肖培培，張夢圓，特列克·庫拉別克，劉世芳，宋晶晶，樊新麗，李 敏，張 楊

（1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所云南分所藥理中心，云南景洪 666100；4.西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，云南景洪 666100）

馬泰勒蟲（Theileria equi）屬頂復門、梨形蟲目、泰勒科、泰勒屬，是一種專性細胞內寄生原蟲[1]，寄生于馬、驢、騾和斑馬等馬屬動物的紅細胞、淋巴細胞內，引起蜱傳血液原蟲病——馬泰勒蟲病[2-3]。該病具有明顯的季節(jié)性及地區(qū)性，與媒介硬蜱的活動規(guī)律有關[4-5]?；疾游锱R床表現(xiàn)為發(fā)熱（多為稽留熱）、貧血、呼吸困難、水腫、血紅蛋白尿、黃疸及敗血癥，以及孕畜流產及新生幼畜死亡[6]。盡管患病動物臨床癥狀可經藥物治療后消失，但并不能清除患畜體內的病原體，其將終生攜帶病原[7]，這為該病的傳播及流行提供了條件。由于媒介蜱的廣泛存在，馬泰勒蟲病發(fā)病率不斷上升，流行區(qū)域也不斷擴大，嚴重制約了馬產業(yè)的發(fā)展[8]。目前沒有針對馬泰勒蟲病的有效疫苗，對馬泰勒蟲病的控制僅依賴于藥物治療、蜱媒控制以及限制受感染馬匹的移動。

棒狀體相關蛋白1（rhoptry-associated protein 1，RAP-1）位于頂復門原蟲裂殖子的棒狀體上，在子孢子階段也有表達，是蟲體與宿主紅細胞粘附后，由棒狀體分泌的，與入侵紅細胞相關的蛋白[9]。研究表明：RAP-1 蛋白包含多個抗原表位，可誘導機體產生體液免疫和細胞免疫；感染駑巴貝斯蟲的馬匹可產生針對RAP-1 蛋白的抗體，因此RAP-1 蛋白可用于駑巴貝斯蟲的血清學診斷[10]。對牛巴貝斯蟲RAP-1 與裂殖子表面抗原1（MSA-1）的研究表明，RAP-1 可能共同參與了裂殖子對紅細胞的侵襲過程[11]。對雙芽巴貝斯蟲RAP-1 直系同源物的研究表明：針對RAP-1 的單克隆抗體能夠在體外抑制蟲體增殖[12-13]；用天然的RAP-1 或重組融合蛋白免疫小牛，發(fā)現(xiàn)在裂殖子感染時，平均寄生蟲血癥峰值明顯減少[14-15]；用重組RAP-1 蛋白刺激淋巴細胞建立的T 細胞對牛巴貝斯蟲有應答，但對雙芽巴貝斯蟲裂殖子無應答，而通過用牛巴貝斯蟲膜抗原重復刺激淋巴細胞建立的T 細胞系可對RAP-1 強烈增殖，證明了該蛋白的免疫顯性特性[16]；用純化的牛雙芽巴貝斯蟲RAP-1 免疫牛，使其產生了部分保護性反應，因此RAP-1 被作為澳大利亞研制的重組疫苗中的抗原之一[17]。以上研究有力證明了RAP-1 在巴貝斯蟲生物學和發(fā)育過程中發(fā)揮了功能作用，作為免疫原性蛋白，參與對紅細胞的侵襲過程，被認為是潛在的候選疫苗抗原[18]。

