別 蒙，謝筆鈞，孫智達(dá)*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf）是一種寄生在松樹根部的真菌，在中國(guó)有2000多年的食用歷史，是我國(guó)重要的藥食兩用藥材之一[1]。茯苓在食品工業(yè)以及醫(yī)藥行業(yè)用途廣泛，具有利尿、安神、健脾等功效，常用于治療水腫、失眠、心神不安等癥[2-3]。

茯苓多糖為茯苓的主要有效成分，其中90%以上為堿溶性多糖，不溶于水，且基本沒有生理活性，生物利用率極低，使之在臨床應(yīng)用上受到限制[4]。但是將不溶于水的堿溶性茯苓多糖經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后，可提高其水溶性和生物活性[5]。因此，目前有關(guān)茯苓多糖的水溶性修飾（如羧甲基化和硫酸酯化及水溶性低聚體等）以及多糖的活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和核心問題[6]。研究表明，羧甲基化修飾的茯苓多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等[7]。根據(jù)Wang Yongjiang等[8]報(bào)道，茯苓多糖羧甲基化后能提高對(duì)膽汁酸的結(jié)合能力。Wang Yufen等[9]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等技術(shù)對(duì)羧甲基化與硫酸酯化Lachnum多糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征與活性研究，證實(shí)羧甲基化與硫酸酯化修飾都能顯著提高多糖抗氧化和降血糖活性。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖經(jīng)羧甲基化修飾后，水溶性增強(qiáng)，對(duì)腸道健康也具有一定的促進(jìn)作用，其抑制腸毒素大腸桿菌的能力顯著提高，并且與蓮房原花青素（lotus seedpod procyanidins，LSPC）協(xié)同使用時(shí)能有效解決多酚低濃度促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)[10]。然而，關(guān)于茯苓多糖羧甲基化程度與理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及生物活性關(guān)系的研究較少，尤其是有關(guān)羧甲基化程度與其體外抑菌活性之間的研究并不完善[11]。本研究采用二次堿化法制備羧甲基茯苓多糖（carboxymethylated pachymaran，CMP），通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到最佳改性工藝，并對(duì)不同取代度（0.350～0.728）的CMP進(jìn)行理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)表征與體外抑菌活性研究，以期為進(jìn)一步研究CMP作為天然抗菌劑提供科學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)而促進(jìn)堿溶性茯苓多糖的合理深加工，提高其利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白茯苓購(gòu)自湖南省懷化縣茯苓基地；LSPC由實(shí)驗(yàn)室自提，蓮房采自洪湖藍(lán)田種植區(qū)，品種名稱為“武植2號(hào)”。

無水乙醇、氫氧化鈉、一氯乙酸、冰醋酸、PAN指示劑（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；金黃色葡萄球菌C M C C(B)2 6 0 0 3、大腸桿菌NCTC12900、腸炎沙門菌BNCC103134、Luria-Bertani（LB）肉湯、LB瓊脂、Mueller-Hinton（MH）肉湯中國(guó)青島霍普生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵 武漢科爾儀器設(shè)備有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì)上海尤尼柯儀器有限公司；Nexus 470 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；DSC204F型差示掃描量熱儀 耐馳儀器上海有限公司；DAWN HELEOSII型多角度激光散射儀（配備Optilab T-rEX型示差檢測(cè)器）美國(guó)A g i l e n t公司；AV 6 0 0核磁共振儀 德國(guó)Bruker公司；JSM-6930LV掃描電鏡 日本NTC公司；Multskan Go全波長(zhǎng)讀數(shù)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 CMP的合成

