張 秋，李 杰，王 猛，王 毅，楊 波，胡 征

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2. 湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；3.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila，Lp）是一種革蘭陰性兼性胞內寄生菌，廣泛存在于淡水環(huán)境中，屬于條件致病菌[1]，約占社區(qū)獲得性肺炎病原菌的6%、院內感染肺炎病原菌的20%[2]。Lp的檢測方法主要有培養(yǎng)法、血清學檢測法、核酸檢測法及抗原檢測法，但這些方法均存在一定的不足。分離培養(yǎng)法細菌生長緩慢、操作繁瑣、耗時長，且陽性檢出率不高。血清學檢測法主要是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測急性期與恢復期患者的血清IgM抗體滴度，以判斷是否存在感染，耗時較長，且不能進行床旁診斷[3]。核酸檢測法是利用具有種屬特異性的基因作為靶點進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）[4]，操作繁瑣，易出現(xiàn)假陽性?？乖瓩z測法通過提取患者的呼吸道分泌物直接進行免疫熒光檢測，檢測速度較快，但靈敏度較低、特異性不高，有一定的交叉反應[5]。因此，亟需建立一種特異性高、靈敏度高、成本低且能快速檢測嗜肺軍團菌所有臨床流行血清型的診斷方法，以滿足臨床診療的需求。生物膜層干涉（bio-layer interferometry，BLI）技術是一種非標記的，且可實時提供高通量生物分子相互作用信息的技術平臺[6]。膠體金免疫層析快速檢測技術具有操作方便、結果直觀、特異性高等特點[7]。本研究擬通過BLI技術篩選出針對Lp特異性表面蛋白的高親和力抗體，根據(jù)膠體金免疫層析法的基本原理，建立快速檢測Lp的方法，為Lp感染的快速檢測提供新的選擇。

1 材料和方法

1.1 材料

Lp（ATCC 33152）、流感嗜血桿菌（ATCC 49247）、肺炎鏈球菌（ATCC 25238）、肺炎支原體（ATCC 15531）和卡他莫拉菌（ATCC 49619）均購自美國標準菌種庫（American type culture collection，ATCC）。金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌及Lp的血清型Lp14、Lp12、Lp9、Lp6均為湖北省武警總醫(yī)院的臨床分離菌株。SP2/0骨髓瘤細胞由湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室保存。BALB/c小鼠購自湖北省疾病預防控制中心，弗氏佐劑購自美國Sigma公司，鼠抗亞型鑒定試劑盒購自武漢三鷹生物科技有限公司，Sephadex G25和Protein A親和層析填料均購自美國GE healthcare公司，CN140硝酸纖維素膜購自德國Sartorius公司。CB08玻璃纖維膜、CH37K吸水紙、 SM31-40 PVC板、HM3030 XYZ三維劃膜噴金儀和ZQ2002型微電腦自動斬切機均購自上海金標生物科技有限公司。Octet Red96e分子相互作用儀、Ni-NTA傳感器、Anti-M IgG Fc Capture Surface傳感器（簡稱AMC傳感器）均購自美國Fortébio公司。 DNA Marker和蛋白質Marker均購自武漢擎科生物技術有限公司，蛋白質彩色Marker購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Lp-肽聚糖關聯(lián)脂蛋白（peptidoglycanassociated lipoprotein，PAL）重組蛋白的表達和純化 依據(jù)Lp的pal基因序列（468 bp，GenBank：X60543.1）設計引物：primer-F 5'-GG AATTCCATATGTGTTCTAAAACCCCAG-3'（NdeⅠ）；primer-R 5'-CCGCTCGAGTCATCT TGTTGCCTCATAA-3'（XhoⅠ）。以Lp菌株為模板，在50 ℃條件下進行PCR擴增，NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，將其定向克隆到pET-28a（+）載體[8]上，通過雙酶切初步鑒定，再進行基因測序?；驕y序由武漢擎科生物技術有限公司完成。構建成功的重組質粒轉化到表達菌株進行活化，在37 ℃條件下誘導表達，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）鑒定，取超聲破碎后的上清液用0.45 μm濾膜過濾，然后用Ni柱親和層析進行純化，收集洗脫液，各取10 μL進行SDS-PAGE。

