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        QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-同位素內(nèi)標法快速測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量

        2020-07-04 10:58:46倪韻晨徐小民黃百芬徐美佳李祖光
        食品科學 2020年12期
        關鍵詞:氟蟲丙酮代謝物

        倪韻晨,徐小民*,黃百芬,徐美佳,李祖光*

        (1.浙江工業(yè)大學教育科學與技術學院,浙江 杭州 310014;2.浙江省疾病預防控制中心理化毒理所,浙江 杭州 310051;3.浙江工業(yè)大學化學工程學院,浙江 杭州 310014)

        氟蟲腈是一種苯基吡唑類殺蟲劑,主要用于殺滅土壤中鞘翅目害蟲的幼蟲,同時用以消除蚤、虱、蜱、蟑螂及螨等昆蟲[1-2]。氟蟲腈通過環(huán)境或生物轉(zhuǎn)化會產(chǎn)生氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜等代謝物[3-4]。有研究表明其代謝物相對于氟蟲腈具有更持久的穩(wěn)定性[5],且經(jīng)過對氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜3 種代謝物的研究表明,其毒性高于氟蟲腈原藥[6],因此,氟蟲腈的代謝物更容易導致食品中的農(nóng)藥殘留問題[7-8]。各國對氟蟲腈的限量值作了嚴格規(guī)定,其中日本與歐盟茶葉中的限量值分別為2 μg/kg[9]與5 μg/kg[10],且只限于氟蟲腈而不涉及其他代謝物。我國GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》制定了氟蟲腈在蔬菜、除糙米外的谷類等農(nóng)產(chǎn)品中的限量值分別為20 μg/kg與100 μg/kg,并以氟蟲腈、氟甲腈(MB46513)、氟蟲腈砜(MB46136)、氟蟲腈亞砜(MB45950)之和計算[11],但沒有規(guī)定茶葉中氟蟲腈的限量值。氟蟲腈內(nèi)標與氟蟲腈及其代謝物化學結(jié)構(gòu)式見圖1。

        圖1 氟蟲腈-13C2,15N2同位素內(nèi)標與氟蟲腈及其代謝物的化學結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of fipronil-13C2,15N2, fipronil and its metabolites

        茶葉中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法有氣相色譜法[12-13]、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用法[14-15]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GCMS/MS)法[16]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]等。提取溶劑主要包括丙酮-正己烷混合溶劑[12,14-15]或乙腈[13,16-17]。前處理主要采用固相萃取[8,12-13,15-16]或固相微萃取[14]。除了周昱等[14]開發(fā)的固相萃取前處理技術與GC-MS的檢測方法可同時定量檢測氟蟲腈及其代謝物,其他方法只能定量檢測氟蟲腈一種成分。現(xiàn)有方法主要為外標法定量,外標法對操作條件的穩(wěn)定性和進樣的重現(xiàn)性要求較高。榮杰峰等[15]采用固相萃取-GC-MS法檢測氟蟲腈的定量限為1 μg/kg,周昱等[14]采用固相微萃取-GC-MS法檢測氟蟲腈及其代謝物的定量限為1~4 μg/kg。雖然可通過高靈敏度的分析儀器或者大體積進樣以降低定量限[15],然而更多的進樣量可能導致嚴重的基質(zhì)效應或者儀器污染等問題。

        QuEChERS技術[18-19]自發(fā)明以來廣泛應用于植物源性食品農(nóng)藥殘留分析,以乙腈作為提取溶劑,前處理時間短且操作過程簡單。采用同位素內(nèi)標法定量,一定程度上消除了操作條件的變化所引起的誤差,測定結(jié)果準確,可同時定量檢測氟蟲腈及氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜3 種代謝物。除此之外,QuEChERS技術與抗干擾能力強的二級質(zhì)譜聯(lián)用,不僅克服了基質(zhì)的干擾和假陽性問題,并且使二級質(zhì)譜的優(yōu)點得到充分發(fā)揮[15]。本方法采用氟蟲腈-13C2,15N2同位素內(nèi)標(化學結(jié)構(gòu)見圖1)法對茶葉中氟蟲腈及其代謝物進行QuEChERS-GC-MS/MS定量測定。在較簡單、快速的前處理條件下完成對氟蟲腈及其代謝物的準確定量,氟蟲腈及其代謝物的方法的定量限均可達到1 μg/kg,能夠滿足歐盟與日本的殘留限量要求的同時,適合于茶葉中痕量氟蟲腈及其代謝物殘留的快速分析。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜(純度>95%)德國Dr. Ehrenstorfer公司;氟蟲腈-13C2,15N2(同位素內(nèi)標,純度>98%) 加拿大TRC公司;乙腈、丙酮(均為色譜純) 美國Fisher Chemical公司;環(huán)己烷(色譜純)美國貝克公司;NaCl(分析純) 廣東光華科技公司;無水MgSO4(分析純) 江蘇永華化學科技公司;N-丙基乙二胺(N-propyl ethylenediamine,PSA,分析純)天津博納艾杰爾科技公司;石墨化碳黑(graphite carbon black,GCB,分析純) 美國Supelco公司。