采用二次堿化法[12]，稱取一定量脫脂后的茯苓多糖于錐形瓶中，倒入一定量的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在不同溫度下，攪拌溶脹0.5 h，再加入固體氫氧化鈉，繼續(xù)攪拌堿化反應(yīng)2 h，再向錐形瓶中加入同樣質(zhì)量的氫氧化鈉和一定質(zhì)量的固體醚化試劑一氯乙酸，繼續(xù)進(jìn)行攪拌。結(jié)束反應(yīng)后，混合物用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值到6.0±0.2，隨后進(jìn)行抽濾，用80%乙醇溶液洗滌至濾液中無Cl-，固體用50 ℃烘箱烘干至質(zhì)量恒定，得到CMP。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定反應(yīng)時(shí)間5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、反應(yīng)物（茯苓多糖、氫氧化鈉與一氯乙酸）物質(zhì)的量比1∶3∶1.5，考察反應(yīng)溫度分別為50、55、60、65、70 ℃對(duì)CMP取代度的影響。固定反應(yīng)溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5，考察反應(yīng)時(shí)間分別為3、4、5、6、7 h對(duì)CMP取代度的影響。固定反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為70%、75%、80%、85%、90%對(duì)CMP取代度的影響。固定反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，考察反應(yīng)物物質(zhì)的量比分別為1∶2∶1、1∶2.5∶1.25、1∶3∶1.5、1∶3.5∶1.75、1∶4∶2對(duì)CMP取代度的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，以CMP取代度為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，見表1，并利用SPSS分析正交試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳合成工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 CMP改性正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on modification of carboxymethyl pachyman

1.3.4 CMP取代度的測(cè)定

采用銅鹽絡(luò)合滴定法[13]測(cè)定。其原理是基于CMP上的羧基官能團(tuán)可以定量和銅離子發(fā)生沉淀反應(yīng)，該法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確可靠。

1.3.5 不同取代度CMP的結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 紫外-可見光譜分析

配制1.0 mg/mL的不同取代度的CMP溶液，用超純水作參比，用UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行掃描[14]。

1.3.5.2 紅外光譜分析

準(zhǔn)確稱取不同取代度的CMP 10 mg，與已干燥的500 mg KBr混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，取50 mg研磨后的粉末進(jìn)行壓片，利用Nexus 470 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀于4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析CMP的特征基團(tuán)[15]。

1.3.5.3 Zeta電位與粒徑分析

Zeta電位是指剪切面的電位，是表征分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。用去離子水將不同取代度的CMP配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，于Zetasizer Nano ZS納米粒度電位分析儀上測(cè)定CMP的Zeta電位，測(cè)量溫度25 ℃，每組數(shù)值重復(fù)3 次取平均值。將不同取代度的CMP配制成0.5 mg/mL的多糖溶液，于Zetasizer Nano ZS納米粒度電位分析儀上測(cè)定CMP的粒徑分布，測(cè)量溫度25 ℃，每組數(shù)值重復(fù)3 次取平均值[16]。

1.3.5.4 總糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[17]，準(zhǔn)確稱取0.100 0 g葡萄糖（105 ℃烘干恒質(zhì)量），配成10 mg/mL的葡萄糖溶液，再吸取上述溶液1.0 mL用蒸餾水定容至100 mL，得到0.100 0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL于25 mL比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至5 mL，搖勻。分別吸取1 mL供試液于具塞試管中，用苯酚-硫酸法在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)紫外吸光度，記錄數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同取代度CMP樣品溶于水，配成適當(dāng)質(zhì)量濃度的供試樣品溶液，吸取1 mL樣品溶液，依照上述顯色條件，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算CMP中的葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)式（1）計(jì)算CMP中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：c為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL），由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算所得；b為稀釋倍數(shù)；V為樣品總體積/mL；m為樣品質(zhì)量/mg。

1.3.5.5 蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[18]測(cè)蛋白。準(zhǔn)確稱取10.00 mg牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液，吸取上述溶液1 mL，定容至10 mL，配制成0.1 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.72、0.84、0.96 mL于10 mL比色管，補(bǔ)充蒸餾水至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)貯備液，搖勻，靜置5 min，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)紫外吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的CMP溶液，吸取1 mL測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.3.5.6 熱穩(wěn)定性分析

差式掃描量熱分析：稱取樣品6～10 mg，于鋁坩堝中壓緊，以空鋁盒為參比，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍20～350 ℃。在N2中進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.3.5.7 分子質(zhì)量測(cè)定

