吳麗娟 鄒建話 劉小月 鄭 磊 王 前

吳麗娟1，2，鄒建話1，劉小月1，鄭 磊3，＊，王 前3，＊

1 廣東省深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，深圳518133； 2南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系，廣州510515； 3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州510515； ＊通訊作者

肺炎鏈球菌（Streptococcus Pneumonia，SP）是全球兒童社區(qū)獲得性感染的首要病原菌，既可導(dǎo)致兒童膿胸、敗血癥、腦膜炎等侵襲性感染，也可導(dǎo)致中耳炎（SP占30%～60%）、肺炎（SP占30%～50%）等呼吸道感染。我國(guó)每年因SP相關(guān)性疾病導(dǎo)致兒童死亡人數(shù)列全球前10名［1］。SP細(xì)胞外的多糖莢膜是其致病的關(guān)鍵，同時(shí)也是疫苗作用的靶點(diǎn)，根據(jù)莢膜多糖的不同，已經(jīng)鑒定出46個(gè)血清群，93個(gè)血清型。SP的血清型既與致病性、耐藥性有關(guān)，也與莢膜置換、疫苗有效性有關(guān)，是相關(guān)研究的核心［2］。由丹麥國(guó)家血清研究院（Statens Serum Institut，SSI）提供的莢膜腫脹法和乳膠凝集法是傳統(tǒng)方法檢測(cè)SP血清型的金標(biāo)準(zhǔn)［3］，但其抗血清昂貴，不能自動(dòng)化及批量檢測(cè)。由于90多種血清型的莢膜多糖基因序列（cps）的公布，分子分型技術(shù)有望替代傳統(tǒng)方法，更簡(jiǎn)單快捷地檢測(cè)SP血清型［4］。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)易的血清型多重PCR（mPCR）方法，檢查幾種常見重要SP血清型（4、6、9 V、14、18、19F、23F、19 A），通過檢測(cè)相應(yīng)已知血清型和未知血清型臨床菌株并與測(cè)序結(jié)果比較，以初步探討該方法的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

1.1.1 已知血清型SP菌株：4、6、9 V、14、18、19F、23F、19 A（北京大學(xué)人民醫(yī)院惠贈(zèng)）各1株，血清型由SSI莢膜腫脹法確定。

1.1.2 未知血清型SP菌株：分離自2009年1月～2011年12月深圳市某區(qū)婦幼醫(yī)院兒科患兒不重復(fù)SP菌株126株［5］，其中16株來源于血液，其它來源于呼吸道，用苛氧菌菌種保存管（MAST，英國(guó)）－70℃保存。SP鑒定標(biāo)準(zhǔn)為奧普托欣紙片敏感和膽汁溶菌試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.1.3 質(zhì)控菌株：選取標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619（已知血清型為19F）作為質(zhì)控菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（Shellab，美國(guó)）；Axygen細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（美國(guó)）；Taq DNA聚合酶、d NTP Mix、10×Loading Buffer、DNA Mar ker（Ta Ka Ra公司，日本）；瓊脂糖（Biowest公司，法國(guó)）；溴化乙錠等常規(guī)分子生物學(xué)試劑（南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系提供）；TA載體試劑盒（上海拜力公司）；瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Ta Ka Ra公司，日本）；PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國(guó)）；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（Bio－rad，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)［6］，根據(jù)廣泛應(yīng)用的SP 7價(jià)結(jié)合疫苗覆蓋血清型及近年來常見的19 A血清型，設(shè)計(jì)9對(duì)PCR引物，包括SP莢膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9 V、14、18、19 A、19F、23F特異性引物，由Invitrogen公司合成，各引物序列見表1。

1.3.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增：將凍存的SP臨床菌株復(fù)蘇，重傳至羊血平板（廣州迪景），置5%CO2、35℃溫箱孵育18～24h。將新鮮純SP菌落刮入1 ml生理鹽水，按Axygen細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（柱提取法）步驟提取模板DNA。PCR反應(yīng)體系為Ex Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×Ex Taq buffer 2μl，模板 DNA 2μl，d NTPs 1.6μl，9種混合引物（每種引物 200μM）0.75μl，重蒸水補(bǔ)足至20μl。循環(huán)參數(shù)：94℃15 min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察產(chǎn)物條帶。

表1 8種特異性SP血清型引物序列

1.3.3 DNA測(cè)序：在紫外燈下切割有條帶的膠塊，按DNA純化試劑盒說明書對(duì)DNA進(jìn)行純化后，按TA載體試劑盒說明書與p MD18－T載體進(jìn)行連接，平板克隆。完成后送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast檢索與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 8株已知血清型SP DNA經(jīng)mPCR擴(kuò)增后結(jié)果

每株SP都能擴(kuò)增出cpsA特異性產(chǎn)物，同時(shí)每種血清型均在對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物大小位置出現(xiàn)特異性條帶，血清型18和19 A由于產(chǎn)物大小太接近，無(wú)法直接區(qū)別，需克隆后測(cè)序區(qū)分；產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與mPCR結(jié)果一致。見圖1。

