張容萍，李紅芳，吳世洲，魯富有，嚴(yán)達(dá)偉，陳培富

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2.普洱市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南普洱 665000；3.迪慶藏族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南香格里拉 674499）

腸氣泡病（pneumatosis cystoides intestine，PCI）又稱腸壁囊狀氣腫病、腸氣腫病[1]。在豬群中，這種病例非常少見(jiàn)，且通常只有宰后檢驗(yàn)時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。剖檢可見(jiàn)豬空腸和回腸段，尤其是在腸管與腸系膜連接處，出現(xiàn)直徑1～2 cm 的氣泡；在腸管漿膜下發(fā)生的氣泡多呈叢狀，而發(fā)生于腸管和腸系膜連接處的氣泡多形成葡萄串狀[2]。指壓氣泡均有捻發(fā)音。該病除散發(fā)于豬外，在羊和雞中也有報(bào)告。人也有類(lèi)似疾病[3]，稱為腸大泡性氣腫（bullous emphysea of intestine）、囊腫性淋巴積氣癥（cystic lymphopneumatosis）、腸氣腫（intestinal emphysema）、腹膜淋巴積氣癥（peritoneal lymphopneumatosis）等。國(guó)內(nèi)人的類(lèi)似疾病多見(jiàn)于兒童，嬰兒通常表現(xiàn)腹瀉癥狀，而成人基本不表現(xiàn)癥狀。近幾年，發(fā)生于人結(jié)腸的腸管氣囊腫癥病例報(bào)道不斷增多。

PCI 最早由日本池田義文和匈牙利胡體拉等學(xué)者于1980年發(fā)現(xiàn)和提出[1，4]，隨后國(guó)內(nèi)也陸續(xù)出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，但均只見(jiàn)于20 世紀(jì)80-90年代，且僅限于病理報(bào)告或組織形態(tài)描述，鮮有對(duì)其發(fā)病原因、致病機(jī)理等方面的研究報(bào)道。因不引起明顯的臨床癥狀，該病往往不被重視。國(guó)內(nèi)外屠宰檢疫人員認(rèn)為，此病并不影響胴體合格率，將腸道棄之，其余部分仍可銷(xiāo)售及食用。盡管如此，患病豬屠宰后仍會(huì)引起人們的感官不適以及對(duì)豬肉衛(wèi)生狀況的擔(dān)憂。近年在云南省多地不同品種豬中均零星發(fā)現(xiàn)該病，其中在香格里拉市發(fā)現(xiàn)病例較多。為探討其發(fā)病原因及致病機(jī)理，開(kāi)展了織病理學(xué)觀察與病原檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 樣品采集自香格里拉市某藏豬場(chǎng)屠宰時(shí)發(fā)現(xiàn)有腸氣泡病的4 頭出欄商品豬，包括肝素抗凝血液和有腸氣泡病變的小腸組織、腸系膜及其淋巴結(jié)，以及正常個(gè)體對(duì)照組織樣品。宰前臨床檢查時(shí)，未發(fā)現(xiàn)正常豬和患病豬在體溫、脈博、呼吸、精神、運(yùn)動(dòng)等方面存在明顯差異，也未見(jiàn)飼料（玉米為主）霉變及脂肪肝情況。但飼養(yǎng)人員報(bào)告患病豬在仔豬階段曾有腹瀉經(jīng)歷，估計(jì)發(fā)病率約為5%。

1.1.2 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST 5.0 病毒RNA/DNA 提取商品化試劑盒）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit），均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖膠回收試劑盒（TIANgel Midi purification kit DP209-02），購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；基于胰蛋白酶大豆胨瓊脂（TSA）的綿羊血瓊脂，為自行配制；引物，由昆明擎科生物公司合成。根據(jù)豬瘟病毒（CSFV）E2基因[5]、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）ORF3基因[6]、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）N基因[7]和輪狀病毒（RV）常見(jiàn)B 群VP6基因[8]，分別設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。依據(jù)文獻(xiàn)[9-12]的報(bào)道，合成細(xì)菌16S rRNA 通用引物和大腸桿菌腹瀉相關(guān)毒力基因引物（表2）。

