李碧鳳，趙 敏，張立喜，袁正春，張紹衛(wèi)，盧家彥

（1.文山壯族苗族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南文山 663000；2.硯山縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南硯山 663100）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性動(dòng)物傳染病。ASF 最早于1921年在肯尼亞首次報(bào)道，并從非洲相繼擴(kuò)散到歐洲、美洲和亞洲，2018年首次傳入我國(guó)，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報(bào)動(dòng)物疫病，是我國(guó)的一類(lèi)動(dòng)物疫病。ASF 發(fā)病率和病死率可高達(dá)100%[1]，且因無(wú)有效疫苗和藥物治療，其擴(kuò)散和流行對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性打擊，嚴(yán)重困擾養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展，影響著豬肉產(chǎn)品的安全與供給。

基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室是動(dòng)物疫病防控的技術(shù)保障與根基。目前，基層獸醫(yī)診斷技術(shù)主要有臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)?；鶎荧F醫(yī)的臨床診斷技術(shù)對(duì)非洲豬瘟的早期監(jiān)測(cè)與排查具有重要意義。基層獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的有效運(yùn)轉(zhuǎn)及PCR 檢測(cè)技術(shù)的充分運(yùn)用，為基層有效預(yù)防、控制和撲滅ASF 疫情，維護(hù)養(yǎng)豬業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2017年9 月，文山壯族苗族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建成并投入使用，并首先將分子生物學(xué)PCR 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于禽流感的監(jiān)測(cè)預(yù)警[2]。當(dāng)前可靠性最佳的ASF 診斷技術(shù)是基于核酸檢測(cè)的PCR 和定量PCR 技術(shù)[3]。2019年5月23 日，云南省文山壯族苗族自治州硯山縣維摩鄉(xiāng)散養(yǎng)戶(hù)飼養(yǎng)的豬發(fā)生疑似ASF 疫情。文山壯族苗族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用PCR 核酸檢測(cè)技術(shù)結(jié)合臨床剖檢，對(duì)該起疫情進(jìn)行了初步診斷。這是對(duì)中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理體系、PCR 檢測(cè)綜合能力的一次考驗(yàn)與檢驗(yàn)?？偨Y(jié)此次文山州首例ASF 病例的緊急檢測(cè)工作經(jīng)驗(yàn)，可為發(fā)揮基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在防控ASF 等重大動(dòng)物疫病中的作用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 臨床觀察與剖檢

赴現(xiàn)場(chǎng)向養(yǎng)殖戶(hù)詢(xún)問(wèn)疫情發(fā)生情況、病豬臨床表現(xiàn)。對(duì)一飼養(yǎng)戶(hù)養(yǎng)殖的2 頭白毛家豬，另一戶(hù)養(yǎng)殖的2 頭黑毛家豬，共4 頭病死豬進(jìn)行剖檢。

1.2 PCR 檢測(cè)

1.2.1 試劑與儀器設(shè)備 （1）PCR 試劑：PremixTaq（TaKaRa）、磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒（BioTeke）、無(wú)DNase/RNase 水（PCR 級(jí)別）。（2）引物：由云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。擴(kuò)增ASFVVP72基因長(zhǎng)度為257 bp 的DNA 片段；使用前，稀釋至工作濃度為20 pmol/L，分裝后-20 ℃儲(chǔ)存。（3）陽(yáng)性和陰性對(duì)照：由云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。（4）儀器設(shè)備：生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、全自動(dòng)核酸提取儀（BioTeke AU1001）、梯度PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、超低溫冰箱、移液器、高壓滅菌器等。

1.2.2 樣品處理 病原樣品：2 頭病死豬均為肥豬（黑、白家豬各1 頭）。分別采集2 頭病豬的脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟共8個(gè)樣品送檢。病原組織樣品研磨處理：將病原樣品編號(hào)，使用高壓滅菌的剪刀和研缽，分別取適當(dāng)組織樣品剪碎于研缽中，研磨至勻漿狀態(tài)，對(duì)應(yīng)編號(hào)，保存于2 mL 滅菌離心管中備用。

1.2.3 樣品DNA 提取 將離心管中的組織勻漿樣品，對(duì)稱(chēng)放置于冷凍離心機(jī)，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min；每個(gè)樣品取200 μL 上清液至磁珠法病毒DNA 提取試劑盒中，按試劑盒要求加入25 μL酶，最后放入全自動(dòng)核酸提取儀中，設(shè)置DNA 提取程序，啟動(dòng)全自動(dòng)核酸提取儀，提取病原樣品DNA；程序運(yùn)行結(jié)束后，將提取的核酸保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR 體系配置 在滅菌的1.5 mL 離心管中，制備以下符合試驗(yàn)樣本量（包括陽(yáng)性、陰性對(duì)照等）的PCR 反應(yīng)混合物（23 μL）：無(wú)DNase/RNase 水9.5 μL、PremixTaq酶12.5 μL、正 向引 物PPA-1（20 pmol/L）0.5 μL、反向引物PPA-2（20 pmol/L）0.5 μL。配置步驟：將23 μL PCR 反應(yīng)混和液加入到0.2 mL PCR 管中，再將2 μL DNA 模板加入到PCR 管中，另設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照；每管加入2 μL 模板后，密封反應(yīng)管，瞬時(shí)離心；將所有PCR 管放在PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 PCR 擴(kuò)增條件 50 ℃ UNG 酶孵育2 min，95 ℃Taq酶激活10 min；95 ℃ DNA 變性15 s，62 ℃引物退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)7 min。