1.2.2 抗Lp-PAL重組蛋白的單克隆抗體（簡稱單抗）制備 （1）動物免疫。用100 μg Lp-PAL蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后初次免疫BALB/c小鼠。每隔10 d用相同劑量的抗原與弗氏不完全佐劑等體積充分乳化后加強免疫1次，免疫3次后取尾血測定血清效價；以樣本組（血清）與空白組[磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）稀釋液]吸光度（A）值比值>2.1且稀釋倍數(shù)達到1∶100 000為有效效價[9]，當達到有效效價時用100 μg免疫原腹腔進行加強免疫注射。（2）雜交瘤細胞株的制備。加強免疫3 d后按常規(guī)方法將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，采用間接ELISA篩選出產抗體的強陽性細胞株[10]，具體步驟：抗原37 ℃包被2 h，2%牛血清白蛋白封閉1 h，雜交瘤細胞上清孵育1 h，羊抗小鼠孵育1 h，顯色10 min并檢測，實驗溫度均為37 ℃。（3）單抗的制備。取12周齡的BALB/c小鼠腹腔注射0.4 mL弗氏不完全佐劑，1周后腹腔注射雜交瘤細胞，7～10 d后收集腹水并用45%（NH4）2SO4對腹水進行初步純化，經葡聚糖凝膠（Sephadex G25）除鹽后采用Protein A親和層析（甘氨酸緩沖液）進行純化，收集的洗脫液凍干濃縮，再利用Sephadex G25柱將甘氨酸緩沖液更換為PBS。

1.2.3 抗Lp-PAL蛋白單抗的特異性分析 （1）ELISA鑒定特異性。將滅活的11種常見呼吸道病原菌及4種不同血清型Lp的細菌濃度調整至1×109CFU/mL，并進行超聲破碎處理，作為間接ELISA中的抗原進行包被；采用間接ELISA（步驟同1.2.2）鑒定單抗的特異性，并用鼠抗亞型鑒定試劑盒鑒定單抗亞類。（2）免疫印跡法鑒定特異性。將滅活的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌及Lp的細菌濃度調整至1×109CFU/mL，超聲破碎，分別取4 μL經超聲破碎處理后的4種菌液，另取5 μL Lp-PAL蛋白進行SDS-PAGE，再用半干法轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。以制備的單抗（3 μg/mL）作為一抗，以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗小鼠抗體（武漢飛羿公司，1∶5 000稀釋）為二抗，采用化學發(fā)光法顯影。

1.2.4 BLI技術鑒定抗原抗體反應的特異性 （1）特異性鑒定。分別將不同濃度（0、30、100、300和1 000 nmol/L）的Lp-1和Lp-2單抗與同一濃度的抗原（Lp-PAL重組蛋白）進行反應，具體步驟：將AMC傳感器浸入PBS中平衡60 s后，浸入待測抗體中固化180 s，再浸入PBS中平衡60 s，然后浸入抗原稀釋液中反應120 s，再浸入PBS中解離120 s，最后浸入再生液（10 mmol/L 甘氨酸，pH值1.7）中再生30 s，見圖1。以上過程用Octet Red96e分子相互作用儀進行實時檢測。（2）采用競爭實驗檢驗抗體識別抗原位點。將抗原（Lp-PAL重組蛋白）固化在Ni-NTA傳感器上，然后依次與Lp-1單抗、Lp-2單抗相互作用，檢測Lp-2單抗的結合信號，以判定2個抗體是否識別同一表位，Lp-2單抗結合信號比值>60%表明2個抗體間完全無競爭，<20%表明完全競爭；分2組進行實驗，分別將Ni-NTA傳感器在平衡液（PBS）中平衡60 s，固定抗原180 s，在PBS中平衡30 s，然后將Ni-NTA傳感器先結合Lp-1單抗180 s，在PBS中平衡30 s，實驗組結合Lp-2單抗，對照組結合PBS，浸入再生液中再生30 s，以上過程用Octet Red96e分子相互作用儀進行實時檢測。（3）采用交叉反應實驗鑒定抗體專一性。將相同濃度（1×109CFU/mL）的肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌和嗜肺軍團菌用超聲破碎，將其作為抗原與同一濃度（100 nmol/L）的2個抗體進行反應。具體步驟同特異性鑒定。

