尚 柯，梁恒興，張 彪，段慶梓，王 巍，張 玉

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610045）

羊肉作為一種優(yōu)良的畜肉，屬于高蛋白、低脂肪、低膽固醇類營(yíng)養(yǎng)保健食品，有著悠久的食用歷史[1]。我國(guó)的肉類生產(chǎn)以豬肉為主，隨著生活水平的提高，豬肉產(chǎn)量的比例逐年下降，而牛、羊等高價(jià)格肉類產(chǎn)量逐年上升，在2015年羊肉產(chǎn)量達(dá)到了肉類產(chǎn)量的7%[2]。目前，我國(guó)的羊肉市場(chǎng)以綿羊、山羊?yàn)橹?，同時(shí)部分地區(qū)，如貴州、云南等地也生產(chǎn)與食用麻羊等[3]。羊肉中的賴氨酸、精氨酸、組氨酸含量明顯高于豬、牛、雞等肉類，且膽固醇含量?jī)H有豬、牛的1/3甚至1/4，同時(shí)羊肉易于消化吸收，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[4-5]。

近年來(lái)，政府及消費(fèi)者對(duì)肉及肉制品的產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全越來(lái)越重視，但不法商販在肉制品生產(chǎn)（加工）中進(jìn)行肉質(zhì)摻偽、造假的現(xiàn)象仍屢有發(fā)生，這一摻假造假現(xiàn)象在羊肉制品中表現(xiàn)較為突出[6]。摻假的方式越來(lái)越多，形式越來(lái)越復(fù)雜[7]。目前，肉制品的摻假主要表現(xiàn)為原料肉摻假、組織替換等[8]，鴨肉冒充羊肉事件、歐洲馬肉門(mén)事件、巴西肉類丑聞、阿膠用豬皮制作、歐洲魚(yú)肉事件層出不窮[9-10]，“掛羊頭賣(mài)狗肉”的肉類摻假摻雜事件近年來(lái)屢被曝光。這些食品問(wèn)題嚴(yán)重地侵害了消費(fèi)者的合法利益，給肉制品食用安全帶來(lái)潛在危害，同時(shí)也對(duì)民族宗教信仰帶來(lái)較大的風(fēng)險(xiǎn)[11]。

DNA雜交、免疫擴(kuò)散和等電點(diǎn)聚焦等方法曾經(jīng)被用于肉類品種鑒定[12]，但這些方法大都存在成本高、基質(zhì)單一、對(duì)檢測(cè)對(duì)象要求高、工作量大、無(wú)法檢測(cè)深加工肉類等缺點(diǎn)[13]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前從基因角度檢測(cè)物種的真實(shí)屬性已經(jīng)成為主流檢測(cè)技術(shù)，規(guī)避了性狀檢測(cè)、蛋白檢測(cè)、化學(xué)成分檢測(cè)所存在的諸多局限[14]。Nataliav等[15]利用雞尾酒引物實(shí)現(xiàn)了物種的通用擴(kuò)增，采用條形碼技術(shù)鑒定肉類的成分；Guan Feng等[16]采用八重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法，可區(qū)分山羊、綿羊、鹿、水牛、牛、牦牛、豬和駱駝；馮海永等[17]采用七重PCR檢測(cè)方法，可區(qū)分豬、牛、綿羊、山羊、雞、馬和牦牛7 種動(dòng)物；楊冬燕等[18]對(duì)國(guó)外現(xiàn)有方法進(jìn)行優(yōu)化與完善，建立了豬、馬、牛、鴨多重實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）檢測(cè)體系，用于檢測(cè)羊肉制品摻假情況；熊蕊等[19]采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR技術(shù)，可從牛羊肉中檢測(cè)豬源性成分。但這些方法均存在一定的局限性，普通PCR方法及DNA條形碼技術(shù)由于操作繁瑣，準(zhǔn)確度與靈敏度不高，對(duì)樣本及實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，易造成污染等問(wèn)題，不適于檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的需要[20]；目前已建立的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)大多僅針對(duì)某一種羊肉進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法確定羊肉的具體種類[21]。