1.2.6 凝膠電泳及成像 分別取7 μL 混勻的PCR產(chǎn)物加入到1×TAE 緩沖液配制的2%瓊脂糖凝膠中電泳30～40 min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀與剖檢

經(jīng)向養(yǎng)殖戶(hù)詢(xún)問(wèn)得知，豬病死前2～3 d，有厭食、喜臥、疲憊以及偶有嘔吐等癥狀。對(duì)4 頭病死豬臨床觀察發(fā)現(xiàn)，病死豬體表均出現(xiàn)紫色瘀斑（圖1）。剖檢發(fā)現(xiàn)，脾臟異常腫大（大5～10 倍），顏色發(fā)黑，質(zhì)脆易碎（圖2）；肺臟腫大，腎臟腫脹明顯、色淡，有少量出血點(diǎn)（圖3）；胸腔、心包腔內(nèi)有積液。

圖1 病豬體表出現(xiàn)紫色瘀斑

圖2 病死豬脾臟異常腫大、發(fā)黑質(zhì)脆

圖3 病變的肺臟、腎臟

圖4 PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR 電泳

PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，8個(gè)樣本中有7個(gè)樣品在257 bp左右有特異性擴(kuò)增條帶，與陽(yáng)性對(duì)照一致（圖4），4 號(hào)（肺臟）樣品無(wú)特異性擴(kuò)增條帶。

3 討論

病死豬體表出現(xiàn)紫色瘀斑，脾臟異常腫大等均符合典型ASF 癥狀；8個(gè)樣本中，有7個(gè)PCR檢測(cè)出現(xiàn)ASFV 的特異性擴(kuò)增條帶。由此，判斷該病死豬疑似感染ASFV。隨后按有關(guān)要求送樣至云南省級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心經(jīng)實(shí)驗(yàn)室復(fù)核。截至2019年5 月25 日疫情發(fā)布，相關(guān)養(yǎng)殖戶(hù)存欄生豬104 頭，發(fā)病49 頭，死亡48 頭。疫情發(fā)生后，當(dāng)?shù)匾寻凑找髥?dòng)應(yīng)急響應(yīng)機(jī)制，采取封鎖、撲殺、無(wú)害化處理、消毒等應(yīng)急處置措施，對(duì)全部病死豬和撲殺豬進(jìn)行無(wú)害化處理。同時(shí)，禁止所有生豬及其產(chǎn)品出入封鎖區(qū)。

本次疫情是文山壯族苗族自治州首例ASF 疫情。這次疫情考驗(yàn)了文山壯族苗族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制系統(tǒng)的“防控作戰(zhàn)”能力與建設(shè)情況，也檢驗(yàn)了文山少數(shù)民族自治區(qū)基層獸醫(yī)人員的專(zhuān)業(yè)技能與基本功。目前，文山壯族苗族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室配備普通PCR 檢測(cè)設(shè)備，PCR 試劑、引物均與云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心要求一致，且檢測(cè)技術(shù)人員均經(jīng)過(guò)省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心的專(zhuān)業(yè)指導(dǎo)與培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)全省ASF 檢測(cè)能力比對(duì)。本次樣品的ASFV 檢測(cè)，從樣品的接收、處理、核酸提取至PCR 擴(kuò)增及電泳結(jié)果上報(bào)，均有條不絮地按實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部操作程序與質(zhì)量管理體系進(jìn)行，是中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建成以來(lái)一次緊急檢測(cè)的成功案例。

快速可靠的檢測(cè)方法對(duì)于及時(shí)診斷和預(yù)防ASF至關(guān)重要[4]?；鶎荧F醫(yī)人員將臨床診斷技術(shù)[5]與可靠的分子生物PCR 檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，提高了基層獸醫(yī)對(duì)ASF 等動(dòng)物疫病早期診斷、預(yù)防與控制的科學(xué)性。診斷方法中的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是確診ASF 的重要依據(jù)[6]。基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展ASF PCR 初步檢測(cè)，對(duì)于加強(qiáng)ASF 監(jiān)測(cè)預(yù)警，及時(shí)發(fā)現(xiàn)ASFV感染和疑似感染疫情具有重要意義。此次ASF PCR 檢測(cè)診斷為硯山縣動(dòng)物疫控中心做好ASF 疫情處置準(zhǔn)備工作奠定了基礎(chǔ)，為及時(shí)開(kāi)展ASF 防控工作爭(zhēng)取了寶貴時(shí)間。PCR 檢測(cè)技術(shù)在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)用增強(qiáng)了ASF 等動(dòng)物疫病防控工作的主動(dòng)性和目的性，為科學(xué)評(píng)估疫情風(fēng)險(xiǎn)提供了技術(shù)支持?？偨Y(jié)本次ASF PCR 檢測(cè)工作發(fā)現(xiàn)，獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)PCR 檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)、試驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生的污染物易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室核酸污染及實(shí)驗(yàn)室生物安全等問(wèn)題。建議基層實(shí)驗(yàn)室購(gòu)置快速、準(zhǔn)確的熒光定量PCR 儀，以縮短檢測(cè)時(shí)間，減少污染，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。今后，應(yīng)逐步提高基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，繼續(xù)充實(shí)ASF 等重大動(dòng)物疫病檢測(cè)、監(jiān)測(cè)的資金投入，完善中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的硬件設(shè)施，重視“軟件”建設(shè)及管理[7-8]，加強(qiáng)獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全防控，充分發(fā)揮基層獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在動(dòng)物疫病防控中的作用。