【摘要】利什曼原蟲減毒活疫苗因其保留了大部分免疫原性，能感染巨噬細(xì)胞，誘發(fā)與自然感染類似的免疫應(yīng)答而受到眾多科學(xué)家的青睞。本文綜述了近年來減毒活疫苗的研究進(jìn)展。

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.05.04

基金項目:國家自然科學(xué)基金(30872213)

收稿日期: 2015－07－20

作者簡介:劉鵬(1990－)，男，四川南充人，碩士研究生，主要從事杜氏利什曼原蟲免疫蛋白組學(xué)研究。

通訊作者:敬保遷，E-mail: bqjing@ nsmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-10-26 17∶14

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20151026.1714.008.html

Advances in the research of Leishmania live attenuated vaccine

LIU Peng，JING Bao-qian

(Institute of Immunology and Molecular Biology，North Sichuan Medical college，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Leishmania live attenuated vaccines remain the most of parasitic immunogenecity and can enter into the macrophage that is similar to natural infection，which have interested many researchers.This paper reviews the study of the newest attenuated strains.

【Key words】Leishmaniasis; Genetic live attenuated vaccine; Physicochemical attenuation

利什曼原蟲包含26個種株，所致利什曼病在全球98個國家傳播。傳統(tǒng)藥物治療存在費用昂貴、毒副作用、藥物耐受等問題，疫苗仍是未來控制利什曼病的主要手段 ［1］。在抗利什曼病疫苗研制過程中，死疫苗雖然安全性高，但對人免疫原性低，已宣告失敗 ［2］;通過皮下接種體外培養(yǎng)的活蟲(leishmanization)也因接種處皮膚常發(fā)展成難治性皮損而被叫停 ［3］;目前雖有三個重組亞單位疫苗得到應(yīng)用許可，但僅限于犬利什曼病的免疫治療或預(yù)防 ［4］，少數(shù)重組疫苗雖進(jìn)入人體I期臨床試驗，并表現(xiàn)出免疫原性，但其對人群保護(hù)率仍需進(jìn)一步評價 ［5］; DNA疫苗因難以刺激產(chǎn)生有效的抗利什曼病免疫力，發(fā)展前景堪憂 ［6］。近年來通過基因敲除、基因過表達(dá)及其它理化方法等進(jìn)行減毒的利什曼原蟲活疫苗，由于它們在體內(nèi)的活動與自然感染相似，有良好的免疫保護(hù)潛能，總體上安全，預(yù)示發(fā)展前景較好。現(xiàn)綜述如下。

1　基因減毒疫苗

1.1　碩大利什曼原蟲脂磷酸多糖基因敲除株

利什曼原蟲表面的脂磷酸多糖(lipophosphoglycan，LGP)與磷酸多糖(phosphoglycan，PG)為原蟲感染宿主細(xì)胞成份，LGP1、LGP2及LGP3基因的編碼蛋白分別參與其合成。Uzonna等以敲除LGP2基因的碩大利什曼原蟲感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)長期維持低量蟲荷數(shù)，并可抵抗碩大利什曼原蟲野生株的攻擊感染 ［7－8］。而Spath等 ［9］以該減毒10 6感染8只BALB/c小鼠，有3只在免疫125 d后出現(xiàn)進(jìn)行性皮損，可見該減毒株存在長期毒性。并且，Thomas等 ［10］發(fā)現(xiàn)敲除LGP1基因的墨西哥利什曼原蟲并未被減毒，進(jìn)一步說明通過敲除利什曼原蟲LGP基因發(fā)展減毒活疫苗的安全性存疑，其主要原因可能與不同種株原蟲間LGP的表達(dá)存在差異有關(guān) ［11］。