為提高肉制品中羊源性成分檢測(cè)方法的可操作性，建立建全羊肉具體種類的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)山羊、綿羊、麻羊3 種食用羊的基因序列，分別建立綿羊、山羊、羊亞科的專屬性real-time PCR檢測(cè)方法，對(duì)羊肉制品中的羊源性成分進(jìn)行檢測(cè)，以期為監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)手段與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用樣品包括確定基原的對(duì)照物種20 種，以及市場(chǎng)采購(gòu)樣品20 種。樣品采自養(yǎng)殖廠、研究所、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、電商、超市等。所有樣品通過(guò)合成引物[22-23]進(jìn)行線粒體基因測(cè)序驗(yàn)證，保證樣品的真實(shí)性。樣品的具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Table 1 Detailed information about the samples tested in this study

續(xù)表1

動(dòng)物基因組提取試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增試劑盒：Bio-Rad SsoAdvancedTMUniversal Probes Supermix、Tiangen SuperReal PreMix(Probe)、TransStart?Probe qPCR SuperMix、TaKaRa Premix ExTaqTM(Probe qPCR)。

1.2 儀器與設(shè)備

Applied Biosystems Veriti II PCR儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光PCR儀、PowerPac電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；GelDoc-It凝膠成像儀 美國(guó)UVP公司；Centrifuge 5427 R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ME2002E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；MK3渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司；P330核酸蛋白定量?jī)x 德國(guó)Implen公司；MM400行星球磨儀 德國(guó)Retsch公司；Milli-Q Academic實(shí)驗(yàn)室超純水儀美國(guó)Millipore公司；Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；SW-CJ-FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物及探針

將GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊、綿羊以及其他18 種動(dòng)物的cyt b基因序列運(yùn)用生物軟件進(jìn)行比對(duì)分析，選擇山羊（EU130780.1）、綿羊（KP228916.1）、羊亞科（MF503655.1）的基因序列進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探針熒光基因?yàn)镕AM，淬滅基團(tuán)為BHQ1，最終確定的引物組具體序列見(jiàn)表2。

表2 引物信息Table 2 Sequences of PRC primers and probes

1.3.2 real-time PCR方法建立

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行基因組提取，用核酸蛋白定量?jī)x確定DNA提取的效率與純度，進(jìn)行OD260nm/OD280nm值測(cè)定，測(cè)得值均在1.7～2.0之間，表明可用于PCR實(shí)驗(yàn)。real-time PCR包括10 μL 2×SsoFast Advanced Supermix real-time PCR預(yù)混液、DNA模板、可變引物和探針量以及去離子水，其體積為20 μL。通過(guò)改變引物濃度、探針濃度和退火溫度進(jìn)行方法的篩選與建立。引物終濃度分別為25、50、100 nmol/L和150 nmol/L，探針終濃度分別為5、12.5、25 nmol/L和50 nmol/L，退火溫度分別為56、58、60、62 ℃和64 ℃。

1.3.3 特異性實(shí)驗(yàn)

以20 種基原動(dòng)物基因組DNA（JY-1～JY-20）為模板，用建立的real-time PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)特異性。陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照在實(shí)驗(yàn)中同步進(jìn)行，進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

對(duì)模板DNA進(jìn)行倍比稀釋，質(zhì)量濃度設(shè)定為10-4、10-3、10-2、10-1、100、101ng/μL。作為反應(yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，確定模板DNA質(zhì)量濃度范圍與Ct值線性關(guān)系，同時(shí)根據(jù)原理，參考文獻(xiàn)[24]建立擴(kuò)增效率計(jì)算公式：擴(kuò)增效率/%=（lg稀釋倍數(shù)/lg2）/|標(biāo)曲斜率|×100，并建立本方法的判定原則。

