陳慧娟，王 景，王愛琴

（ 1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司，北京 101111）

在全世界范圍內(nèi)，腫瘤依舊是發(fā)病率和致死率較高的疾病之一。據(jù)我國國家癌癥中心統(tǒng)計，2015年我國腫瘤新發(fā)病例392.9萬，發(fā)病率為285.83/10萬；死亡病例233.8萬例，死亡率為170.05/10萬[1]。在我國，腫瘤的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[2]，自2010年起腫瘤死亡率高居各類疾病首位[3]，已成為危害公眾健康的巨大殺手。近年來，隨著藥物基因組學(xué)的快速發(fā)展、各種腫瘤驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn)、各類靶向藥物和免疫治療藥物的“井噴式”出現(xiàn)，腫瘤的治療取得了較大進展，由原來的“一病同治”逐步實現(xiàn)精準(zhǔn)化和個體化治療?；诖笠?guī)模并行測序技術(shù)的高通量測序（next generation sequencing，NGS）具備采用低樣本量同時檢測多個基因多種基因狀態(tài)的能力。隨著檢測速度的加快、測序成本的降低，目前NGS在臨床腫瘤患者基因狀態(tài)的檢測中已逐步取代低通量的Sanger測序和中通量的焦磷酸測序。NGS可同時檢測多個樣本DNA和RNA水平的多種形式的基因突變，包括小片段的插入缺失、點突變、拷貝數(shù)突變、基因重排等，可用于指導(dǎo)腫瘤患者治療藥物選擇和預(yù)后預(yù)測，并有助于腫瘤發(fā)病機制的研究。本研究采用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel V2（ life technologies）檢測了367例多種類型實體腫瘤中與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療相關(guān)的50個基因的近2 800個基因位點的狀態(tài)，為臨床的個體化診療提供了依據(jù)，并為我國腫瘤患者的發(fā)病機理研究累積數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

367例多種類型實體腫瘤樣本均為福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed，paraffinembedded，F(xiàn)FPE）組織樣本與外周血配對樣本。所有腫瘤組織樣本腫瘤細胞含量≥20%或經(jīng)人工富集后腫瘤細胞含量≥20%。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量 所有腫瘤組織均進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）染色，由有資質(zhì)的病理醫(yī)生進行腫瘤細胞含量評估。5～10 μm FFPE切片經(jīng)脫蠟后，若腫瘤細胞含量≥20%，直接采用手術(shù)刀片刮取并收集腫瘤細胞于1.5 mL離心管中；若需人工富集樣本，比對HE劃圈區(qū)刮取白片圈內(nèi)組織收集腫瘤細胞于1.5 mL離心管中；無法進行人工富集或人工富集后腫瘤細胞含量依舊<20%的樣本未進行下一步檢測。采用TIANamp FFPE DNA Kit [天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP331]試劑盒提取FFPE組織基因組DNA。采用TIANamp Genomic DNA Kit [天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP304]試劑盒提取外周血基因組DNA。所有基因組DNA均采用Qubit dsDNA HS試劑盒（美國ThermoFisher Scientific公司）測定DNA濃度，采用Nanodrop 2000分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）測定純度，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 文庫構(gòu)建及測序 采用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel V2（美國ThermoFisher Scientific公司）和Ion AmpliSeq library Kit 2.0（美國ThermoFisher Scientific公司）構(gòu)建文庫，所有操作步驟嚴(yán)格按說明書進行。每一樣本FFPE組織DNA和外周血DNA均按15 ng總量投入同一批次平行建庫。文庫采用Agilent 2100生物分析儀（美國Agilent公司）進行文庫片段大小判定，合格文庫片段范圍為111～187 bp（平均為154 bp）；采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測定文庫濃度，要求文庫濃度>100 pmol/L；文庫片段大小或濃度不滿足要求的樣本，需重新進行文庫構(gòu)建。合格文庫根據(jù)文庫定量結(jié)果稀釋進行多樣本文庫混合，經(jīng)乳液PCR[Ion One Touch 2系統(tǒng)（美國ThermoFisher Scientific公司）和測序模板富集[Ion One Touch ES系統(tǒng)（美國Thermo fisher Scientific公司）]，采用BES 4000基因測序儀（北京博奧生物集團）進行測序分析，平均測序深度>2 000×。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測序所得的原始數(shù)據(jù)，采用Torrent Suite V5.2軟件（美國ThermoFisher Scientific公司），以人類基因組hg19為參考序列進行序列比對和堿基識別。采用Torrent Variant Caller V5.2軟件（美國ThermoFisher Scientific公司）篩選基因突變位點，并通過綜合基因組學(xué)查看器（intergrative genomics viewer，IGV；美國Broad研究所）進行確認。確定基因突變位點后，通過比對同一樣本FFPE組織和外周血突變位點，去除胚系突變和克隆性造血突變位點。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用Pearsonχ2、Fisher's精準(zhǔn)檢驗或連續(xù)校正法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本特征