采用凝膠色譜與多角度激光光散射聯(lián)用儀檢測(cè)不同取代度CMP的分子質(zhì)量[20]。將CMP樣品用0.1 mol/L NaNO3配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量200 μL。色譜條件：PL aquagel-OH MIXED色譜柱（7.5 mm×300 mm，8.0 μm），檢測(cè)溫度25 ℃，流速0.8 mL/min。

1.3.5.8 單糖組成分析

采用氣相色譜法分析不同取代度CMP樣品的中性單糖組成[21]。

CMP樣品水解及衍生化：稱取10 mg干燥樣品于具塞試管中，加入3 mol/L三氟乙酸溶液4 mL，使多糖完全溶解后密封，于110 ℃烘箱水解6 h，向多糖水解液中少量多次加入甲醇并減壓蒸干，至三氟乙酸被完全蒸出。再分別準(zhǔn)確稱取6 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，向樣品水解物和單糖標(biāo)準(zhǔn)品中再分別加入10 mg鹽酸羥胺、1.5 mg肌醇和1.0 mL吡啶并混合均勻，封口后于90 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫后加入乙酸酐0.50 mL，90 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)30 min。冷卻后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾并進(jìn)樣。

氣相色譜條件：H P-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，0.32 μm）；氫火焰離子檢測(cè)器；氣化室溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度270 ℃；升溫程序：初始溫度190 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃，保持20 min；載氣N2；氮?dú)饬髁?0 mL/min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量50 mL/min；分流比30∶1；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.5.9 核磁共振波譜分析

上樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，茯苓多糖以氘代二甲基亞砜為溶劑，CMP以D2O為溶劑，在600 MHz核磁共振譜儀上測(cè)定，參數(shù)如下：探針溫度60 ℃；掃描次數(shù)16；空掃次數(shù)0 次；脈沖角度30°；弛豫延遲時(shí)間1.0 s。

1.3.5.10 掃描電鏡的超微結(jié)構(gòu)分析

取少量干燥的茯苓多糖及CMP粉末，用雙面導(dǎo)電膠將樣品黏到樣品臺(tái)，用濺射鍍膜法進(jìn)行鍍金處理，厚度15 nm，在電壓15 kV，高真空條件下使用掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行微觀形貌分析[22]。

1.3.6 不同取代度CMP的抑菌活性

抑菌實(shí)驗(yàn)用96 孔板微量二倍稀釋法[23]，挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期?；罨弥?，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱?.5號(hào)管，用MH培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)節(jié)至108CFU/mL，再稀釋10 倍。將不同取代度的CMP配制為20 mg/mL樣液，LSPC配制為10 mg/mL樣液，將LSPC和CMP按1∶1比例（m/m）混合，在96 孔板中加入200 μL樣液，采用二倍稀釋法將每種樣品稀釋為8 個(gè)梯度，之后再加入100 μL MH培養(yǎng)基，10 μL菌液，使每個(gè)孔最終菌濃度為5×105CFU/mL，每種樣品質(zhì)量濃度為10～0.078 125 mg/mL。茯苓多糖以無菌二甲基亞砜為溶劑，以同等質(zhì)量濃度的二甲基亞砜為對(duì)照。樣品對(duì)照組以培養(yǎng)基代替菌液，陰性對(duì)照用培養(yǎng)基代替樣品溶液，陽性對(duì)照用芐氨青霉素代替樣品溶液。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)平行，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，于全波長(zhǎng)讀數(shù)儀上測(cè)定其吸光度。按式（2）計(jì)算抑制率：

式中：A0為空白培養(yǎng)基吸光度；AS為樣品對(duì)照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP制備的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of one-factor-at-a-time experiments