1.3.5 檢出限實(shí)驗(yàn)

分別將山羊、綿羊肉樣品以1%、0.1%、0.01%三個(gè)水平摻入雞肉樣品中，充分混勻后，提取基因組DNA，作為檢測(cè)模板，分別使用山羊、綿羊、羊亞科檢測(cè)體系進(jìn)行肉樣水平檢出限檢測(cè)。

1.3.6 試劑一致性考察

考察不同公司實(shí)時(shí)熒光預(yù)混液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的一致性，分別進(jìn)行常見(jiàn)品牌的實(shí)時(shí)熒光預(yù)混液比對(duì)實(shí)驗(yàn)，確定不同試劑盒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。檢測(cè)體系僅替換real-time PCR預(yù)混液，其他條件均一致。

1.3.7 加工肉制品Ct值變化

確定肉制品影響DNA質(zhì)量的主要是殺菌環(huán)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)肉制品企業(yè)的殺菌方式主要為高溫殺菌、巴氏殺菌、輻照殺菌等。據(jù)此，采用對(duì)DNA影響最大的高溫殺菌方式對(duì)樣品進(jìn)行處理，確定殺菌工藝對(duì)DNA質(zhì)量的影響，以及本方法是否適用于加工后的肉制品。聯(lián)系肉制品生產(chǎn)企業(yè)獲取加工前綿羊、山羊生肉原料及最終成品肉制品，提取DNA后，依照建立的方法分別進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 方法適用性考察

對(duì)不同產(chǎn)地、不同基質(zhì)的肉及肉制品（表1）進(jìn)行檢測(cè)，確定3 種檢測(cè)方法的適用性。1.3.9 方法驗(yàn)證

為了保證方法的一致性和可重復(fù)性，起草組制定驗(yàn)證工作方案，邀請(qǐng)了山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心、河北省食品檢驗(yàn)研究院、國(guó)家副食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心5 家檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行方法驗(yàn)證，由驗(yàn)證單位獨(dú)立完成從DNA提取到結(jié)果判定的全過(guò)程驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

使用Bio-Rad CFX Manager 3.0.1224.1015軟件制作real-time PCR結(jié)果圖譜，使用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)real-time PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制相關(guān)的數(shù)據(jù)分析圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的設(shè)計(jì)篩選

圖1 山羊目標(biāo)序列比對(duì)分析Fig. 1 Target sequence alignment analysis of Capra

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)山羊、綿羊、羊亞科通用的引物探針，并對(duì)各物種的引物及探針進(jìn)行序列高級(jí)結(jié)構(gòu)分析比對(duì)，以確保其高度的特異性，防止出現(xiàn)二聚體、莖環(huán)及發(fā)卡等影響檢測(cè)效率的結(jié)構(gòu)。具體信息見(jiàn)圖1～3。

圖3 羊亞科目標(biāo)序列比對(duì)分析Fig. 3 Target sequence alignment analysis of Caprinae

2.2 real-time PCR方法建立

表3 real-time PCR體系篩選與建立（Ct值）Table 3 Screening and establishment of real-time fluorescence PCR

分別進(jìn)行引物濃度篩選、探針濃度篩選和退火溫度篩選，具體信息見(jiàn)表3。最終確定的real-time PCR方法為：PCR預(yù)混液（2×）10 μL，5’端、3’端引物（10 μmol/L）各0.2 μL，探針（10 μmol/L）0.1 μL，DNA模板（1～100 ng/μL）1 μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；35 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性15 s，58 ℃退火及延伸1 min，收集熒光）。

2.3 特異性結(jié)果

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相應(yīng)動(dòng)物源性成分有典型擴(kuò)增曲線且Ct值均小于25，其他動(dòng)物源性成分均未檢出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想，均能達(dá)到檢測(cè)要求，其中羊亞科源性檢測(cè)可同時(shí)檢測(cè)綿羊、山羊、麻羊。具體檢測(cè)情況見(jiàn)圖4。