圖1 AMC傳感器的檢測流程圖

1.2.5 膠體金免疫層析試紙條的制備[11]（1）膠體金結合墊的制備。采用檸檬酸鈉還原法[12]制備40 nm的膠體金顆粒。（2）檢測線和質控線的固定。將Lp-2單抗和羊抗小鼠抗體分別稀釋至2.0、0.4 mg/mL，噴于硝酸纖維素膜上作為檢測線（T線）和質控線（C線），間距為0.5 cm；將噴好的硝酸纖維素膜37 ℃真空干燥12 h以上，4 ℃密封干燥保存?zhèn)溆谩＃?）樣品墊的制備。取1張CB08玻璃纖維素膜，將其在樣品墊處理液（20 mmol/L Tris、3%蔗糖、1%牛血清白蛋白、0.3%聚乙烯吡咯烷酮、1% Tween20，pH值8.7）中浸泡至少2 h，再置于真空干燥箱內37 ℃干燥12 h，制成樣品墊，室溫密封干燥保存。（4）免疫層析試紙條的組裝。將樣品墊、結合墊、吸水紙依次貼在PVC底板上，將試紙切割成0.4 cm寬的試紙條，并與干燥劑一同封裝于鋁箔袋內。

1.2.6 測試方法與判定標準 將待檢樣本溶于0.9%NaCl溶液（含0.1% Triton X-100）中，取150 μL滴在樣品墊上，10 min后判斷結果。C線和T線均有條帶，結果為陽性；C線有條帶而T線無條帶，結果為陰性；C和T線均無條帶，結果無效。

1.2.7 試紙條的性能測試 （1）特異性測試。采用試紙條驗證4種血清型Lp的特異性，采用試紙條分別檢測超聲破碎處理后的11種常見呼吸道病原菌，將菌濃度均調整為1×109CFU/mL，鑒定試紙條的特異性；（2）靈敏度測試。用0.9% NaCl溶液（含0.1% Triton X-100）將滅活的Lp梯度稀釋為1×109、1×108、1×107、1×106和1×105CFU/mL，測試試紙條的靈敏度，實驗重復2次。（3）穩(wěn)定性和重復性測試。將3個不同批次的用鋁箔袋密封的試紙條置于25 ℃儲存6個月，每隔30 d用陽性樣本和陰性樣本進行檢測，每個樣本重復檢測3次，觀察重復性。

2 結果

2.1 Lp-PAL蛋白的制備和純化結果

通過基因克隆得到的重組質粒經雙酶切，在相對分子質量500 bp下方出現(xiàn)1個條帶。將PCR產物進行測序比對，結果顯示堿基序列未發(fā)生突變，表明構建成功。見圖2。

圖2 PCR擴增結果和重組質粒雙酶切鑒定結果

在37 ℃條件下用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導成功表達，收集表達前后的樣本進行SDS-PAGE，確定融合蛋白為可溶性蛋白，經Ni柱親和純化后收集洗脫的樣本進行SDS-PAGE，見圖3。目標蛋白相對分子質量為21 000（天然蛋白相對分子質量為19 000，Tag-His標簽蛋白相對分子質量為2 000），在100 mmol/L咪唑洗脫液中出現(xiàn)目的條帶，但雜蛋白較多；在150 mmol/L咪唑洗脫液中目標蛋白純度可達95%以上，測定濃度后離心凍干，即得到目標抗原Lp-PAL蛋白。

圖3 Lp-PAL融合蛋白的誘導表達和Ni柱親和純化結果

2.2 抗Lp-PAL蛋白單抗的制備及純化結果

篩選到2株陽性雜交瘤細胞Lp-1和Lp-2，腹水抗體效價均為1∶52 100。將Lp-1細胞和Lp-2細胞分別注入5只12周齡的BALB/c小鼠體內，誘生腹水后采用45%硫酸銨沉淀法粗純化稀釋的血清樣本，經Sephadex G25除鹽，Protein A親和純化。2種抗體純度均在90%以上，凍干后置-80 ℃保存。見圖4。