367例樣本中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）294例（肺腺癌270例、鱗癌19例、其他5例）、胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST） 32例、結(jié)直腸癌28例、胃癌6例、卵巢癌4例、肝癌3例。男性患者190例，女性患者177例，年齡為58（30～86）歲；≥58歲191例，<58歲176例。見表1、表2。

表1 實體腫瘤樣本的特征及基因突變情況 例

表2 NSCLC樣本特征及基因突變情況 例

2.2 基因突變分析

在367例腫瘤樣本中，235例（64.03%）至少存在1種基因的突變。在存在基因突變的235例樣本中，有167例（71.07%）為1種基因突變，有57例（24.26%）為2種基因突變，有10例（4.26%）為3種基因突變，有1例（0.43%）為4種基因突變。在367例腫瘤樣本中共檢出28種基因的突變，突變例數(shù)≥10例的基因有9種，以EGFR基因突變率最高（32.15%，118/367），其次依次為TP53（15.53%，57/367）、K-ras（8.17%，30/367）、c-kit（5.72%，21/367）、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）（3.00%，11/367）、同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）（3.00%，11/367）、B-raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶（BRAF-B-Raf proto-oncogene，serine/threonine kinase，B-raf）（2.72%，10/367）、ERBB2（2.72%，10/367）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸催化激酶3 α亞基（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIKC3CA）（2.72%，10/367），見圖1。TP53突變在被檢的多數(shù)瘤種中均存在，K-ras突變主要發(fā)生在結(jié)直腸癌中，而c-kit基因突變主要發(fā)生在GIST中。

2.3 基因突變在各類型腫瘤中的分布

圖1 實體腫瘤基因突變例數(shù)

在不同腫瘤中，發(fā)生突變的基因和突變率存在較大差異，見圖2。在294例NSCLC樣本中共檢測到23種基因的突變，有62.24%（183/294）的樣本至少檢出了1個基因的突變。在294例NSCLC樣本中基因突變例數(shù)≥5例的基因有8種，其中EGFR的突變率最高（40.14%），其次依次為TP53（13.61%）、K-ras（6.12%）、ERBB2（3.40%）、B-raf（3.06%）、PTEN（2.72%）、APC（2.38%）、PIK3CA（1.70%），見圖2（a）。EGFR的突變主要集中在外顯子19和21，分別占51.69%（61/118）和38.14%（45/118），外顯子18、20及其他外顯子所占比例較少；EGFR突變類型較多，最為常見的為外顯子19的缺失（35.5%，42/118）和L858R（50.00%，59/118）。在檢測樣本中共發(fā)現(xiàn)8種外顯子19的缺失，其中以p.E746_A750del最為常見；5例樣本存在EGFR2個基因位點的共突變，其突變類型分別為L861Q&G719S、L861Q&G719A、L858R&E709V、L858R&R108K、N771_P772insN&S720F，未檢測到T790M與其他基因的共突變。TP53基因以點突變?yōu)橹?，主要集中在外顯子5～8上，但未發(fā)現(xiàn)某一密碼子偏好性；K-ras基因的突變則全部發(fā)生于密碼子12（94.44%，17/18）或13（5.56%，1/18）上，突變類型分別為p.G12C（33.33%，6/18）、p.G12D（27.78%，5/18）、p.G12V（22.22%，4/18）、p.G12A（11.11%，2/18）和p.G13C（5.56%，1/18）；ERBB2的主要突變類型為p.A775_G776insYVMA（60.00%，6/10），其余基因的突變因檢測到突變例數(shù)較少，無明顯規(guī)律性。

