鄧 慶，羅 韜，葛 佳，劉 鋒，李 磊，汪黎鴻，王 姣，閻曉初

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其患病率及病死率均居全國首位[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancers, NSCLC)占肺癌的80%～85%[2-4]。近年越來越多的肺癌相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因被發(fā)現(xiàn)，為個(gè)體化治療及靶向治療的推廣奠定了基礎(chǔ)。大量臨床研究表明驅(qū)動(dòng)基因的突變狀態(tài)可以作為靶向藥物治療療效的重要預(yù)測因子，EGFR和KRAS突變狀態(tài)可以指導(dǎo)EGFR-TKIs的用藥[5-6]；ALK和ROS1基因融合突變患者對(duì)ALK/ROS1抑制劑有一定的療效[7]；BRAF基因突變患者可以從RAF抑制劑及MEK抑制劑聯(lián)合使用中受益[8]；RET基因融合患者對(duì)RET抑制劑卡博替尼敏感[9]；HER-2突變患者對(duì)曲妥珠單抗具有一定的敏感性[10]。NCCN指南明確指出，在進(jìn)行靶向治療前需要對(duì)基因的突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，并建議對(duì)更廣泛的有效基因進(jìn)行檢測[11]，NSCLC的多基因聯(lián)合突變檢測可以為患者的靶向治療提供更有效、更精準(zhǔn)的治療方法。

目前檢測基因突變方法主要有直接測序法和ARMS-PCR法。直接測序法能夠完整檢測出整條片段，但其敏感度有限[11-12]。ARMS法只對(duì)指定基因進(jìn)行檢測，具有高靈敏性，對(duì)標(biāo)本的DNA濃度及質(zhì)量要求較低，能檢測出樣本中低至1%的突變[12]，對(duì)于活檢小標(biāo)本也能得到理想的結(jié)果，ARMS法操作方便快捷，可同時(shí)檢測9個(gè)基因的突變，能夠同時(shí)檢測點(diǎn)突變、插入缺失、融合等多種熱點(diǎn)突變。最新版NCCN指南推薦的8個(gè)核心驅(qū)動(dòng)基因EGFR、ALK、ROS1、NRAS、RET、KRAS、BRAF、HER-2基因均可行該方法檢測。本文通過對(duì)522例NSCLC石蠟組織進(jìn)行9個(gè)基因聯(lián)合檢測分析，旨在探討NSCLC中9個(gè)主要驅(qū)動(dòng)基因的基因狀態(tài)及其與臨床的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2018年2月～2019年2月經(jīng)手術(shù)切除、穿刺活檢的NSCLC樣本522例。

1.2 試劑與儀器實(shí)驗(yàn)儀器采用安捷倫公司的熒光定量PCR儀(MX3000P美國)。核酸提取試劑盒、九種(ALK、ROS1、RET、EGFR、KRAS、HER-2、PIK3CA、NRAS和BRAF)突變基因檢測試劑盒(熒光PCR法)由廈門艾德生物公司提供。

1.3 方法石蠟組織樣本確定組織學(xué)診斷后，提取組織DNA及RNA用于后續(xù)檢測。使用核酸提取試劑盒(廈門艾德生物公司)提取組織核酸。核酸提取后用紫外分光光度計(jì)測量DNA/RNA質(zhì)量及濃度，按照測量的DNA/RNA濃度稀釋至2～5 ng/L備用。采用福建廈門艾德生物公司的多種突變基因檢測試劑盒(熒光PCR法)提供的方法，在Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。應(yīng)用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性，所有P值均基于雙向假設(shè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征522例NSCLC中，男性329例，占比63.03%，女性193例，占36.97%；有吸煙史237例，占比45.40%，無吸煙史187例，占35.82%，吸煙史不明者98例，占比18.77%；其中鱗癌123例，占23.56%，腺癌365例，占69.92%，腺鱗癌7例，占1.34%，未知分型(NOS)患者27例，占比5.17%；臨床分期Ⅰ期6.35%，Ⅱ期3.26%，Ⅲ期18.96%，Ⅳ期56.03%，未知分期15.52%。

2.2 9種驅(qū)動(dòng)基因突變狀態(tài)本組522例患者中，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其中EGFR突變、KRAS突變以及ALK融合的發(fā)生率較高，分別為47.32%、7.28%、5.17%。其中女性患者中EGFR突變率、ALK融合率明顯高于男性患者(P<0.001)；KRAS突變?cè)谀行曰颊咧械陌l(fā)生率顯著高于女性(P<0.001)；肺腺癌患者中EGFR、KRAS突變率明顯高于肺鱗癌患者(P<0.001)；EGFR突變、ALK融合在無吸煙史患者中的突變率顯著高于吸煙患者(P<0.05)。HER-2、NRAS、BRAF、PIK3CA、RET、ROS1突變率分別為1.72%、0.95%、0.57%、1.72%、1.34%、1.34%，這6種突變中均未發(fā)現(xiàn)與患者性別、組織學(xué)類型、吸煙史、臨床分期存在明顯相關(guān)性(表1)。