1.2　墨西哥利什曼原蟲半胱氨酸蛋白酶基因敲除株

利什曼原蟲半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase，CP)包括CPA、CPB及CPC，參與原蟲自噬體形成及前鞭毛體向無鞭毛體的轉(zhuǎn)化 ［12］。Alexander等 ［13］以墨西哥利什曼原蟲CPA與CPB基因敲除株感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)CPA-株可致病，而CPB-或CPA-/CPB-株對BALB/c小鼠弱致病或不致病，與墨西哥利什曼原蟲野生株感染相比，減毒株感染小鼠的免疫類型從Th2型轉(zhuǎn)化成Th1型，并能抵抗墨西哥利什曼原蟲野生株的攻擊感染。Saravia等 ［14］以墨西哥利什曼原蟲CPB -或CPA -/CPB -株感染金黃地鼠后，疾病發(fā)生延遲，而且病損減輕，蟲荷下降;感染人巨噬細(xì)胞，原蟲保持前鞭毛體狀態(tài)，生長緩慢。并且，墨西哥利什曼原蟲CPA -/CPB -株免疫金黃地鼠后，其Th2型相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β表達(dá)水平顯著下降，對墨西哥利什曼原蟲野生株攻擊感染的免疫保護(hù)率可達(dá)63.6%。說明利什曼原蟲半胱氨酸蛋白酶基因敲除株對小鼠、金黃地鼠及人的致病力顯著減弱，具有減毒活疫苗發(fā)展前景。

1.3　嬰兒利什曼原蟲熱休克蛋白70-II基因敲除株

熱休克蛋白70(hot shock protein 70，HSP70)在原蟲無鞭毛體期表達(dá)，阻止無鞭毛體內(nèi)蛋白的錯誤折疊并參與受損蛋白的降解 ［15］。Folgueira等 ［16］敲除嬰兒利什曼原蟲的HSP70-II基因后，原蟲形態(tài)轉(zhuǎn)變成橢圓形、雙鞭毛的畸形蟲體。與野生株相比，其感染巨噬細(xì)胞能力不變但生存能力降低。以10 7嬰兒利什曼原蟲HSP70-II -株感染BALB/c小鼠，4周后，肝臟蟲荷數(shù)較野生株降低1 000倍，脾臟未見原蟲。Carrion等 ［17］以10 7嬰兒利什曼原蟲HSP70-II -株免疫5只BALB/c小鼠，4周后以碩大利什曼原蟲攻擊感染，除1只小鼠在感染后第七天出現(xiàn)約0.25 mm 2的皮損外，其它無皮損，而單純感染碩大利什曼原蟲的對照組平均皮損面積約2.5～3.0 mm 2。可見該株能產(chǎn)生抗野生型碩大利什曼原蟲的交叉免疫保護(hù)。

1.4　杜氏利什曼原蟲p27蛋白基因減毒株

p27是線粒體內(nèi)膜單跨膜蛋白，細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合酶的組成部份，在氧化呼吸鏈中通過傳遞H +而合成ATP。由于p27是利什曼原蟲無鞭毛體期特異表達(dá)蛋白，原蟲通過其增加ATP合成，通過質(zhì)子泵交換來抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境 ［18］。Dey等 ［19］以杜氏利什曼原蟲p27 -/-株感染BALB/c小鼠，13周后，肝臟中蟲荷約為對照組的1.25%，脾臟無原蟲，16周后肝脾均無原蟲，說明其毒力明顯降低。以Ldp27 -/-株免疫BALB/c小鼠后，用野生型杜氏利什曼原蟲攻擊感染，與對照組比較，12周后實驗組肝脾內(nèi)蟲荷數(shù)分別降低了300～10 4倍。20周后實驗組肝脾內(nèi)無原蟲 ［20］。并且，實驗組Th1型CD4 +及CD8 +T細(xì)胞數(shù)量高于對照組，將上述實驗組小鼠T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給未經(jīng)免疫的小鼠，后者亦對利什曼原蟲感染產(chǎn)生免疫保護(hù)。Ldp27 -/-株免疫后以碩大利什曼原蟲、巴西利什曼原蟲攻擊感染，亦存在交叉免疫保護(hù) ［21］。