圖4 抗Lp-PAL蛋白單抗的SDS-PAGE結果

2.3 抗Lp-PAL蛋白單抗特異性分析結果

2.3.1 Lp-1及Lp-2單抗的特異性 間接ELISA結果表明，Lp-1及Lp-2單抗只與Lp發(fā)生陽性反應，與其他10種呼吸道常見病原菌（肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌）均無交叉反應。單抗的亞型鑒定結果表明，Lp-1和Lp-2單抗均為IgG1型，且均為κ輕鏈。

2.3.2 Lp-1及Lp-2單抗對Lp-PLA天然蛋白及重組蛋白的識別 免疫印跡法結果顯示，Lp-1和Lp-2單抗與Lp-PLA天然蛋白及重組蛋白有強反應，與肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌無目的反應條帶，Lp-1單抗與流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌出現(xiàn)很淺且模糊的雜帶，可能是非特異性結合的條帶，Lp-2單抗未出現(xiàn)反應條帶，見圖5。

圖5 Lp-1和Lp-2單抗的免疫印跡法結果

2.4 BLI技術鑒定結果

2.4.1 特異性鑒定結果 將不同濃度（0、30、100、300和1 000 nmol/L）的Lp-1、Lp-2單抗與同一濃度抗原（Lp-PAL重組蛋白）進行反應。結合動力學常數(shù)分析結果表明，Lp抗體與抗原的親和力均能達109以上，提示抗原抗體的相互作用力均較強，見表1。結合解離圖分析結果表明，Lp-1和Lp-2單抗結合速率均較快，且結合信號值較好，解離速率慢，提示篩選出的Lp-1和Lp-2單抗與Lp-PAL重組蛋白有較強的結合力。見圖6。

2.4.2 競爭實驗結果 將抗原（Lp-PLA重組蛋白）固化在Ni-NTA傳感器上，依次與Lp-1、Lp-2單抗相互作用。根據(jù)傳感器技術手冊計算得到檢測Lp-2的結合信號比值為77.53%，說明Lp-1和Lp-2單抗識別的是同一抗原的不同抗原表位。見圖7。

2.4.3 交叉反應實驗結果 Lp-1單抗和LP-2單抗只與Lp有強反應，與其他11種細菌（肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌和嗜肺軍團菌）均無特異性反應，抗原抗體的專一性強。見圖8。

表1 Lp-1和Lp-2單抗與抗原Lp-PAL重組蛋白的相互作用動力學常數(shù)

圖6 Lp-1和Lp-2單抗與抗原Lp-PAL重組蛋白的結合、解離圖

圖7 Lp-1和Lp-2單抗相互競爭抗原Lp-PAL結合位點實驗結果

圖8 交叉反應實驗結果

2.5 膠體金免疫層析試紙條的性能評價

2.5.1 特異性 采用制備好的膠體金免疫層析試紙條分別檢測細菌濃度為1×109CFU/mL的不同血清型Lp，以0.9%NaCl溶液作為陰性對照。結果顯示，試紙條對Lp不同血清型（Lp12、Lp14、Lp9和Lp6）均有反應。采用膠體金免疫層析試紙條分別檢測細菌濃度為1×109CFU/mL的11種常見呼吸道病原菌，其中Lp檢測結果為強陽性，其他10種呼吸道常見病原菌檢測結果均為陰性。見圖9。

圖9 膠體金免疫層析試紙條的特異性

2.5.2 靈敏度 當Lp濃度稀釋至1×107CFU/mL時，T線上出現(xiàn)一條較弱的紅色條帶，繼續(xù)稀釋后進行檢測，僅在C線上出現(xiàn)紅色條帶，因此膠體金免疫層析試紙條的檢出下限（靈敏度）為1×107CFU/mL。見圖10。

圖10 膠體金免疫層析試紙條的靈敏度

2.5.3 穩(wěn)定性和重復性測試 將膠體金免疫層析試紙條置于25 ℃儲存6個月，每隔30 d取出進行檢測，其特異性和靈敏度均未發(fā)生明顯變化，且平行實驗結果穩(wěn)定。