圖1 已知血清型SP經(jīng)mPCR擴(kuò)增后電泳圖

2.2 126株未知血清型臨床SP DNA經(jīng)mPCR擴(kuò)增后結(jié)果

共有124株SP能擴(kuò)增出cpsA特異性條帶，14株血液來源SP有特異性條帶，檢出5種血清型，35株呼吸道來源SP有特異性條帶，檢出8種血清型（表2）。所有血清型特異性條帶均經(jīng)過純化克隆后測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示與mPCR結(jié)果一致。

表2 126株臨床SP血清型檢出率（n，%）

3 討 論

cps基因座上的莢膜多糖合成基因決定SP莢膜多糖的產(chǎn)生，其開始部位的基因序列cpsA高度保守，幾乎可出現(xiàn)在所有SP中，除外不能分型的SP（無(wú)莢膜），cps基因座中心部位的位點(diǎn)包含血清型特異性基因，可作為分子分型的基礎(chǔ)［4］。本文設(shè)計(jì)的mPCR引物針對(duì)最常導(dǎo)致侵襲性感染（血流感染）的8種SP血清型的cps保守序列，通過mPCR檢測(cè)的8種SP血清型與傳統(tǒng)方法檢測(cè)的血清型均一致，可以直接通過產(chǎn)物大小區(qū)分特異性血清型，無(wú)交叉反應(yīng)，cpsA可作為內(nèi)參。表明該方法可簡(jiǎn)單、直接地區(qū)分8種血清型。

SP通過兩種不同方式對(duì)人體致?。阂皇乔忠u性菌株通過有效的人類個(gè)體間傳播導(dǎo)致菌血癥；二是菌株長(zhǎng)期定植在鼻咽部，伺機(jī)導(dǎo)致呼吸道感染。因此出現(xiàn)侵襲性感染和呼吸道感染SP血清型的不同流行分布特點(diǎn)。全球范圍內(nèi)，13種SP血清型導(dǎo)致了超過75%的兒童侵襲性SP感染（血流感染）［1］，我國(guó)Lian等［3］用傳統(tǒng)方法檢測(cè)兒童血液來源SP血清型發(fā)現(xiàn)87.8%的菌株分布在這13種血清型中，尤以血清型19F、14、19A、6和23F最常見。與本研究中血液來源SP 87.50%分布在19F、14、19 A、6和23F相一致，表明mPCR對(duì)血液來源SP血清型檢測(cè)有較高的應(yīng)用價(jià)值，通過一次mPCR即可檢測(cè)出絕大部分菌株的血清型，簡(jiǎn)單有效。

本文結(jié)果顯示本方法對(duì)呼吸道來源樣本SP的血清型檢出率顯著低于血液樣本，只有31.81%的樣本出現(xiàn)特異性條帶，這與呼吸道SP血清型異質(zhì)性大，分布更廣有關(guān)，僅用一次mPCR不能達(dá)到檢測(cè)目的。對(duì)此可采用 Karen等［7］設(shè)計(jì)的一系列mPCR實(shí)驗(yàn)，逐步完成對(duì)所有呼吸道樣本SP血清型的篩查。

mPCR分子分型法檢測(cè)SP血清型不用購(gòu)買昂貴的血清型抗血清，又能達(dá)成準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、高通量檢測(cè)血清型。同時(shí)，mPCR還可應(yīng)用于呼吸道多種血清型SP混合定植的篩查，這是傳統(tǒng)方法無(wú)法做到的?？傊疚慕⒌膍PCR檢測(cè)SP血清型方法可簡(jiǎn)單、直接地檢測(cè)出8種SP重要血清型，尤其對(duì)于血液來源SP血清型有較大優(yōu)勢(shì)，至于呼吸道SP血清型檢測(cè)尚需完善更多mPCR方案。

1 Katherine LB，Lara J W，Ja mes PW，et al.Bur den of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years：global estimates［J］.Lancet，2009，374（9 693）：893～902.

2 Daniel MW，Richar d M，Marc L.Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination［J］.Lancet，2011，378（9 807）：1 962～1 973.

3 Lian X，Kaihu Y，Guilin X，et al.Serotype distribution and antimicr obial resistance of Streptococcus pneumoniae isolates that cause invasive disease among Chinese children［J］.Clin Infec Dis，2010，50（5）：741～744.

4 Stephen DB，David MA，Angeliki M，et al.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal ser ot ypes［J］.PLoS Genet，2006，2（3）：e31.

5 吳麗娟，鄒建話，繆小佟，等.社區(qū)獲得性呼吸道感染患兒肺炎鏈球菌耐藥特征分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（12）：2 147～2 149.

6 Rekha Pai，Robert EG，Ber nard B，et al.Sequential multiplex PCR approach for deter mining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates［J］.J Clin Micro，2006，44（1）：124～131.

7 Karen M，Carolynn DB，Marcella H，et al.Serotyping of streptococcus pneumoniae isolates from nasopharyngeal samples：use of an algorit h m combining microbiologic，ser ologic，and sequential multiplex PCR techniques［J］.J Clin Micr o，2011，49（9）：3 209～3 214.