1.5　杜氏利什曼原蟲類泛素折疊修飾蛋白1基因缺陷株與杜氏利什曼原蟲特異性泛素折疊修飾蛋白

1蛋白酶基因缺陷株

線粒體三功能蛋白(mitochondrial tri-functional protein，MTP)是脂肪酸中氧化加水、脫氫、硫解的關(guān)鍵酶，杜氏利什曼原蟲類泛素折疊修飾蛋白1 (Ubiquitin fold modifier1，Ufm1)活化后與MTP的α-亞基共價結(jié)合而調(diào)節(jié)線粒體脂肪酸代謝。Ufm1或特異性Ufm1蛋白酶(Ufm1-specific protease，Ufsp)缺陷后MTP活性降低，乙酰輔酶A(acetyl-CoA)合成減少，原蟲生存能力降低 ［22］。Gannavaram等 ［23］完全敲除杜氏利什曼原蟲Ufm1基因，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)LdUfm1 -/-株3 d后即停止增殖，乙酰輔酶A合成量低于0.5 pmol/μL，對照組高于2.5 pmol/μL。LdUfm1 -/-巨噬細(xì)胞感染率與對照組一致，但隨后原蟲數(shù)量逐漸降低，至第7天已無原蟲。電鏡下核分裂障礙，線粒體形態(tài)改變。將杜氏利什曼原蟲Ufsp基因完全敲除后，亦喪失與MTP結(jié)合的能力，原蟲在體外培養(yǎng)第5天后停止增殖，感染巨噬細(xì)胞能力下降，感染BALB/c小鼠，4周后肝脾蟲荷數(shù)比野生蟲株對照組分別下降100倍、20倍 ［24］。說明剔除與脂肪酸代謝相關(guān)基因的利什曼原蟲具有發(fā)展減毒活疫苗的前景。

1.6　嬰兒利什曼原蟲細(xì)胞胞漿內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)子

2單等位基因缺陷株

細(xì)胞胞漿內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)子2(silent information regulatory 2，SIR2)具有NAD依耐的組氨酸去乙酰化酶活性，在基因轉(zhuǎn)錄沉默和DNA修復(fù)中發(fā)揮作用 ［25］。Vergnes等 ［26］發(fā)現(xiàn)將嬰兒利什曼原蟲SIR2雙等位基因完全敲除后則形成致死性敲除，而將原蟲SIR2單等位基因敲除后，則不影響前鞭毛體的生長，但無鞭毛體在體外巨噬細(xì)胞內(nèi)和Balb/c小鼠體內(nèi)增殖能力顯著下降，BALB/c小鼠感染嬰兒利什曼原蟲LiSIR2 + /－株，8周后肝脾已無蟲荷。說明SIR2基因是影響無鞭毛體增殖和生存相關(guān)基因。Silvestre等以嬰兒利什曼原蟲LiSIR2 + /-株免疫4只BALB/c小鼠后，用野生型嬰兒利什曼原蟲攻擊感染10周后，全部小鼠肝脾均無原蟲，對照組小鼠單純接受嬰兒利什曼原蟲感染，其肝脾蟲荷分別高達(dá)10 5、10 6［27］。說明嬰兒利什曼原蟲LiSIR2 + /－株具有發(fā)展抗內(nèi)臟利什曼病減毒活疫苗的潛力。

1.7　巴西利什曼原蟲小外顯子基因過表達(dá)減毒株

反式剪接是錐蟲科原蟲基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，其中，小外顯子基因(miniexon gene)通過對動基體多順反子前mRNA添加5＇末端，為每個mRNA分子提供5＇冒狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)其成熟。先前Antoniazi等 ［28］通過基因重組方式在碩大利什曼原蟲內(nèi)過量表達(dá)小外顯子基因，發(fā)現(xiàn)原蟲對Balb/c小鼠的毒力減低; de Toledo等將含100個拷貝的小外顯子基因重組至巴西利什曼原蟲，原蟲能正常生長但對BALB/c小鼠及金黃地鼠致病力降低。BALB/c小鼠耳部皮下接種10 5該減毒株，在2～8周間耳與淋巴結(jié)均無蟲荷; 10只金黃地鼠皮下接種10 7該減毒株后，除兩只金黃地鼠出現(xiàn)較小皮損外，其它地鼠無皮損。Northern雜交證實上述出現(xiàn)皮損的兩只地鼠體內(nèi)的原蟲不再過量表達(dá)小外顯子基因 ［29］。故該減毒株雖減毒有效，但有恢復(fù)毒力的風(fēng)險。