表1 病毒核酸引物序列

表2 細(xì)菌16SrRNA 基因和毒力基因核酸引物序列

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸檢查 參照TaKaRa Mini BEST 5.0 病毒RNA/DNA 提取商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)，從組織樣品研磨液中提取病毒RNA；使用TaKaRa PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰盒上配置20 μL 反應(yīng)體系：Primerscript Ⅱ RTase 1 μL，5×PrimerScript Ⅱ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，oligo dT primer 1 μL，Ramdom 6 mers 1 μL，RNase free dH2O 9.5 μL，RNA 模板2 μL。反應(yīng)條件：30 ℃10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min。以cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增病毒核酸，反應(yīng)體系為：Mix 8.5 μL、ddH2O 8.5μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA 模板2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min 預(yù)變性，95 ℃ 40 s、53 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 細(xì)菌分離鑒定 分別取20 μL 血液、少許氣泡內(nèi)壁刮取物、氣泡根蒂組織及腸壁刮取物，涂布于血瓊脂平板表面作有氧培養(yǎng)，涂布于添加半胱氨酸鹽酸鹽的血瓊脂平板作無(wú)氧培養(yǎng)，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。將不同形態(tài)的菌落劃線轉(zhuǎn)種相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1～2 代，直至形成菌落形態(tài)完全一致的純培養(yǎng)物，再接種于麥康凱培養(yǎng)基或LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL 細(xì)菌懸液與50%滅菌甘油等體積混勻，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑹Ｓ嗑河糜诟锾m染色鏡檢、生化發(fā)酵管培養(yǎng)及其他檢查。生化試驗(yàn)包括，吲哚靛基質(zhì)、甲基紅（MR）、二乙酰（V-P）、三糖鐵瓊脂及其他糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)。以細(xì)菌DNA 為模板，配制擴(kuò)增16SrRNA基因的50 μL 體系：Mix 23 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA 模板2 μL、ddH2O 23 μL；PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，52 ℃45 s、72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 擴(kuò)增結(jié)果。對(duì)PCR 產(chǎn)物作膠回收，經(jīng)TA 克隆于pMD-18T，轉(zhuǎn)化Trans T-1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，從培養(yǎng)后的瓊脂平板，隨機(jī)挑選5～8個(gè)單菌落進(jìn)行質(zhì)粒DNA 測(cè)序，將所獲序列使用DNAstar（5.0）軟件進(jìn)行分析并在NCBI 網(wǎng)站作BLAST 在線比對(duì)。毒力基因PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：Mix 8 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min、退火（表2）1 min、70 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。玻片凝集試驗(yàn)：將被檢菌液于121 ℃加熱1 h，破壞其可能含有的K 抗原，取O 抗原10 μL 于玻片上，吸取10 μL 多價(jià)血清與之充分混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，于1 min 內(nèi)肉眼判斷結(jié)果，若出現(xiàn)凝集，再以單價(jià)血清作凝集試驗(yàn)。

1.2.3 病理學(xué)研究分析 將制作好的小腸及腸系膜石蠟組織切片做HE 染色，鏡下觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化情況。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢及鏡檢

腸氣泡病豬剖檢可見(jiàn)，輕癥個(gè)體在空腸和回腸腸管外表漿膜下有多量突起的氣泡，重癥個(gè)體在空腸和回腸段腸系膜有大量直1 cm 以內(nèi)的葡萄串狀透明氣泡，看似卵巢囊腫，有的在腹部脂肪組織也可看到類(lèi)似氣泡；戳破氣泡，未聞到任何氣味；氣泡壁和腸管壁有淤血（圖1），其余內(nèi)臟器官無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

圖1 腸氣泡病豬剖檢可見(jiàn)病變

光鏡觀察病理組織切片，可見(jiàn)患病豬腸管壁肌層和黏膜下層間充滿大小不一的氣泡，黏膜下層可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞增多（圖2-a）；正常腸系膜結(jié)構(gòu)呈規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排列，其間分布少量嗜酸性粒細(xì)胞，病變腸系膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)紊亂（圖2-b）；腸系膜細(xì)胞淤血，脂肪細(xì)胞體積增大，結(jié)締組織有大量炎性細(xì)胞滲出，見(jiàn)聚集的多核巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞，組織間隙較大，結(jié)締組織增生，成纖維細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增多，產(chǎn)生以慢性增生為主的炎癥病變（圖2-c）；小腸腸腺體積增大，杯狀細(xì)胞增多、體積明顯增大（圖2-d）；腸系膜淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞增多（圖2-e）。

圖2 組織切片形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2 病毒核酸檢測(cè)

從5 份腸道上皮組織及白細(xì)胞提取核酸樣品，進(jìn)行CSFVE2基因、TGEVN基因、PEDVORF3基因及RVVP6基因的PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果都為陰性。

2.3 細(xì)菌檢查

患病豬血液、氣泡根蒂組織及氣泡內(nèi)壁在血瓊脂平板上均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)；4 份病樣和1 份正常樣品的腸壁刮取物在血瓊脂平板上，有氧和無(wú)氧條件下均為形態(tài)特征一致、光滑濕潤(rùn)的乳白色單一菌落。生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株符合大腸桿菌特性。PCR 擴(kuò)增16SrRNA 獲得與目的片段預(yù)期大小相符的產(chǎn)物（圖3）。TA 克隆經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)，分離菌株為大腸桿菌。隨機(jī)挑取5個(gè)獨(dú)立菌落作PCR擴(kuò)增，未檢出致病性大腸桿菌常見(jiàn)的9種毒力基因。菌液也未與O157、H7、O104、H4 陽(yáng)性血清發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，表明不屬于這些常見(jiàn)的致病性大腸桿菌血清型。