        1.2 儀器與設備

        TQ-8040 GC-MS/MS聯(lián)用儀 日本島津公司;高速粉碎機 溫嶺市林大機械公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;WH-861旋渦混合器太倉華利達實驗設備有限公司;MTN-5800氮吹濃縮裝置天津市津南八里臺微電子公司;V-125AllegraTMX-22R離心機 德國Beckman Coulter公司;HC-3018高速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 GC條件

        色譜柱:Rxi-5Sil(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:50 ℃保持1 min,以20 ℃/min升至200 ℃,以40 ℃/min升至250 ℃,保持3 min,以40 ℃/min升至280 ℃,保持6 min;進樣口溫度:240 ℃;載氣(He)壓力70 psi,進樣量1 μL;不分流進樣。

        1.3.2 MS/MS條件

        電子電離源;多反應離子監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM),離子源溫度為200 ℃;接口溫度為250 ℃;溶劑延遲為6 min。氟蟲腈及其代謝物的保留時間、定量離子和定性離子見表1。

        表1 氟蟲腈及其代謝物的GC-MS/MS分析條件參數(shù)Table 1 Analytical parameters of fipronil and its metabolites by GC-MS/MS

        1.3.3 基質(zhì)匹配校準曲線

        氟蟲腈及其代謝物混合標準使用溶液:用丙酮配制成1 000 mg/L的單一標準儲備液,再用環(huán)己烷-丙酮(1∶1,V/V)逐級稀釋,配制成2.00 mg/L的混合標準使用溶液。

        氟蟲腈-13C2,15N2內(nèi)標使用液:用丙酮配制成1 000 mg/L的內(nèi)標儲備液,再用環(huán)己烷-丙酮(1∶1,V/V)逐級稀釋,配制成2.00 mg/L的內(nèi)標使用溶液。

        基質(zhì)校正曲線:用質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標準溶液各1 mL,分別溶解于經(jīng)過凈化氮吹至近干后的空白樣品基質(zhì),同時分別添加氟蟲腈-13C2,15N2內(nèi)標使用液10 μL,配制基質(zhì)匹配系列校正溶液。以氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)量濃度與內(nèi)標的質(zhì)量濃度比為橫坐標(X),氟蟲腈及其代謝物儀器檢測的峰面積與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標(Y),制作基質(zhì)校準曲線。

        1.3.4 樣品前處理

        樣品預處理:茶葉樣品經(jīng)粉碎機粉碎混勻,制備好的試樣裝入潔凈食品塑料袋中保存。

        提?。悍Q取2 g(精確至0.01 g)樣品至50 mL離心管中,加2.00 mg/L氟蟲腈-13C2,15N2內(nèi)標使用液50 μL,加2 mL水和10 mL乙腈,渦旋10 min,超聲10 min,加1 g NaCl和2 g MgSO4,混勻,8 000 r/min離心2 min。

        凈化:取全部上清液至已添加200 mg無水MgSO4、PSA和GCB的10 mL塑料離心管中,渦旋1 min,8 000 r/min離心2 min。取凈化液2 mL于玻璃試管中,氮吹至近干,用1 mL環(huán)己烷-丙酮(1∶1,V/V)溶解殘渣,3 000 r/min離心2 min,取上清液,待測。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

        以氟蟲腈為例,其內(nèi)標法的計算方法為以1.3.3節(jié)方法制作的基質(zhì)標準曲線對未知含量的樣品進行定量,標準曲線通用表達式見式(1),x、y具體計算見式(2)、(3):