如圖1A所示，在一定的溫度范圍內(nèi)，羧甲基的取代度先上升后下降，當(dāng)反應(yīng)溫度到65 ℃時(shí)，羧甲基的取代度最高。結(jié)果表明，提高反應(yīng)溫度可以促進(jìn)羧甲基化反應(yīng)，但溫度過高會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)[24]，導(dǎo)致羧甲基化程度降低，因此，CMP達(dá)到最高取代度時(shí)合成的最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。如圖1B所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，羧甲基取代度也隨之增高，在5 h后增加速度減緩，6 h后趨于平穩(wěn)。反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)有助于多糖充分溶脹，但從節(jié)能環(huán)保的角度出發(fā)，選擇6 h作為CMP的最佳反應(yīng)時(shí)間。如圖1C所示，在一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，羧甲基取代度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，羧甲基取代度達(dá)到最大值，但繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，羧甲基取代度反而降低。這是因?yàn)轸燃谆〈磻?yīng)的實(shí)質(zhì)是氫氧化鈉和一氯乙酸反應(yīng)生成的氯乙酸鈉進(jìn)攻茯苓多糖的活性中心，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，氫氧化鈉的濃度增大，進(jìn)攻活性中心的反應(yīng)更劇烈，反應(yīng)產(chǎn)物取代度也較高而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，少量水分使得醚化試劑向茯苓多糖活性中心遷移的速率下降，取代度也隨之下降，因此，CMP合成的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%。如圖1D所示，羧甲基的取代度在一定范圍內(nèi)穩(wěn)步上升，當(dāng)反應(yīng)物物質(zhì)的量比從1∶2∶1變?yōu)?∶3∶1.5時(shí)，羧甲基取代度快速增大，隨后繼續(xù)增加反應(yīng)物物質(zhì)的量比水平時(shí)，羧甲基取代度變化平緩。這是因?yàn)闅溲趸c和一氯乙酸達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)發(fā)生副反應(yīng)[25]，反應(yīng)效率隨之下降，因此，CMP合成的最佳反應(yīng)物茯苓多糖、氫氧化鈉、一氯乙酸的物質(zhì)的量比為1∶3∶1.5。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，考察反應(yīng)物物質(zhì)的量比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、反應(yīng)溫度（D）對(duì)茯苓多糖羧甲基化取代度的影響，結(jié)果見表2。各因素對(duì)取代度的影響由大到小依次為A＞D＞B＞C，反應(yīng)的最優(yōu)組合為A3B2C1D3，因此，反應(yīng)的最佳條件為反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3.5∶1.75、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度65 ℃。

表2 CMP改性工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of modification of carboxymethyl pachyman

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在理論最優(yōu)條件A3B2C2D2下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，取代度分別為0.639、0.617、0.651，平均取代度為0.636，在正交試驗(yàn)中最優(yōu)反應(yīng)條件A3B2C1D3下進(jìn)行了3 次平行實(shí)驗(yàn)，取代度分別為0.724、0.729、0.718，平均取代度為0.724，要高于理論最優(yōu)條件A3B2C2D2下的0.636，因此，選擇實(shí)驗(yàn)A3B2C1D3為最優(yōu)取代工藝。

2.3 不同取代度CMP的制備

正交試驗(yàn)優(yōu)化條件下得到的CMP的取代度普遍較高（＞0.5），為增大對(duì)CMP取代度的研究范圍，選用單因素與正交試驗(yàn)中制備CMP的反應(yīng)條件，通過控制反應(yīng)條件，制備6 個(gè)不同取代度的CMP。CMP-1：反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5、反應(yīng)時(shí)間5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，取代度為0.350；CMP-2：反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5、反應(yīng)時(shí)間5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，取代度為0.448；CMP-3：反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5、反應(yīng)時(shí)間4 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，取代度為0.501；CMP-4：反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5、反應(yīng)時(shí)間5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，取代度為0.591；CMP-5：反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3∶1.5、反應(yīng)時(shí)間5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，取代度為0.666；CMP-6：反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)物物質(zhì)的量比1∶3.5∶1.75、反應(yīng)時(shí)間4 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，取代度為0.728。