圖3 分離菌株16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 分析與討論

該養(yǎng)豬場(chǎng)地處香格里拉市一座海拔約2 500 m的山坡上，晝夜溫差通常達(dá)10 ℃以上，距離縣城約100 km，與外界接觸甚少。據(jù)該養(yǎng)豬場(chǎng)養(yǎng)殖人員介紹，腸氣泡病的發(fā)病率為5%左右，冬季檢出率較高，且患有腸氣泡病的豬在仔豬階段常有腹瀉經(jīng)歷。本研究挑選仔豬階段有腹瀉經(jīng)歷的8 頭出欄豬進(jìn)行屠宰取樣，檢出4 頭患腸氣泡病，病變部位主要在空腸和回腸段腸系膜，其中1 頭在腹部脂肪組織也觀察到氣泡病變，進(jìn)一步檢查未發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)豬腹瀉相關(guān)病毒，僅從腸壁刮取物中分離到不屬于O157、H7、O104 或H4 血清群，且無(wú)常見(jiàn)致病基因的大腸桿菌。

豬腸氣泡病是一類(lèi)氣體代謝異常疾病，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。國(guó)外學(xué)者曾用致病性大腸桿菌感染無(wú)菌豬，得到的悉生豬在大腸腸壁出現(xiàn)氣泡囊腫，而其他內(nèi)臟器官均表現(xiàn)正常[13]，由此提出細(xì)菌學(xué)說(shuō)。本研究發(fā)現(xiàn)，從腸氣泡病豬中分離到的大腸桿菌并非常見(jiàn)致病血清型，且病變部位主要在小腸及其腸系膜，但不能排除大腸桿菌分離株可能存在其他或未知的毒力成分。本研究發(fā)現(xiàn)，腸腺及杯狀細(xì)胞體積明顯增大，這可能是患病個(gè)體小腸發(fā)生代償性分泌腸液（黏液）的組織形態(tài)表現(xiàn)，提示腹瀉相關(guān)因素對(duì)小腸產(chǎn)生了某種代謝壓力。值得一提的是，根據(jù)2017年英國(guó)科學(xué)家加爾文·科菲提出的觀點(diǎn)，腸系膜是一個(gè)連續(xù)但獨(dú)立的器官，而非腸道組織的附屬物[14]，其功能及病理意義尚不清楚，因此全面闡明腸氣泡病的發(fā)生機(jī)制可能需要從全新角度去考慮。

就本研究而言，基于大腸桿菌能分解乳糖、產(chǎn)生乳酸和氫氣的生化特性，推測(cè)可能由于當(dāng)?shù)貢円箿夭畲?，引起仔豬出現(xiàn)較大的胃腸冷熱應(yīng)激反應(yīng)，從而一方面造成仔豬腹瀉，另一方面形成利于腸內(nèi)大腸桿菌生長(zhǎng)的條件。大腸桿菌在腸道內(nèi)厭氧分解飼料中的糖類(lèi)，而產(chǎn)生大量不能被機(jī)體組織利用的氫氣，在腸內(nèi)形成較大的氫氣壓力。氫氣經(jīng)中央乳糜管吸收后游離進(jìn)入小腸漿膜層，因其組織結(jié)構(gòu)致密程度不一，從而形成大小不一的葡萄串狀氣泡，最終表現(xiàn)為腸氣泡病。本研究發(fā)現(xiàn)1 例病豬在其腹部脂肪組織也有氣泡形成，推測(cè)這可能是在特定壓力下，氣體在體內(nèi)擴(kuò)散的結(jié)果。本試驗(yàn)未檢測(cè)到大腸桿菌分離株有致病性，提示豬腸氣泡病基本不影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育，這與觀察到的實(shí)際情況一致。組織病理學(xué)觀察腸系膜及其淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞略有增多，提示腸氣泡病會(huì)伴發(fā)輕度炎癥。值得注意的是，盡管吉林、遼寧等平原地區(qū)[4，15]也有檢出該病的報(bào)道，但香格里拉市海拔較高，血氧分壓相對(duì)較低，這可能是腸氣泡病的一個(gè)促發(fā)因素，以致該地發(fā)生豬腸氣泡病的比例高于云南其他地區(qū)。按照類(lèi)似設(shè)想，有學(xué)者指出吸氧療法是早期祛除人腸管氣囊腫癥的有效療法[16]，但在豬中，如何防治腸氣泡病仍是一個(gè)需要繼續(xù)研究的課題。