        式中:a為斜率;b為截距;y為氟蟲腈峰面積(Af)與氟蟲腈-13C2,15N2(Af-IS)內(nèi)標的峰面積比值;x為氟蟲腈含量(xf)與氟蟲腈-13C2,15N2(xf-IS)內(nèi)標的含量比值。

        因樣品中提前加入了確定濃度的氟蟲腈內(nèi)標,故未知濃度的樣品中氟蟲腈含量計算見式(4):

        本研究的氟蟲腈及其代謝物的定量計算按照G B 2 7 6 3—2 0 1 6的要求,以氟蟲腈、氟甲腈(MB46513)、氟蟲腈砜(MB46136)、氟蟲腈亞砜(MB45950)之和計算[11],見式(5):

        式中:xA為氟蟲腈及其代謝物的總含量;x1、x2、x3、x4分別為氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈與氟蟲腈砜的含量,該含量均為內(nèi)標法計算得到。

        根據(jù)所得數(shù)據(jù),柱狀圖采用GraphPad Prism 5軟件制作完成。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

        除乙腈外,丙酮是QuEChERS法中另外一種較為常用的提取溶劑。與乙腈相比,丙酮揮發(fā)性更強,大大縮短了樣品濃縮所需的時間[20]。付曉芳等[13]研究了乙腈和丙酮對茶葉中氟蟲腈的提取回收率,均獲得了滿意的結(jié)果(81.49%~94.43%)。本實驗的被測物包括氟蟲腈及3 種代謝物,實驗中對比考察乙腈、丙酮及兩者組成的混合溶劑對茶葉中氟蟲腈及其代謝物的提取效果。在添加量25 μg/kg的條件下,分別比較乙腈-丙酮為1∶0、1∶1、2∶8(V/V)的混合溶劑對茶葉的提取效果,結(jié)果見表2,3 種提取液均符合回收率要求,但丙酮比例高時,提取液顏色較深,雜質(zhì)較多,故選擇純乙腈作為提取液。

        表2 不同配比溶劑對茶葉中氟蟲腈及其代謝物的提取回收率(n=3)Table 2 Recoveries of fipronil and its metabolites in tea extracted with different solvents (n= 3)

        PSA通過陰離子交換吸附蛋白質(zhì)、糖類和極性較高的酸性物質(zhì)[21]。在凈化茶葉過程中,PSA具有去除茶葉中色素和長鏈脂肪酸等干擾物質(zhì)的良好效果[22-24]。且各種農(nóng)藥的回收率與PSA用量之間相關性不大,考慮茶葉樣品的復雜性,參照原始QuEChERS方法的用量,將PSA的用量定為每1 mL提取液使用25 mg PSA凈化[25]。為了加強儀器的維護,在PSA的基礎上再加上一種吸附劑——C18或GCB[26]。GCB作為非極性吸附劑,能夠有效去除疏水性的化合物,如色素和甾醇等[27]??紤]到GCB具有良好的去除茶葉色素的能力,實驗比較了加入GCB的凈化效果。如圖2所示,GCB能有效去除茶葉中的色素。根據(jù)回收率和基質(zhì)效應優(yōu)化,分散固相萃取填料的用量為PSA 200 mg和GCB 200 mg。

        圖2 不同凈化條件下的提取液對比Fig. 2 Comparison of extracts purified under two different cleaning conditions

        2.2 內(nèi)標特征離子的選擇

        圖3 氟蟲腈及其代謝物(5 μg/kg)的基質(zhì)加標MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms for matrix-matched standards of fipronil and its metabolites (5 μg/kg)

        氟蟲腈-13C2,15N2同位素內(nèi)標與氟蟲腈無法用色譜分開(圖3),且兩者之間只差4 個質(zhì)量數(shù),從圖4和圖5可以看出,內(nèi)標的基峰m/z371會受氟蟲腈同位素峰的干擾,本實驗采用同位素內(nèi)標質(zhì)譜次高峰m/z373作為母離子建立MRM條件,以消除氟蟲腈同位素峰的干擾。

        圖4 氟蟲腈全掃描質(zhì)譜圖Fig. 4 Full-scan mass spectrum of fipronil

        圖5 氟蟲腈-13C2,15N2全掃描質(zhì)譜圖Fig. 5 Full-scan mass spectrum of fipronil-13C2,15N2

        2.3 基質(zhì)效應

        質(zhì)譜分析中基質(zhì)干擾物會影響目標化合物的離子化,造成目標化合物儀器響應信號的增強或抑制[28]。在相同加標水平下,基質(zhì)效應計算公式如下:

        式中:A為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應值;B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥響應值;基質(zhì)效應>100%時,為基質(zhì)增強;基質(zhì)效應<100%時,為基質(zhì)抑制;基質(zhì)效應=100%時,無基質(zhì)增強或抑制效應[29-30]。一般情況下,基質(zhì)效應在80%~120%范圍內(nèi)為宜。

        采用上述方法衡量茶葉基質(zhì)對氟蟲腈及其代謝物儀器測定值的影響,空白基質(zhì)提取液采用1.3.3節(jié)的處理方法制備,比較25、200 μg/kg兩個添加水平下基質(zhì)匹配標準溶液和溶劑標準溶液中被測物的儀器檢測峰面積,每個平行測定3 次。

        結(jié)果表明,茶葉中氟蟲腈及其代謝物在2 種不同添加量(25、200 μg/kg)下的基質(zhì)效應在84.7%~111.7%(圖6),因此,本實驗采用基質(zhì)標準曲線以提高氟蟲腈及其代謝物定量分析的準確性。

        圖6 不同添加量氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)效應Fig. 6 Matrix effects of fipronil and its metabolites at two different spiked concentrations

        2.4 線性范圍與定量限

        系列基質(zhì)標準工作溶液采用1.3.3節(jié)的方法制備,并制作基質(zhì)匹配的校準曲線。結(jié)果見表3,氟蟲腈及其代謝物在0.4~100 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)(r2)均不小于0.995。氟蟲腈及其代謝物檢出限和定量限分別按信噪比3和10計算,結(jié)果均分別為0.3 μg/kg和1 μg/kg。定量限水平基質(zhì)加標的色譜圖見圖7,采用本方法前處理凈化,GC-MS/MS測定,茶葉基質(zhì)未見明顯干擾峰。

        表3 氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)標準曲線的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍Table 3 Regression equations, correlation coef ficients and linear rangers for matrix-matched fipronil and its metabolites

        圖7 氟蟲腈及其代謝物基質(zhì)加標1 μg/kg MRM色譜圖Fig. 7 MRM chromatograms of matrix-matched standards (1 μg/kg) of fipronil and its metabolites

        2.5 精密度與回收率實驗結(jié)果

        空白茶葉樣品中分別添加1、5、20、200 μg/kg的氟蟲腈及其代謝物,按照1.3.4節(jié)的方法進行加標實驗(n=6),計算加標回收率,結(jié)果見表4。方法的平均回收率為76.72%~96.53%,相對標準偏差為4.76%~13.07%。

        表4 茶葉中氟蟲腈及其代謝物的平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites in tea (n= 6)

        2.6 實際樣品檢測結(jié)果

        隨機抽取市售的茶葉200 份,應用建立的方法對樣品進行測定,結(jié)果如圖8所示,在某一茶葉樣品中檢出氟蟲腈及其代謝物總計27.18 μg/kg。

        圖8 氟蟲腈及其代謝物的陽性樣品MRM色譜圖Fig. 8 MRM chromatograms of fipronil and its metabolites in positive samples

        3 結(jié) 論

        本實驗采用QuEChERS技術,建立茶葉中氟蟲腈及3 種代謝物準確、快速的定量測定方法。本方法涵蓋了GB 2763—2016及歐盟和日本的限量規(guī)定中氟蟲腈的全部殘留標志物檢測,并通過提取試劑和凈化吸附劑的優(yōu)化,降低了基質(zhì)干擾,簡化了前處理,同時采用同位素內(nèi)標法定量,保證結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性,GC-MS/MS的高靈敏度檢測,可以滿足目前國內(nèi)外的茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留的限量要求。經(jīng)方法學驗證,該方法回收率為76.72%~96.53%,相對標準偏差為4.76%~13.07%,相關系數(shù)(r2)均不小于0.995,氟蟲腈及其代謝物檢出限和定量限分別為0.3 μg/kg和1 μg/kg,說明回收率、精密度、線性、定量限等均滿足殘留檢測方法確認的要求,適用于茶葉中氟蟲腈及其代謝物的快速定量測定。

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