1.8　杜氏利什曼原蟲中心體蛋白基因缺失株

利什曼原蟲中心體蛋白(centrin protein，CP)為調(diào)節(jié)中心體復(fù)制與分裂的鈣結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白，與原蟲生長密切相關(guān) ［30］。Selvapandiyan等 ［31］以3× 10 6杜氏利什曼原蟲LdCP -/-株感染BALB/c小鼠，12周后肝脾無原蟲，而野生型杜氏利什曼原蟲的對照組蟲荷數(shù)達(dá)10 4～10 6。經(jīng)杜氏利什曼原蟲Ld-CP -/-株免疫接種后的BALB/c小鼠，以3×10 6野生型杜氏利什曼原蟲攻擊感染，12周或16周后肝臟無原蟲，脾臟蟲荷數(shù)較對照組降低了一半。而以杜氏利什曼原蟲LdCP －/－株免疫犬后，可刺激犬產(chǎn)生高水平的IgG1和IgG2，高水平的淋巴細(xì)胞刺激反應(yīng)，IFN-γ、TNF-α、IL-12分泌增加，IL-4分泌下降 ［32］。以嬰兒利什曼原蟲對免疫接種后的實驗犬進(jìn)行攻擊感染，18個月后蟲荷數(shù)下降達(dá)83.7% ［33］。說明杜氏利什曼原蟲LdCP -/-株也具有發(fā)展抗內(nèi)臟利什曼病減毒活疫苗的潛力。

2　物理、化學(xué)處理減毒

2.1　杜氏利什曼原蟲γ射線減毒株

Datta等 ［34］以150 Gy吸收劑量的γ射線處理杜氏利什曼原蟲，原蟲5 d后停止生長，以該減毒株免疫小鼠后，用2×10 6野生型杜氏利什曼原蟲攻擊感染，120 d后小鼠肝、脾重量較對照組減輕了33%、39%，蟲荷數(shù)降低了87%、88%，IFN-γ、IL-2與TNF-α比對照組分別上升了4倍、2.6倍、3.9倍;而IL-4與IL-10分別是對照組的68%、50%。說明該減毒株能刺激小鼠產(chǎn)生以Th1型反應(yīng)為主的免疫保護(hù)力。并且，以該減毒株兩次肌肉注射(間隔時間15 d)治療小鼠內(nèi)臟利什曼病，治療后NO與超氧化物量增加了兩倍，脾臟蟲荷數(shù)較病鼠降低約80% ［35］。可見γ射線減毒的杜氏利什曼原蟲能夠預(yù)防和治療小鼠內(nèi)臟利什曼病。

2.2　嬰兒利什曼原蟲雖死猶活株

Brockstedt等 ［36］最初發(fā)現(xiàn)李斯特氏菌在uvrAB等核酸修復(fù)酶基因表達(dá)缺失狀況下，以DNA交聯(lián)劑補骨脂和長波紫外線進(jìn)行光化學(xué)處理，細(xì)菌失去增殖能力，但短時體內(nèi)代謝活性仍維持，稱為雖死猶活菌(Killed but metabolically active，KBMA)。它可誘導(dǎo)CD4 +和CD8 +T細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)小鼠免受病毒感染。Bruhn等 ［37］在含100 nM補骨脂衍生物S-59的培養(yǎng)基中培養(yǎng)嬰兒利什曼原蟲1 h，以5.4 J/cm 2紫外光照射后得到嬰兒利什曼原蟲KBMA株，其代謝活性可維持21 d，并能感染巨噬細(xì)胞。以該株10 7接種小鼠，2周后CD4 +T細(xì)胞、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12量與野生株感染相似; 6個月后實驗組小鼠肝脾無原蟲，大小正常;野生株對照組肝臟蟲荷數(shù)2.6×10 7±0.6×10 7，脾中蟲荷數(shù)2.0×10 7± 0.5×10 7，肝脾明顯腫大。以10 7嬰兒利什曼原蟲KBMA株皮下免疫小鼠3次后，以10 7嬰兒利什曼原蟲野生株感染小鼠，對照組以生理鹽水注射3次后接受原蟲感染。2周和8周后實驗組肝臟原蟲分別約降低了0.4倍、0.6倍，說明這類利什曼原蟲全細(xì)胞疫苗安全可靠，雖其對小鼠免疫保護(hù)還不甚理想，但還是顯示出具有進(jìn)一步研究價值 ［38］。