由于頂復門原蟲裂殖子的表面蛋白或由細胞器所分泌的蛋白介導蟲體侵入宿主的紅細胞過程，因此這些蛋白被作為抗原蛋白或藥物靶點的研究重點。目前已經鑒定了巴貝斯蟲屬和瘧原蟲屬中的RAP-1 蛋白[19]，但關于馬泰勒蟲RAP-1 蛋白的研究目前開展較少。本研究擴增了馬泰勒蟲RAP-1基因片段；對重組蛋白進行了表達純化，檢測了其免疫原性，又以巴貝斯屬、泰勒屬、瘧原蟲屬的頂復門原蟲的RAP-1 蛋白為靶標，構建了進化樹；對RAP-1蛋白理化性質及結構進行了分析和預測，以期為進一步研究該蛋白的生物學功能或研制亞單位疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬泰勒蟲陽性血液、pET-32a（+）表達載體以及馬泰勒蟲標準陽性、陰性血清，均由新疆農業(yè)大學動醫(yī)學學院寄生蟲實驗室提供；pMD 19-T載體、DH5a 感受態(tài)細胞、限制性內切酶EcoRI 和XhoI、T4DNA 連接酶、Total RNA 提取試劑盒、Fast King RT Kit 反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；BL21 感受態(tài)細胞和Protein Marker，購自北京全式金生物技術有限公司；質粒小量提取試劑盒，購自OMEGA 生物試劑公司；2×EsTaqMaster Mix，購自康為世紀生物科技有限公司；HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column，購自上海翊圣生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗馬IgG，購自北京博奧森生物技術有限公司。所用水為超純水。

1.2 總RNA 提取

按照RNA 提取試劑盒說明書，提取馬泰勒蟲陽性血液樣品的總RNA。應用Fast King RT Kit 反轉錄試劑盒，以提取的RNA 為模板，合成第一鏈cDNA；cDNA 合成后分裝，一部分用于基因擴增，其余置于-80 ℃保存。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank 報道的馬泰勒蟲RAP-1基因序列和原核表達載體pET-32a（+）圖譜酶切位點，使用Oligo 軟件設計引物RAP-1-P1（5'-GAATTCCTCATAAGGCACAGAGAAA-3'） 和RAP-1-P2（5'-CCGCTCGAGAAGCTTAATCTCAGAGGG-3'）。加下劃線的序列分別對應EcoRI、XhoI 酶切位點。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 RAP-1 基因擴增

以1.2 制備的cDNA 為模板，用1.3 設計的引物，通過PCR 技術擴增RAP-1基因（95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min）。反應結束后，取5 μL PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.5 RAP-1 基因進化樹分析

選取頂復門原蟲駑巴貝斯蟲（B.caballi，登錄號GQ871780.1、KF059876.1），雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina，登錄號AB586126.1、KT312797.1），分歧巴貝斯蟲（B.divergens，登錄號HQ538420.1、HQ538430.1），惡性瘧原蟲（P.falciparum，登錄號FJ407006.1、GQ281628.1），牛巴貝斯蟲（B.bovis，登錄號FJ588009.1、L77326.1），馬泰勒蟲（T.equi，登錄號XM_004830353.1），應用MEGA 6.0 軟件，以選取的11種頂復門原蟲及本研究測定的RAP-1基因為靶標，以最大似然法構建進化樹。

1.6 RAP-1 蛋白理化特性和二、三級結構預測

運用在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/） 及ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/），分析蛋白的理化特性、親（疏）水性；用TMHMM 法，分析蛋白質跨膜區(qū)；運用DNAstar 軟件，預測分析RAP-1 蛋白的二級結構；用在線工具Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/），構建RAP-1 蛋白的三級結構模型；用PyMOL 分子三維結構，顯示軟件分析該蛋白的三維結構。

1.7 pET-32a-RAP-1 重組質粒構建

根據(jù)膠回收純化試劑盒說明書回收目的片段，用純化后的RAP-1 片段與克隆載體pMD 19-T連接，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，菌液鑒定為陽性的克隆，送至上海生工生物工程有限公司測序，將測序正確的克隆命名為19-T-RAP-1；根據(jù)質粒小提試劑盒說明書提取19-T-RAP-1、pET-32a（+）質粒，將重組質粒和pET-32a 載體雙酶切（EcoRI、XhoI），回收目的片段和空載體，用T4DNA 連接酶于16 ℃過夜連接，轉化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細胞；37 ℃培養(yǎng)12～14 h 后，挑取單個菌落，通過菌液PCR 鑒定陽性克?。惶崛≠|粒進行酶切驗證并測序，將經測序鑒定正確的重組質粒命名為pET-32a-RAP-1。