在GIST中，基因突變率為68.75%（22/32），以c-kit基因的突變?yōu)橹鳎蛔兟蕿?3.13%（17/32）。c-kit基因突變主要集中于外顯子11上（64.71%，11/17），以外顯子11的點突變和插入缺失為主，其次為PDGFRA的突變（9.38%，3/32），見圖2（b）。28例結(jié)直腸癌中，23例（82.14%）檢出了至少1種基因的突變：K-ras的突變率最高為42.86%（12/28），主要集中于密碼子12上，見圖2（c）；TP53的突變次之為34.38%（11/32），同NSCLC，在結(jié)直腸癌中TP53基因以點突變?yōu)橹?，但無某一位點偏好性；PIK3CA的突變主要以p.H1047R和p.E545X為主，而3例APC基因的突變均為exon14的移碼突變。在胃癌中檢測到2例TP53的點突變。4例卵巢癌樣本均檢測到基因突變：2例為TP53基因的點突變，1例為c-kit基因exon10上的點突變，1例為PTEN與TP53共突變。3例肝癌樣本中檢測到1例PTEN突變。

圖2 實體腫瘤基因突變圖譜

2.4 多基因的共突變

在檢測到基因突變的235例樣本中，28.97%（68/235）的樣本存在2種或2種以上基因的共突變，TP53與其他基因的共突變率最高為57.35%（39/68）。在57例2個基因共突變樣本中，有34例（59.65%）為TP53基因與其他基因的共突變，其中79.41%（27/34）為與EGFR-RAS-RAF信號通路的共突變，8.82%（3/34）為與PTEN的共突變；有9例（15.79%）為EGFR基因與APC、KDR、K-ras等基因的共突變；有3例（5.26%）為PTEN分別與ERBB2、SMAD4、CTNNB1的共突變；有3例（5.26%）為K-ras分別與B-raf、PIK3CA、APC的共突變；有2例為c-kit分別與PDGFRA、ABL1的共突變；其余6例為隨意2個基因的組合，無規(guī)律性。檢測到10例3個基因的共突變，其中5例為TP53與其他2個基因共突變，4例為APC與其他基因的共突變，1例為c-kit、PTEN、SMAD4的共突變。還有1例為APC、MLH1、PIK3CA和FBXW7 4個基因的共突變。

2.5 基因突變與患者性別、年齡的關(guān)系

分析基因突變與患者性別、年齡之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，是否發(fā)生基因突變與患者的性別及年齡無關(guān)，但≥58歲的患者的TP53突變率明顯高于<58歲的患者（P<0.001）。見表1。

因EGFR、ERBB2基因突變僅發(fā)生于NSCLC中，故僅統(tǒng)計了這2個基因與NSCLC患者性別、年齡及病理分型之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)EGFR在女性（P<0.01）、肺腺癌（P<0.001）患者中突變率較高；ERBB2在<58歲患者中突變率較高（P=0.001）。見表2。

3 討論

從內(nèi)在因素分析，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一系列基因突變共同作用的結(jié)果，了解腫瘤的分子圖譜能指導(dǎo)腫瘤的精準(zhǔn)治療并預(yù)測預(yù)后。針對腫瘤分子圖譜的大規(guī)模研究如腫瘤基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）、國際癌癥基因組聯(lián)合體（the International Cancer Genome Consortium，ICGC）已明確了多種實體腫瘤的主要驅(qū)動基因[4]，但這些研究大多為采用NGS平臺的全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）。雖WES在技術(shù)上可行，但因其產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)分析問題及較高的費用問題，依舊是其應(yīng)用于臨床的障礙。針對單個腫瘤患者的檢測，基于各種基因組合的高通量靶向測序因其費用低、靈活等優(yōu)點，目前在臨床上應(yīng)用較為廣泛。

在實際應(yīng)用中，如何精準(zhǔn)檢出腫瘤特有的體細胞突變對腫瘤患者的治療及預(yù)后至關(guān)重要。針對無正常對照配對的腫瘤樣本，雖然目前通過一些算法和過濾標(biāo)準(zhǔn)可以區(qū)分體細胞突變和胚系突變，但如何從體細胞突變中區(qū)分胚系嵌合突變，尤其是針對一些基因如TP53和Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1D（protein phosphatase，Mg2+/Mn2+dependent 1D，PPM1D）的突變尚存在較大的困難[5]。另外，造血干細胞會隨年齡增長累積克隆性突變。有研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血突變具有基因偏向性，絕大多數(shù)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A）突變和少數(shù)TP53突變?yōu)榭寺⌒栽煅蛔?，但除采用正常對照樣本目前尚無好的方法區(qū)分克隆性造血突變和體細胞突變[6]。外周血因其易得、創(chuàng)傷小等成為較好的對照材料，故在本研究中采用腫瘤患者的外周血樣本作為配對樣本進行檢測，用于去除患者本身胚系突變和克隆性造血突變。