2.3　利什曼原蟲慶大霉素減毒株(H株)

慶大霉素通過下調(diào)利什曼原蟲依賴錐蟲氧還蛋白過氧化物酶(tryparedoxin dependent peroxidase，LiTryP)表達(dá)，導(dǎo)致原蟲對巨噬細(xì)胞內(nèi)過氧化物清除障礙 ［39］。Daneshvar等 ［40］在含20 μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)墨西哥利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲、杜氏利什曼原蟲至20、11、11、10代時得到減毒株(H株)前鞭毛體。墨西哥利什曼原蟲H株對巨噬細(xì)胞感染率在感染后9～96 h內(nèi)由53%減至0.4%，無鞭毛體的數(shù)量由98%降至2%。碩大利什曼原蟲H株、嬰兒利什曼原蟲H株、杜氏利什曼原蟲H株亦出現(xiàn)下降趨勢。用5×10 6墨西哥利什曼原蟲H株或碩大利什曼原蟲H株分別皮下感染5只BLAB/c小鼠，12周后墨西哥利什曼原蟲實驗組的4只小鼠無皮損，1只自限性輕微皮損;碩大利什曼原蟲實驗組5只小鼠均無皮損。而對照組的10只小鼠均出現(xiàn)逐漸擴(kuò)大的皮損。將嬰兒利什曼原蟲H株分別經(jīng)靜脈或皮下感染敏感實驗動物犬，對照組經(jīng)靜脈或皮下接種野生型嬰兒利什曼原蟲，在觀察期間實驗組均無臨床癥狀，12個月后解剖發(fā)現(xiàn)肝脾無病理變化，亦無蟲荷，而對照組部分出現(xiàn)臨床癥狀，病犬肝脾均有病理改變 ［41］。以墨西哥利什曼原蟲H株或碩大利什曼原蟲H株免疫小鼠后分別用碩大利什曼原蟲野生株和墨西哥利什曼原蟲野生株攻擊感染，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)減毒株接種后對小鼠有顯著免疫保護(hù)作用 ［40］。以嬰兒利什曼原蟲H株大規(guī)模免疫46只實驗犬后，投放至流行區(qū)，僅一只出現(xiàn)臨床癥狀，PCR檢測陰性。而未經(jīng)嬰兒利什曼原蟲H株免疫的31只實驗犬，投放到流行區(qū)后，1只犬因CVL在19個月死亡，另9只犬出現(xiàn)臨床癥狀，PCR檢測陽性。說明嬰兒利什曼原蟲H株免疫實驗犬可產(chǎn)生明顯保護(hù)免疫，保護(hù)率達(dá)97.8% ［42］。

3　結(jié)語

利什曼原蟲專性細(xì)胞內(nèi)寄生，保護(hù)性免疫應(yīng)答以細(xì)胞免疫為主。無癥狀感染者與利什曼病痊愈者對再次感染可產(chǎn)生完全免疫保護(hù)，成功研制抗利什曼病疫苗的可能性較大。減毒活疫苗具有強烈刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答潛能，但通過理化等方法進(jìn)行減毒的利什曼原蟲疫苗株具有毒力回復(fù)突變的潛在危險，通過對毒力基因敲除等方法進(jìn)行減毒的利什曼原蟲疫苗株，雖減毒穩(wěn)定，但由于毒力基因的表達(dá)存在種株差異和生活史時期差異，敲除不同種株利什曼原蟲同一毒力基因減毒效果迥異 ［11］。從在不同種株和生活史時期表達(dá)穩(wěn)定，且對原蟲生命影響較小的毒力基因中選擇靶基因研制抗利什曼病減毒活疫苗顯得尤為重要。