD600值最高為0.25，與原始菌株相比有明顯提高(P<0.05)。

2.2.2 伯克霍爾德菌在不同pH值條件下的生長(zhǎng)特性

如圖3所示，在pH為7.0和6.0時(shí)，伯克霍爾德菌原始菌株的遲緩期分別為12 h、19 h，其OD600值最高分別為0.98、0.82。而當(dāng)pH為5.0和4.0時(shí)，伯克霍爾德菌的生長(zhǎng)速度變緩，遲緩期變長(zhǎng)，分別為23 h和41 h，其OD600值最高分別為0.57、0.39。當(dāng)pH為3.0時(shí)，伯克霍爾德菌幾乎不生長(zhǎng)，且其OD600值最高僅為0.02。

圖3 馴化前后的伯克霍爾德菌在不同pH值地浸鈾礦山地下水中的生長(zhǎng)情況Fig.3 The growth of Burkholderia spp before and after domestication in the groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

馴化后，在pH為7.0和6.0時(shí)，伯克霍爾德菌馴化菌株的遲緩期縮短，分別為6 h、9 h,其OD600值最高分別為0.98、0.86。當(dāng)pH為5.0和4.0時(shí)，伯克霍爾德菌的遲緩期分別為22 h和40 h，與原始菌株無(wú)明顯區(qū)別，其OD600值最高分別為0.68、0.50。當(dāng)pH為3.0時(shí)，伯克霍爾德菌的遲緩期為67 h，且其OD600值最高為0.36，與原始菌株相比有明顯提高(P<0.05)。

瓊氏不動(dòng)桿菌能還原硝酸鹽，可用于含硝酸鹽水體的修復(fù)。而伯克霍爾德菌是一種解磷菌，可以將植酸鹽水解，生成正磷酸鹽。正磷酸鹽能與鈾結(jié)合生成微溶礦物，從而達(dá)到去除水體中鈾的目的。地浸礦山地下水含有較高濃度的硝酸鹽和鈾，可以考慮采用這兩種細(xì)菌進(jìn)行修復(fù)。但這兩種細(xì)菌的最適生長(zhǎng)pH值均為7.0左右，在低pH值條件下，其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖的影響有以下幾個(gè)方面：一是影響酶的活性，當(dāng)pH值過(guò)低會(huì)抑制菌體中某些酶的活性，進(jìn)而阻礙菌體的新陳代謝；二是影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及對(duì)代謝產(chǎn)物的排泄；三是pH值不同，會(huì)引起菌體代謝過(guò)程的不同，從而使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變[19]。地浸鈾礦山地下水的pH值通常較低，不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。如本研究中的地浸鈾礦山地下水的pH值為3.0，瓊氏不動(dòng)桿菌在此pH值條件下生長(zhǎng)時(shí)的生物量?jī)H為pH為7.0時(shí)的1/10。

菌種馴化一般是指通過(guò)人工措施使微生物逐步適應(yīng)某一條件，而定向選育微生物的方法。通過(guò)馴化可以得到具有較高耐受力及活動(dòng)能力的菌株。本試驗(yàn)通過(guò)耐酸馴化使瓊氏不動(dòng)桿菌和伯克霍爾德菌適應(yīng)低pH值的環(huán)境。細(xì)胞膜是微生物在低pH環(huán)境中生理脅迫的首要侵襲目標(biāo)，細(xì)胞膜中脂肪酸的組成和比例的變化是其對(duì)外部環(huán)境脅迫的一般性應(yīng)答。經(jīng)過(guò)梯度耐酸馴化，微生物細(xì)胞膜中單不飽和脂肪酸的含量和碳鏈長(zhǎng)度比例增加，降低了細(xì)胞膜對(duì)H+的透過(guò)性，防止細(xì)胞膜內(nèi)的pH迅速下降，以維持細(xì)胞正常的生理功能[20]，從而能夠在低pH值的環(huán)境中生存。本研究的結(jié)果也證明了采取馴化方法可以提高瓊氏不動(dòng)桿菌和伯克霍爾德菌對(duì)低pH值環(huán)境的適應(yīng)能力。

2.3 馴化前后瓊氏不動(dòng)桿菌去除的性能變化

圖4 馴化前后瓊氏不動(dòng)桿菌對(duì)不同pH值 地浸鈾礦山地下水中的去除率Fig.4 Nitrate removal rate of Acinetobacter joneii before and after domestication in groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

2.4 馴化前后伯克霍爾德菌的生長(zhǎng)特性及其水解植酸鈉的性能變化

如圖5所示，在pH為7.0時(shí)，伯克霍爾德菌原始菌株的植酸鈉水解率為79.45%；在pH為6.0、5.0時(shí)，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率分別下降到41.35%、26.32%；在pH為4.0時(shí)，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率為5.36%；在pH為3.0時(shí)，伯克霍爾德菌植酸鈉水解率僅為0.2%。

圖5 馴化前后伯克霍爾德菌對(duì)不同pH值 地浸鈾礦山地下水中植酸鈉的水解率Fig.5 The hydrolysis rate of Burkholderia spp. before and after domestication on sodium phytate in groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

馴化后，伯克霍爾德菌在pH為7.0時(shí)，植酸鈉水解率提高到83.71%；在pH為6.0、5.0時(shí)，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率分別提高到45.36%、30.21%；在pH為4.0時(shí)，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率提高到16.71%；在pH為3.0時(shí),伯克霍爾德菌植酸鈉水解率為9.73%。

在相同pH值的條件下，伯克霍爾德菌馴化菌株的植酸鈉水解率始終高于原始菌株。此外，隨著pH值的減小，馴化菌株與原始菌株植酸鈉水解能力的差異越來(lái)越大。在pH為3.0時(shí)，馴化菌株植酸鈉水解率提高了約47.6倍，且與原始組菌株植酸鈉水解能力相比具有顯著差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，通過(guò)馴化，伯克霍爾德菌在pH為3.0的地浸鈾礦山地下水中水解植酸鈉的能力得到了顯著提高。

3 結(jié) 論