2.3 5例共突變基因狀態(tài)在早期研究中ALK、EGFR基因不存在共突變，但在實(shí)際檢測中可發(fā)現(xiàn)一些散在的共突變類型，本組522例NSCLC中有2例ALK、KRAS基因共突變(圖1)，2例ALK、EGFR共突變(圖2)及1例EGFR、KRAS共突變(圖3)。其中4例患者可以采用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療，但EGFR、KRAS共突變患者對(duì)EGFR TKIs藥物不敏感(表2)。

3 討論

肺癌已成為對(duì)人類健康威脅最大的惡性腫瘤之一，男性肺癌的發(fā)病率及病死率均居榜首，女性肺癌患者的發(fā)病率及病死率占惡性腫瘤的第二位，由此可見肺癌防治刻不容緩。隨著對(duì)靶向藥物研究的深入及運(yùn)用，患者的無瘤生存期明顯增加，病死率及復(fù)發(fā)率明顯降低。NCCN指南提出初治活檢中必須檢測的8種肺癌驅(qū)動(dòng)基因(包括EGFR、ALK、KRAS、ROS1、RET、BRAF、HER-2、NRAS)，目前已公認(rèn)基因靶向藥物可作為晚期NSCLC的一線選擇。因此準(zhǔn)確檢測肺癌這8種驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)已成為患者用藥的重要依據(jù)。ARMS-PCR聯(lián)合檢測NSCLC中9種驅(qū)動(dòng)基因方法的使用，可同時(shí)檢測9個(gè)基因的突變，縮短了檢測時(shí)間，節(jié)省了檢測成本。九基因聯(lián)合檢測的價(jià)格與單點(diǎn)檢測兩個(gè)基因的價(jià)格相近，同等成本下，九基因聯(lián)合檢測給患者帶來了更多的靶向用藥選擇。同時(shí)九基因聯(lián)合檢測還囊括了靶向用藥基因及相應(yīng)耐藥基因檢測，其中KRAS、PIK3CA突變會(huì)影響EGFR-TKIs的用藥效果，因此九基因聯(lián)合檢測可以更加準(zhǔn)確的為患者提供靶向用藥的選擇。

表1 非小細(xì)胞肺癌的9種驅(qū)動(dòng)基因突變者的臨床特征[n(%)]

表2 非小細(xì)胞肺癌中共突變患者臨床特征及靶向藥的選擇

圖1 (例2)ALK、KRAS共突變：A.HE圖；B.ALK、KRAS共突變檢測分子結(jié)果圖

圖2 (例3)ALK、EGFR共突變：A.HE圖；B.ALK、EGFR共突變檢測分子結(jié)果圖

圖3 (例5)EGFR、KRAS共突變：A.HE圖；B.EGFR、KRAS共突變檢測分子結(jié)果圖

在522例NSCLC患者中，EGFR突變率最高，占47.32%，其中腺癌患者EGFR突變率顯著高于其他類型，女性患者突變率明顯高于男性患者，未吸煙患者突變率高于有吸煙史患者。ALK基因融合率為5.17%，其融合率與Soda等[13]的報(bào)道相近。臨床EGFR、ALK抑制劑的使用給NSCLC患者的治療帶來了曙光，其他驅(qū)動(dòng)基因的改變也在臨床上得到相應(yīng)的研究及使用，并取得的不同程度的成功。EGFR-TKIs的治療效果受KRAS突變的牽制，而其突變率為7.28%，與國內(nèi)其他報(bào)道相似[14]。ALK融合與EGFR突變相似，女性患者突變率明顯高于男性，不吸煙患者明顯高于吸煙患者。相反的KRAS突變?cè)谀行曰颊咧械耐蛔兟拭黠@高于女性，吸煙患者高于不吸煙患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15-16]。九基因聯(lián)合檢測在單基因檢測基礎(chǔ)上增加了10.15%的患者可進(jìn)行靶向藥物選擇。較為罕見的突變類型HER-2、NRAS、BRAF、PIK3CA、ROS1、RET突變率分別為1.72%、0.95%、0.57%、1.72%、1.34%、1.34%，與以往文獻(xiàn)報(bào)道的突變率基本一致[17-20]。

早期EGFR突變和ALK融合被認(rèn)為是相互排斥的[21]，近期研究相繼否認(rèn)了此觀點(diǎn)[22-24]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了多種基因共突變的患者，其中ALK融合、EGFR突變同時(shí)存在的患者有2例，ALK融合伴KRAS突變的患者2例，EGFR、KRAS共突變患者1例。5例共突變患者中有4例患者可以進(jìn)行靶向藥物的選擇，其中ALK融合、EGFR突變2例患者中，1例80歲患者服用EGFR抑制劑(吉非替尼)5個(gè)月，服用前期呈現(xiàn)出良好效果，后期效果不佳，可能因?yàn)榛颊吣挲g偏高，對(duì)藥物的吸收有所下降，也有可能對(duì)其產(chǎn)生了相應(yīng)的耐藥。ALK、KRAS共突變患者并未選擇相應(yīng)的靶向藥物治療，ALK抑制劑價(jià)格高昂可能成為患者靶向治療的阻礙。EGFR、KRAS共突變患者由于KRAS屬于EGFR下游，對(duì)于EGFR抑制劑療效不佳。NSCLC患者九驅(qū)動(dòng)基因的聯(lián)合檢測，可以為患者提供更加準(zhǔn)確的治療方案，真正得益于靶向治療。