1.8 重組蛋白誘導表達及純化

將pET-32a-RAP-1 陽性菌液于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基（50 mL）中小量誘導，測定重組蛋白的表達情況。于37 ℃ 180 r/min 培養(yǎng)至OD 值達0.4～0.6 時，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導表達，然后分別收集1～7 h 的菌液進行SDS-PAGE 電泳分析；以最佳的誘導時間和濃度進行表達，超聲破碎菌體后離心，分別取上清和沉淀進行可溶性分析。

將pET-32a-RAP-1 陽性菌液擴培至400 mL 的含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，當OD 值達0.4～0.6 時，加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG，誘導2 h，離心收集誘導表達后的菌液；加10 mL 的破菌液，混勻，超聲破碎（功率為40 W，超聲5 s，間歇5 s，40 min）；8 000 r/min，4 ℃離心10 min，最后收集上清/沉淀進行蛋白純化。

1.9 Western-blot

取10 μL 重組蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳后，半干轉印于硝酸纖維素膜（NC 膜）上，用封閉液（5%脫脂乳，含0.5% Tween 的PBS 稀釋）封閉1 h，加馬泰勒蟲陽性血清作為一抗（1:100），37 ℃ 反應2 h；將二抗辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗馬IgG（HRP-兔抗馬IgG）用5%脫脂乳1:6 000 稀釋，37 ℃ 孵育1.5 h；最后，于DAB 顯色液中37 ℃避光孵育5 min，觀察結果。

2 結果

2.1 RAP-1 基因擴增

PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，得到1 236 bp 的片段（圖1），與預期片段大小一致。

2.2 遺傳進化分析

分別選取巴貝斯屬、泰勒屬及瘧原蟲屬的頂復門原蟲RAP-1基因序列（登錄號GQ871780.1、KF059876.1、AB586126.1、KT312797.1、HQ538420.1、HQ538430.1、FJ407006.1、GQ281628.1、FJ588009.1、L77326.1、XM_004830353.1），應用MEGA 6.0 軟件構建進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果顯示：本試驗所得RAP-1基因序列與GenBank 上發(fā)表的馬泰勒蟲序列聚為一支，置信度為100%；巴貝斯屬的不同蟲株相聚類，馬泰勒蟲蟲株與惡性瘧原蟲蟲株相聚類，表明兩者親緣關系較近（圖2）。

圖2 運用最大似然法構建的RAP-1 基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 RAP-1 蛋白理化特性和二、三級結構預測分析

蛋白理化性質結果顯示，RAP-1 蛋白理論等電點為9.85，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為43.33，總平均親水性為-0.368。ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的親（疏）水性結果顯示（圖3-A）：MIN 為-2.600，MAX 為2.011；由圖可以看出，標度值＜0 的區(qū)域與＞0的區(qū)域相比較為密集，結合理化性質中的總平均親水性（GRAVY）值，總體上認為是親水性蛋白。使用TMHMM 法分析蛋白質跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)氨基酸位于細胞膜表面，無跨膜區(qū)（圖3-B）。二級結構（圖3-C）顯示：RAP-1 蛋白結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲4種類型，占比分別為38.5%、15.5%、27.8%、18.1%。通過Swiss model軟件，對馬泰勒蟲RAP-1 蛋白進行同源建模，用PyMOL 分子三維結構顯示軟件，對該蛋白的三維結構進行比對分析。結果（圖3-D）顯示：藍色為α-螺旋結構、β-折疊結構，紅色標注位置為半胱氨酸所在位置。該蛋白結構比較簡單，在RAP-1三級結構中α-螺旋占據(jù)較多構象。

圖3 馬泰勒蟲RAP-1 理化特性和二、三級結構預測分析結果

2.4 重組質粒雙酶切

重組質粒經過EcoRI 和XhoI 雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果得到兩條特異性條帶（圖4），表明目的基因RAP-1插入到表達載體pET-32a（+）中，并測序成功，說明重組質粒pET-32a-RAP-1 構建成功。