圖4 特異性檢測(cè)圖譜Fig. 4 Specificity evaluation

2.4 靈敏度結(jié)果

在Ct值小于或者等于30時(shí)，靈敏度均可達(dá)10-3ng/μL，滿足多種檢測(cè)要求，在線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，山羊、綿羊、羊亞科檢測(cè)方法的R2分別為0.999、0.997、0.999，擴(kuò)增效率分別為99.37%、92.48%、96.32%。具體檢測(cè)情況見(jiàn)圖5。

圖5 靈敏度實(shí)驗(yàn)圖譜Fig. 5 Sensitivity evaluation

2.5 檢出限結(jié)果

圖6 檢出限實(shí)驗(yàn)圖譜Fig. 6 Detection limit evaluation

圖6 及表4顯示，在雞肉中摻入1%、0.1%的山羊、綿羊肉時(shí)，本方法檢測(cè)Ct值均小于30。而在0.01%的摻入比例實(shí)驗(yàn)時(shí)，相應(yīng)Ct值接近甚至超過(guò)30 個(gè)循環(huán)，對(duì)其判定可能會(huì)出現(xiàn)偏差。根據(jù)以上驗(yàn)證結(jié)果，本方法的檢出限為0.1%。

表4 檢出限檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection limit validation

2.6 試劑一致性分析

選擇Bio-Rad SsoAdvancedTMUniversal Probes Supermix、Tiangen SuperReal PreMix(Probe)、TransStart?Probe qPCR SuperMix、TaKaRa Premix ExTaqTM(Probe qPCR) 4 種real-time PCR預(yù)混液對(duì)方法進(jìn)行重復(fù)性考察，結(jié)果顯示，不同試劑表現(xiàn)出一致的檢測(cè)結(jié)果，表明本方法的試劑一致性較好，常用實(shí)時(shí)熒光預(yù)混液均適用于本方法的檢測(cè)。具體情況見(jiàn)圖7及表5。

圖7 試劑一致性實(shí)驗(yàn)圖譜Fig. 7 Reagent consistency evaluation

表5 試劑一致性結(jié)果（Ct值）Table 5 Reagent consistency validation

2.7 加工肉制品Ct值變化情況分析

如圖8所示，原料肉與最終產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異，但加工后的成品與原料肉相比Ct值差異在3以內(nèi)，且Ct值均在30以下，有典型擴(kuò)增曲線，不影響結(jié)果的判斷。因此，本方法適用于生鮮肉及肉制品的檢測(cè)。

圖8 生鮮肉與加工肉制品real-time PCR結(jié)果比較Fig. 8 Comparison of real-time PCR results of raw meat and processed meat

2.8 方法適用性分析

山羊、綿羊、羊亞科源性成分檢測(cè)的10 個(gè)樣品3 個(gè)濃度水平Ct值均小于30，且具有典型擴(kuò)增曲線，適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期，滿足檢測(cè)要求，見(jiàn)圖9及表6。

圖9 適用性實(shí)驗(yàn)圖譜Fig. 9 Applicability evaluation

表6 適用性檢測(cè)結(jié)果（Ct值）Table 6 Applicability validation

2.9 方法驗(yàn)證

由成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院提供驗(yàn)證樣品580 個(gè)，其中特異性驗(yàn)證樣品100 個(gè)，適用性驗(yàn)證樣品300 個(gè)，靈敏度驗(yàn)證樣品90 個(gè)，檢出限驗(yàn)證樣品90 個(gè)；由驗(yàn)證單位獨(dú)立完成從DNA提取到結(jié)果判定的全過(guò)程驗(yàn)證試驗(yàn)。5 家驗(yàn)證單位均獲得了滿意的驗(yàn)證結(jié)果，驗(yàn)證匯總結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證結(jié)果匯總Table 7 Summary of validation results from five domestic authoritative institutions