2.4 不同取代度CMP理化性質(zhì)的分析

2.4.1 紫外-可見光譜分析

圖2 不同取代度CMP紫外-可見光譜圖Fig. 2 UV-visible absorption spectra of CMP with different substitution degrees

如圖2所示，CMP在波長(zhǎng)200 nm處有多糖的特征吸收峰，而在波長(zhǎng)280 nm附近處有弱吸收峰，說明CMP含有少量蛋白質(zhì)，為避免除蛋白造成對(duì)多糖的損失，本實(shí)驗(yàn)暫未進(jìn)行除蛋白研究，蛋白含量由考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

2.4.2 紅外光譜分析

圖3 茯苓多糖、CMP的紅外光譜Fig. 3 IR spectra of pachyman and CMP

如圖3所示，茯苓多糖和CMP在2 900 cm-1附近處均有典型的多糖特征吸收峰（C—H），在3 700～3 000 cm-1處，較寬的吸收峰是羥基（—OH）的締合峰，1 640 cm-1（C＝O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)）和1 420 cm-1（次甲基的伸縮振動(dòng)）附近處是羧甲基的特征吸收峰，說明發(fā)生了羧甲基化反應(yīng)。890 cm-1附近為β-吡喃糖特征峰，從圖3可看出，890 cm-1處，茯苓多糖的特征峰最為明顯，CMP-1稍弱，CMP-2～CMP-6幾乎沒有β-吡喃糖特征峰。結(jié)果表明取代度越高，峰強(qiáng)度越大，表明羧甲基化程度越高，β-吡喃糖特征峰逐漸減弱直至消失。

2.4.3 Zeta電位與粒徑分析

如圖4A所示，不同取代度的CMP始終帶負(fù)電荷，說明CMP屬于陰離子多糖，同樣表明羧甲基化成功。隨著取代度的上升，CMP電位的絕對(duì)值也不斷增大，證明CMP所帶的電荷隨著取代度的增加而增大。從電位層面分析，CMP是陰離子多糖，并且其溶液的穩(wěn)定性隨著取代度的增大而增大。有研究證實(shí)抗菌劑的抗菌活性與其Zeta電位有關(guān)[26]，抗菌劑電荷分布可能會(huì)進(jìn)一步影響細(xì)菌細(xì)胞壁的電位分布。

如圖4B所示，隨著取代度的增加，CMP的粒徑先增大后減小。羧甲基基團(tuán)的引入，一方面使得CMP的結(jié)構(gòu)變得舒展，另一方面，較高的取代度有助于發(fā)生聚合。Chen Lingyun等[27]的研究證明羧甲基殼聚糖在水溶液中有很強(qiáng)的聚集性，其聚集行為取決于其取代度。取代度在0.501之前，粒徑隨著取代度的增加而急劇增大。然而，在水溶液中，CMP帶有負(fù)電荷，且取代度越高，電位絕對(duì)值越高，因此，顆粒間靜電斥力增強(qiáng)，使CMP在水溶液中的聚集行為減弱，多糖鏈壓緊收縮，所以在取代度大于0.501之后，粒徑又開始大幅減小。

圖4 不同取代度CMP溶液的Zeta電位（A）與粒徑（B）分析Fig. 4 Zeta potential (A) and particle size (B) analysis of CMP solutions with different substitution degrees

2.4.4 不同取代度CMP中的中性糖組成和蛋白含量分析

表3 不同取代度CMP的總糖含量與蛋白含量Table 3 Total sugar and protein contents of CMP with different substitution degrees

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得總糖回歸方程y=9.38x+0.088（R2=0.997 8）。如表3所示，隨著取代度的增高，CMP中總糖含量下降。有研究證實(shí)茯苓多糖羧甲基化后，β-吡喃糖特征峰變?nèi)酰?糖苷鍵C3質(zhì)子峰消失[28]。本實(shí)驗(yàn)也由紅外光譜與核磁波譜分析結(jié)果得到了證實(shí)。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得蛋白回歸方程y=6.110 5x+0.009 4（R2=0.998 3）。如表3所示，蛋白含量變化與CMP的取代度無明顯關(guān)系，且所含蛋白很少。