3 討論

Lp是一種可引起人類嚴重呼吸道疾病的病原微生物。軍團菌肺炎在非典型性肺炎中是病情最重的一種，未經有效治療者的病死率高達45%[8]。PAL蛋白是Lp中位于細胞表面的肽聚糖關聯(lián)脂蛋白，與肽聚糖密切相關。對攜帶pal基因的片段進行測序，鑒定編碼抗原的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)該基因編碼176個氨基酸，相對分子質量為18 913，通過信號肽酶Ⅱ切割出22個氨基酸，其共有序列證實該蛋白為脂蛋白[13]。KIM等[14]通過構建血清Ⅰ型Lp-PAL蛋白，制備多克隆抗體，采用ELISA檢測尿液PAL抗原，證實PAL抗原存在于多種軍團菌屬內，是一種作為檢測靶標的潛在廣譜抗原，可用于泌尿系統(tǒng)感染的診斷。YOON等[15]通過PCR和免疫印跡法進一步證實PAL蛋白在軍團菌中的保守性，提出Lp-PAL蛋白可作為軍團菌感染的DNA疫苗候選物。鑒于PAL蛋白的高度保守性、種屬特異性及表達廣譜性，本研究以PAL蛋白作為Lp的檢測靶標，建立相應的檢測方法。

目前，針對軍團菌感染的診斷主要依賴于軍團菌抗原的檢測。國外已有專門針對軍團菌感染的血清Ⅰ型脂多糖抗原檢測試劑盒[16]，其敏感性可達90%以上，但檢測不同血清型的Lp時會發(fā)生漏檢。鑒于Lp感染的嚴重后果（致死率高達45%），開發(fā)能有效檢測Lp所有血清型的檢測試劑盒顯得十分重要。

本研究通過基因工程方法獲得PAL重組蛋白并通過雜交瘤技術篩選到2株分泌單抗的雜交瘤細胞株Lp-1和Lp-2。在免疫印跡法中出現(xiàn)的非特異性條帶不影響檢測，因試紙條中要2個抗體都非特異性結合1個抗原才會出現(xiàn)假陽性，說明篩選出的2種單抗均能特異性識別Lp-PLA天然蛋白和重組蛋白。該單抗組合能特異性識別多種血清型Lp菌體中的PAL天然蛋白，且與其他常見呼吸道病原菌無交叉反應，說明抗體所識別的抗原表位是Lp特有的，且2種單抗與Lp-PAL重組蛋白的結合無競爭效應及空間結合位阻效應，雙單抗的選擇有效保證了制備出的膠體金免疫層析試紙條的特異性。本研究制備的Lp檢測試紙條只特異性識別Lp，具有較高的特異性。根據(jù)趙鐵梅[17]的研究結果，Lp共有16個血清型，在Lp感染中，Lp12（21.8%）、Lp14（11.3%）、Lp9（3.5%）和Lp6（3.1%）均為較多見的血清型。本研究制備的膠體金免疫層析試紙條均能特異性識別以上Lp血清型，進一步證明PAL蛋白在Lp中的廣譜表達性及保守性，適合作為Lp感染的檢測靶標。

ADEGBOLA等[18]的研究結果顯示，肺炎鏈球菌感染者上呼吸道中的細菌濃度>1×106CFU/mL，卡他莫拉菌感染者的細菌濃度>1×107CFU/mL。根據(jù)本研究的預實驗結果，Lp感染患者咽拭子樣本中的細菌濃度可達1×107CFU/mL以上，而Lp攜帶者細菌濃度均<1×105CFU/mL，因此本研究制備的膠體金免疫層析試紙條的靈敏度足以滿足臨床檢測要求。

綜上所述，本研究采用BLI技術鑒定出針對Lp的單抗，并以此為基礎成功制備了檢測Lp的膠體金免疫層析試紙條。相對于其他Lp的檢測方法，該試紙條具有快速、特異、靈敏的特點，不需要培訓專業(yè)人員和昂貴的儀器設備，可進行床旁檢測，10 min內即可得到準確結果，尤其適用于對重癥呼吸道感染患者的實時診斷，且有助于解決抗菌藥物濫用等問題，具有廣闊的應用前景。