在50%～60%的人類腫瘤中均存在TP53基因的突變，在大多數(shù)腫瘤中TP53是主要的腫瘤驅(qū)動基因。二代測序結(jié)果顯示，TP53的突變率在絕大多數(shù)腫瘤中位于所有基因的前3位。在所有腫瘤中，TP53體細胞突變的總突變率為29%，主要集中于外顯子5～8上，以點突變?yōu)橹?，突變位點主要集中于密碼子175、220、245、248、273和282上[7]。本研究結(jié)果顯示，TP53的突變率為15.53%，分布于多種腫瘤中，主要集中于外顯子5～8上，以點突變?yōu)橹鞯珶o密碼子偏向性；TP53突變多發(fā)于年齡較大的患者（≥58歲），提示TP53基因突變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

在NSCLC中，EGFR基因突變是最常見的基因突變，本研究中檢測到EGFR基因在NSCLC中的突變率為40.14%，并且在肺腺癌、女性患者中突變率較高，與針對我國NSCLC患者的Meta分析[8]結(jié)果一致。本研究檢測到EGFR的突變多發(fā)生于外顯子19和21上，突變類型以exon19缺失和L858R為主，與其他研究報道[9]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中ERBB2基因突變在<58歲的患者中較為常見。而MAZIèRES等[10]的研究結(jié)果顯示，ERBB2在女性和未吸煙患者中突變率較高，這可能與種族特異性相關(guān)。

在實體瘤中，K-ras的突變主要集中于密碼子12、13上，其他位點的突變較為少見。本研究在結(jié)直腸癌患者中檢測到3例密碼子p.A146T的突變，而NSCLC中K-ras基因的突變?nèi)考性诿艽a子12和13上，提示K-ras基因的突變類型可能與腫瘤類型及腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)。作為研究頻次較高的原癌基因，K-ras的基因狀態(tài)不僅能指導(dǎo)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）類、單抗類等靶向藥物的治療，還可作為免疫節(jié)點抑制劑類基因標(biāo)志物，攜帶K-ras突變的NSCLC患者可從免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）類藥物獲益[11]。

多基因或多位點的共突變提示腫瘤的生物性質(zhì)可能會因多基因或多位點的共突變而發(fā)生改變，進而影響腫瘤的行為和臨床結(jié)果。VANDERLAAN等[12]發(fā)現(xiàn)，在EGFR陽性的NSCLC中較常見到TP53基因的共突變并且基因的共突變會影響臨床結(jié)果。LABBé等[13]的研究結(jié)果顯示，存在EGFR、TP53共突變的NSCLC患者對TKI類藥物獲益較少，無進展生存期也較短。本研究結(jié)果也顯示，在所有存在共突變的樣本中，TP53基因與其他基因的共突變率最高。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)部分排他性突變的共突變，如EGFR與K-ras、K-ras與B-raf、K-ras與PIK3CA等。目前，腫瘤治療的主要策略是確定瘤種相關(guān)的腫瘤驅(qū)動基因，根據(jù)其基因突變或蛋白產(chǎn)物狀態(tài)進行靶向治療。但基因共突變，尤其是排他性共突變的存在，提示在腫瘤治療中，尤其是在靶向藥物治療中應(yīng)考慮多基因、多位點共突變對藥物療效的影響。

與傳統(tǒng)檢測方法如Sanger測序、突變阻滯擴增系統(tǒng)-聚合酶聯(lián)反應(yīng)（amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction，ARMS-PCR）等相比，NGS檢測的基因突變范圍和突變類型更為全面，能為臨床提供更全面的信息，使腫瘤治療更加精準(zhǔn)化。本研究采用NGS檢測了多種實體腫瘤中基因突變情況，繪制了不同腫瘤的基因突變圖譜，檢測出了高頻率的基因共突變，但未分析與臨床結(jié)果之間的關(guān)系，今后將對此作進一步研究。