2.4.5 不同取代度CMP的熱穩(wěn)定性分析

圖5 不同取代度CMP的熱穩(wěn)定性分析Fig. 5 DSC analysis of CMP with different substitution degrees

由圖5可知，未經(jīng)羧甲基化的茯苓多糖在127 ℃左右出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，對(duì)應(yīng)樣品的晶區(qū)熔融；在311 ℃左右出現(xiàn)一個(gè)放熱峰，對(duì)應(yīng)于樣品的受熱碳化。相應(yīng)的，所有經(jīng)過修飾后的CMP的吸熱峰和放熱峰對(duì)應(yīng)茯苓多糖，均向右移動(dòng)，可見，羧甲基改性提高了茯苓多糖的熱穩(wěn)定性。其中，230～260 ℃是羧甲基的分解峰，該溫度范圍內(nèi)，羧甲基發(fā)生斷裂，脫去羧基和羰基[29]。茯苓粉在此溫度范圍內(nèi)無峰，也說明了羧甲基反應(yīng)的成功。值得注意的是不同取代度的CMP熱穩(wěn)定性也有較大差別，在一定范圍內(nèi)，取代度增高，CMP的熱穩(wěn)定性也增高，當(dāng)取代度超過0.591時(shí)，CMP的熱穩(wěn)定性反而隨著取代度的增高而降低。這可能是因?yàn)槿〈鹊纳呤沟肅MP顆粒破碎，發(fā)生裂解。

2.4.6 分子質(zhì)量分布

表4 不同取代度CMP的分子質(zhì)量Table 4 Molecular mass distribution of CMP with different substitution degrees

由表4可知，樣品的mw、mn隨取代度的增加而降低。這可能與衍生化反應(yīng)條件的劇烈程度有關(guān)，反應(yīng)條件越劇烈，茯苓多糖的分子結(jié)構(gòu)被破壞的越嚴(yán)重，最終導(dǎo)致分子鏈的斷裂從而導(dǎo)致分子質(zhì)量的減少[30]。

2.4.7 氣相色譜分析

如圖6所示，該多糖為均一多糖，僅由D-葡萄糖這一種單糖組成。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)單糖（A）與CMP-6（B）的氣相色譜圖Fig. 6 GC chromatograms of mixed standards of monosaccharides (A) and CMP-6 (B)

2.4.8 核磁共振分析

圖7 茯苓多糖（A）與CMP-6（B）13C NMR譜圖Fig. 7 13C NMR spectra of pachymaran (A) and CMP-6 (B)

表5 樣品與葡聚糖殘基的13C NMR的化學(xué)位移Table 5 Chemical shifts of pachymaran, CMP and dextran residues in 13C NMR spectra

如圖7A所示，6 個(gè)顯著的葡萄糖殘基上C的化學(xué)位移峰。在δ100～115之間，僅有1 個(gè)異頭碳的峰，茯苓多糖C1的δ為103.55，說明只有一種單糖，根據(jù)出峰的位置和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[31]值，確定為葡萄糖。而羧甲基化后的茯苓多糖（CMP-6）C1的δ相對(duì)于改性前的茯苓多糖，從δ103.55移動(dòng)到了δ102.34，也只顯示了1 個(gè)異頭碳的信號(hào)峰（圖7B）。表明茯苓多糖與CMP-6都只存在唯一一種糖殘基[32]。CMP-6其余的13C-NMR譜圖中的δ與文獻(xiàn)[31]報(bào)道的β-1,3-葡聚糖支鏈?zhǔn)忠恢隆D7B中，原未改性的多糖中C3（δ86.73）峰消失，而在δ82～85出現(xiàn)的一系列信號(hào)峰為C2、C4、C6取代對(duì)C3的影響[33]。說明取代反應(yīng)在C2、C4、C6位上都有發(fā)生。圖7B中，C5信號(hào)峰從δ76.83位移至δ75.54，說明羧甲基衍生化反應(yīng)主要發(fā)生在C6位羥基，并使C5的峰略向高場(chǎng)移動(dòng)[34]。圖7B中部分原茯苓多糖的信號(hào)峰由于羧甲基化而向低場(chǎng)移動(dòng)，從C6（δ61.36）位移至δ70.14（C6’），這是由于在C6上—CH2COOH基團(tuán)取代了羥基，C6從δ61.36向低場(chǎng)（左區(qū)域）轉(zhuǎn)移[33]。改性后茯苓多糖的C4部分信號(hào)峰從δ68.90移至δ68.02，C2部分信號(hào)峰從δ73.33移至δ73.28，進(jìn)一步說明衍生化反應(yīng)也發(fā)生在C4和C2羥基位。δ178.05的新信號(hào)峰為羧甲基上C＝O的碳信號(hào)。綜上分析可認(rèn)為，茯苓多糖與CMP-6主要由β-1,3-葡聚糖組成，從這些峰的面積來看，對(duì)應(yīng)取代量，羧甲基的引入程度為C6＞C4＞C2。