2.5 RAP-1 重組蛋白SDS-PAGE 誘導表達

將pET-32a-RAP-1 陽性菌液加入含100 μg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃ 培養(yǎng)至OD 值達到0.4～0.6 時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 進行誘導表達，篩選誘導時間；于不同IPTG 濃度下誘導表達，篩選最佳誘導時間。SDS-PAGE 分析結果顯示，以終濃度為0.4 mmol/L IPTG 誘導2 h 時，蛋白表達量最高（圖5～6）。誘導后的表達產物大小約65 kDa，與其理論值基本一致。選用最佳誘導時間和誘導濃度，經過超聲破碎，離心分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測，結果發(fā)現(xiàn)沉淀中表達蛋白雜帶較少，表達蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體蛋白（圖7）。

2.6 重組蛋白純化

使用鎳柱純化試劑盒純化濃縮蛋白，將制備樣品進行SDS-PAGE 電泳，收集后檢測其濃度。純化結果見圖8。

圖6 重組蛋白最佳誘導濃度

圖7 重組蛋白最佳誘導時間和IPTG 濃度誘導后可溶性蛋白分析結果

2.7 表達產物Western-blot 分析

用破菌液懸浮收集菌體，超聲破碎至半透明狀態(tài)，進一步處理表達產物，經SDS-PAGE 電泳后轉移至NC 膜上。結果表明，馬泰勒蟲陽性血清與蛋白反應，在65 kDa 處有條帶出現(xiàn)（圖9），表明該重組蛋白具有特異性和反應原性。

圖8 pET-32a-RAP-1 重組蛋白純化結果

圖9 pET-32a-RAP-1 重組蛋白Western-blot 結果

3 討論

頂復門原蟲的分泌型細胞器棒狀體和微線體在蟲體侵入宿主紅細胞過程中分泌的，與入侵相關的保守蛋白——棒狀體相關蛋白（rhoptry associated protein，RAP）可與微線體頂端膜抗原（microneme protein apical membrane antigen，AMA1）形成運動結合體，在蟲體入侵過程中發(fā)揮關鍵作用[20]。棒狀體相關蛋白被認為是保護蟲體侵入以及入侵后期進行繁殖的關鍵分子，在納蟲空泡形成過程中發(fā)揮重要作用，被認為是侵入宿主細胞的主要毒力因子[21]。在頂復門原蟲RAP 的研究中，弓形蟲、瘧原蟲和柔嫩艾美耳球蟲的RAP 研究較深入。以往的相關研究成果表明了棒狀體蛋白在抵御蟲體侵入和免疫保護方面起到了關鍵作用，指明RAP 研究將作為未來疫苗及診斷抗原研究的重要方向[22-24]。目前對RAP 的研究主要集中在RAP 對宿主侵入功能等的初步驗證，尚無對宿主細胞相互作用影響的文獻發(fā)表。本試驗結果表明，原核表達所獲得的融合蛋白RAP-1 分子質量為65 kDa；Western-blot 分析結果表明，該重組蛋白能被馬泰勒蟲標準陽性血清識別，具有良好的反應原性。對以巴貝斯屬、泰勒屬及瘧原蟲屬頂復門原蟲RAP-1基因為靶標構建的進化樹的結果顯示，巴貝斯蟲屬的不同蟲株相聚類，惡性瘧原蟲與馬泰勒蟲蟲株序列相聚類。與巴貝斯蟲相比，惡性瘧原蟲與馬泰勒蟲這兩種蟲體的入侵方式可能更為相似，其原因還有待研究。RAP-1 的二級結構預測結果顯示：其含有豐富的α-螺旋和β-轉角，推測該蛋白性質穩(wěn)定；三級結構的構建直觀立體地展現(xiàn)了RAP-1 的形態(tài)，為進一步研究該蛋白功能提供可視化依據(jù)。RAP-1基因的獲得為我國馬泰勒蟲病的流行病學調查、免疫學診斷、篩選藥物靶標，以及該基因在入侵中的明確作用、疫苗候選奠定了基礎。