3 結(jié) 論

鑒于肉類摻假現(xiàn)象的出現(xiàn)，基于DNA的肉類鑒定方法已成為食品真實(shí)性鑒定的首選方法[25]。本研究開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了羊亞科3 種real-time PCR檢測(cè)普通肉制品的方法，分別為羊亞科通用檢測(cè)方法、山羊檢測(cè)方法及綿羊檢測(cè)方法。這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用性強(qiáng)，可用于羊肉類原料及加工肉的鑒別，以及肉制品中羊源性成分的檢測(cè)。3 種方法的反應(yīng)體系及檢測(cè)步驟一致，可在一次real-time PCR實(shí)驗(yàn)中同步完成3 種方法的檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法是一種高效、靈敏、特異、高實(shí)用性的羊亞科專屬性鑒別方法。

本方法以real-time PCR探針?lè)榛A(chǔ)，從基因水平對(duì)肉類DNA進(jìn)行檢測(cè)。real-time PCR技術(shù)利用熒光基團(tuán)的淬滅與激發(fā)[26]，在反應(yīng)過(guò)程中可以通過(guò)熒光信號(hào)反映DNA擴(kuò)增情況，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[27]，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，直接獲得檢測(cè)結(jié)果。整個(gè)過(guò)程閉管操作，不需要進(jìn)行酶切、染色、電泳、測(cè)序等傳統(tǒng)PCR方法所需的繁瑣步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，減少了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的污染以及染色試劑對(duì)操作人員造成的潛在危害[28]。

本方法的成功依賴于以下3 個(gè)方面：適當(dāng)?shù)陌谢蛭稽c(diǎn)、專屬性極強(qiáng)的引物和探針以及DNA真實(shí)性考察。首先，根據(jù)在動(dòng)物物種中高度保守且母體遺傳的cyt b基因[29]，并對(duì)20 個(gè)物種進(jìn)行了目的基因序列比對(duì)，以確保該方法的有效性。其次，用DNAStar v7.1.0.44軟件[30]設(shè)計(jì)了針對(duì)目標(biāo)物種特定DNA序列的引物和探針，并對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以確保引物與探針不存在莖環(huán)及發(fā)夾等影響擴(kuò)增效率的結(jié)構(gòu)[31]。通過(guò)豬、牛、綿羊、雞、鴨、鵝等20 個(gè)物種的特異性鑒定，驗(yàn)證了所有引物和探針的特異性，保證了方法的特異性。最后，本實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物肉類樣品和PCR產(chǎn)物均經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，以確保樣品的真實(shí)性[32]，整個(gè)方法依據(jù)分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行設(shè)計(jì)、優(yōu)化與驗(yàn)證[33]。

本研究的目的是建立一種快速、高通量的real-time PCR方法，以鑒定市場(chǎng)上銷售的肉制品的羊源性成分。因此，在建立了羊亞科3 種檢測(cè)方法后，本實(shí)驗(yàn)邀請(qǐng)了5 家中國(guó)權(quán)威的檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)該方法進(jìn)行系統(tǒng)、科學(xué)地驗(yàn)證。在驗(yàn)證之前，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了方法驗(yàn)證的內(nèi)容和步驟，包括方法的特異性、適用性、靈敏度、擴(kuò)增效率和檢出限。聯(lián)合驗(yàn)證的結(jié)果表明，該方法的特異性滿足預(yù)期，僅能擴(kuò)增目標(biāo)物種，不能擴(kuò)增其他非目標(biāo)物種；方法的擴(kuò)增效率達(dá)90%以上，檢出限均可達(dá)0.1%；此外，對(duì)真實(shí)的市售產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%，方法適用性滿足檢測(cè)要求。鑒于這些方法是基于real-time PCR原理進(jìn)行開(kāi)發(fā)，希望增加定量檢測(cè)方法，為肉制品的真實(shí)性鑒定和摻假提供了更加準(zhǔn)確和科學(xué)的檢測(cè)方法，為監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)依據(jù)。