2.4.9 超微結(jié)構(gòu)分析

圖8 茯苓多糖及不同取代度CMP的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM pictures of CMP with different substitution degrees and pachymaran

由圖8可知，未經(jīng)處理的茯苓多糖顆粒間隙大，表面光滑；羧甲基衍生化后，顆粒間較為緊實(shí)，且隨著取代度增加，顆粒間聚集程度增大，結(jié)構(gòu)越緊密。這可能與多糖結(jié)構(gòu)中的羧甲基根有關(guān)，由于羧甲基根的極性與離子強(qiáng)度較大，所以分子間相對(duì)作用力較大，導(dǎo)致顆粒形成聚集體[35]。并且隨著取代度越大，顆粒表面越粗糙，并伴隨著裂痕的出現(xiàn)，當(dāng)取代度在0.591時(shí)，顆粒破碎，出現(xiàn)一定程度的裂解，在取代度為0.728時(shí)，裂解情況更加嚴(yán)重，這說明羧甲基化影響茯苓多糖的結(jié)構(gòu)排列，合成過程中劇烈的反應(yīng)條件造成的形態(tài)破壞是合理的，從掃描電鏡分析可知，CMP-6的裂解情況最為嚴(yán)重，影響了茯苓多糖的結(jié)構(gòu)排列，所以，當(dāng)取代度超過0.591時(shí)，CMP的熱穩(wěn)定性反而降低。

2.5 不同取代度CMP對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌的抑菌作用

如圖9所示，同一取代度時(shí)，抑菌活性與多糖呈濃度依賴性，多糖質(zhì)量濃度越高，抑菌效果越好，且同一質(zhì)量濃度下，不同取代度CMP的抑菌率不同，羧甲基化程度越高，抑菌活性越大。結(jié)果表明，在CMP質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，取代度為0.728的CMP對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率能達(dá)到60.91%，取代度為0.350的CMP在10 mg/mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率也能達(dá)到35.88%，這說明CMP對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，并且CMP的取代度是影響其抑菌性的重要指標(biāo)之一。對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)度隨著CMP取代度的增高而增強(qiáng)，最大抑菌率可以達(dá)到35.55%，在1.25 mg/mL之后趨于平緩，同時(shí)遠(yuǎn)低于同質(zhì)量濃度的芐氨青霉素對(duì)大腸桿菌的抑制率，因此反映出CMP對(duì)大腸桿菌的抑制效果較差。而CMP對(duì)腸炎沙門菌最高的抑制率僅能達(dá)到7.80%，低質(zhì)量濃度的CMP反而促進(jìn)腸炎沙門菌的生長(zhǎng)，陽性對(duì)照在低濃度時(shí)也無抑菌效果。而且取代度越低，促進(jìn)腸炎沙門菌生長(zhǎng)的情況越明顯。這可能是由于腸炎沙門菌將多糖當(dāng)作碳源。結(jié)果說明，CMP對(duì)腸炎沙門菌無抑菌效果。并且茯苓多糖對(duì)3 種菌無明顯抑制效果，也不促進(jìn)菌的增殖，說明茯苓多糖無體外抗菌作用。結(jié)果表明，CMP與LSPC混合物的抑菌效果要強(qiáng)于單獨(dú)的LSPC，且能明顯改善LSPC在低質(zhì)量濃度下促進(jìn)腸道菌增殖的負(fù)效應(yīng)。如LSPC在0.04 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的增殖率為40%，而與CMP復(fù)配后，同樣的濃度下，不同取代度CMP與LSPC混合物均不會(huì)使其增殖，相反，有明顯的抑制效果，與CMP-6復(fù)配時(shí)其抑制率達(dá)到30%。高取代度的CMP與LSPC的復(fù)配物在低質(zhì)量濃度下對(duì)腸炎沙門菌也無負(fù)效應(yīng)，證實(shí)了取代度越高的CMP與LSPC的復(fù)配效果越好。綜上表明，CMP的抑菌作用具有選擇性，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果較弱，且抑菌所需要的質(zhì)量濃度較大，實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)多糖與多酚協(xié)同使用比單獨(dú)的多糖或多酚抑菌效果更好[36]，且能大大減少多糖用量，因此可以與多酚聯(lián)合使用。

圖9 CMP及LSPC復(fù)配物對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸桿菌NCTC12900、沙門菌BNCC103134的抑制率Fig. 9 Inhibition rates of CMP and LSPC and their mixture against S. aureus CMCC(B)26003, E. coli NCTC12900 and Salmonella enteritis BNCC103134

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探究CMP的最佳合成工藝為反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度65 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、反應(yīng)物茯苓多糖-氫氧化鈉-一氯乙酸物質(zhì)的量比1∶3.5∶1.75；進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到CMP的平均取代度為0.724，優(yōu)化工藝準(zhǔn)確可靠。隨后，通過控制反應(yīng)條件制備出不同取代度的CMP，并對(duì)CMP-1～CMP-6進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定和結(jié)構(gòu)表征。

紫外掃描結(jié)果表明CMP含有少量蛋白，而蛋白含量與CMP的取代度無關(guān)。紅外光譜分析表明，CMP具備多糖的特征吸收峰，Zeta電位分析與粒徑分析結(jié)果表明CMP為陰離子多糖，且取代度越高，電位絕對(duì)值越高，粒徑先增大后減小，溶液越穩(wěn)定。中性糖分析結(jié)果表明，隨著CMP取代度的增高，其中性糖含量下降。差示掃描量熱分析結(jié)果表明其熱穩(wěn)定性在一定取代度范圍內(nèi)先增加后降低，掃描電鏡分析與凝膠色譜分析表明CMP的取代度越大，空間結(jié)構(gòu)越緊密，裂解情況越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致其分子質(zhì)量隨取代度的增大而減小。結(jié)構(gòu)分析顯示茯苓多糖與CMP為以β構(gòu)型的吡喃糖環(huán)，主要由β-1,3-葡聚糖組成，且衍生化反應(yīng)主要發(fā)生在C6位羥基。

采用茯苓多糖及不同取代度的CMP、LSPC及其復(fù)配物對(duì)3 種食源性致病菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，茯苓多糖沒有抑菌作用，而CMP有抑菌作用，其取代度越高，其抑菌效果越好。與LSPC復(fù)配使用時(shí)能有效解決LSPC在低濃度促進(jìn)腸道致病菌增殖的難題，且取代度越高，復(fù)配的效果越好。CMP對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌能力高于革蘭氏陰性菌。這可能是因?yàn)殛栃跃募?xì)胞膜比陰性菌敏感，取代度高的CMP水溶性及電位絕對(duì)值均較高，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，但抑菌作用需要濃度較高，因此需要對(duì)多糖與多酚協(xié)同抑菌作用及其可能的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。