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        A 群輪狀病毒一步法RT-ddPCR 方法的建立

        2020-07-04 10:58:44徐蕾蕊魏詠新魏海燕張西萌付溥博趙曉娟
        食品科學(xué) 2020年12期
        關(guān)鍵詞:染毒拷貝定量

        徐蕾蕊,馬 丹,魏詠新,李 丹,魏海燕,劉 莉,張西萌,汪 琦,付溥博,趙曉娟,曾 靜*

        (北京海關(guān)技術(shù)中心,北京 100026)

        20世紀(jì)70年代之后,各國(guó)學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)諾如病毒(norovirus,NoV)、輪狀病毒(rotavirus,RV)、人星狀病毒(human astrovirus,HAstV)、腺病毒、札如病毒等是引起兒童、老年人以及免疫力低下人群急性水樣腹瀉和重癥腹瀉的主要病原體[1-4]。其中,RV是世界范圍內(nèi)引起兒童急性腹瀉和兒童重癥腹瀉的最常見病毒,全球每年約有1.14億兒童發(fā)生RV腹瀉,最近監(jiān)測(cè)顯示全國(guó)范圍內(nèi)因腹瀉入院的5 歲以下兒童中RV檢測(cè)陽性率高達(dá)47.8%[5-6]。

        R V是一種R N A病毒,屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavrus)。RV基因組由11 條雙鏈RNA組成,共編碼11 種蛋白質(zhì),包括6 種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1~4、VP6和VP7)和5 種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1~5)[7-8]。根據(jù)抗原蛋白VP6不同,RV可分為A~H八個(gè)群,只有A、B、C和H群RV能感染人類,A群RV是嬰幼兒腹瀉的主要病原體[9-10]。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3編碼基因序列具有高度保守性[11-12],參與RV侵染宿主細(xì)胞過程,具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[13-14]。本研究根據(jù)NSP3基因序列特征,建立檢測(cè)A群RV一步法逆轉(zhuǎn)錄微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法,該方法不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可實(shí)現(xiàn)A群RV的精準(zhǔn)定量,旨在為開展A群RV的流行病學(xué)調(diào)查及感染水平的定量分析提供新的技術(shù)手段和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        蟶子、胡蘿卜、生食蔬菜(生菜)、冷凍桑葚 市購(gòu)。

        A群RV陽性糞便樣本(2003—2004年收集自北京兒童醫(yī)院)均為本室分離、鑒定和保存;NoV(基因型GI、GII)、HAstV、甲肝病毒RNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。

        焦碳酸二乙酯(diethyl paracabonate,DEPC)處理水北京天根生化科技有限公司;Trizol、質(zhì)粒載體pcDNAII、SuperScript?III Platinum?One-Step Quantitative RT-PCR System 美國(guó)Invitrogen公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit 德國(guó)Qiagen公司;Dynabeads?mRNA Purification Kit 美國(guó)Life Technology公司;One-step RT-ddPCR advanced kit for probes 美國(guó)Bio-Rad公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        7900HT Fast RT-PCR儀、Veriti 96-Well Thermal Cycler 美國(guó)ABI公司; QX200 Droplet Digital PCR System 美國(guó)Bio-Rad公司;CP413電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

        應(yīng)用QIAamp Viral RNA Mini Kit從A群RV陽性的生物糞便樣品中提取RNA,采用針對(duì)A群RV NSP3基因的特異性引物ATG CTC AAG ATG GAG TCT ACTC/GGT CAC ATA ACG CCCC TAT AG擴(kuò)增NSP3基因全長(zhǎng),長(zhǎng)度1 049 bp。將該特定基因片段與pcDNAII連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNAII-RV,轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌,通過大腸桿菌的增殖,大量制備提取pcDNAII-RV;采用BamHI限制性內(nèi)切酶將pcDNAIIRV單酶切;以酶切后的線性化pcDNAII-RV為模板,通過T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄合成獲得A群RV NSP3基因RNA片段,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期后,根據(jù)ISO指南35∶2006[15]要求,制備A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值為(5.8±1.5)×107拷貝/μL,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 引物探針設(shè)計(jì)和篩選

        根據(jù)A群RV VP6和NSP3基因序列,通過NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì),利用Prime Express軟件V4.0(ABI, Foster City, CA, USA)設(shè)計(jì)出4 組引物和探針組合,用提取的A群RV RNA和SuperScript?III Platinum?One-Step Quantitative RT-PCR System對(duì)設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行篩選。反應(yīng)參數(shù):50 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,95 ℃熱啟動(dòng)2 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火及延伸1 min,40 個(gè)循環(huán)。

        1.3.3 一步法RT-ddPCR驗(yàn)證篩選的引物探針的特異性

        應(yīng)用提取的A群RV RNA和NoV(基因型GI、GII)、HAstV、甲肝病毒等其他常見食源性病毒RNA進(jìn)行一步法RT-ddPCR方法擴(kuò)增,驗(yàn)證篩選的引物探針的特異性。參考One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系和生成微滴。將微滴置于Veriti 96-Well Thermal Cycler中按以下條件進(jìn)行反應(yīng):60 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min,95 ℃熱啟動(dòng)5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火延伸1 min,40 個(gè)循環(huán);98 ℃酶滅活10 min;4 ℃ Hold。升降溫速不低于2.5 ℃/s。反應(yīng)結(jié)束后,用QX200微滴讀取儀檢測(cè)得到20 μL反應(yīng)體系中RNA的拷貝濃度。按照下式計(jì)算模板RNA拷貝濃度:

        1.3.4 一步法RT-ddPCR擴(kuò)增溫度優(yōu)化

        按One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系和進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè),以出現(xiàn)最高的陽性微滴簇為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)退火溫度(52.5~62.5 ℃)進(jìn)行優(yōu)化。

        1.3.5 A群RV一步法RT-ddPCR方法學(xué)考察

        1.3.5.1 定量限和準(zhǔn)確度分析

        將制備的A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別按稀釋倍數(shù)102、103、104、105、106、2×106、4×106和107稀釋,每個(gè)稀釋倍數(shù)各取2 μL作為模板,按One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系和進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)。每個(gè)梯度進(jìn)行4 個(gè)重復(fù)檢測(cè),計(jì)算各檢測(cè)梯度的相對(duì)偏差,確定各ddPCR檢測(cè)方法的定量限,分析各ddPCR檢測(cè)體系的檢測(cè)值與理論值之間的關(guān)系,驗(yàn)證其檢測(cè)準(zhǔn)確度。

        1.3.5.2 重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性分析

        將制備的A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 倍梯度稀釋,取高、低兩個(gè)梯度各2 μL,按One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系和進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)。取3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平行樣品管進(jìn)行稀釋,每個(gè)樣品每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)3 次,同時(shí)設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照(以DEPC水代替模板RNA)。每隔1 周復(fù)檢1 次,連續(xù)監(jiān)測(cè)3 次。計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù),分析檢測(cè)方法的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性。

        1.3.6 不同食品基質(zhì)中的A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)

        采用本實(shí)驗(yàn)室保存的A群RV陽性糞便制備染毒樣品。將該陽性糞便樣品充分混勻后,表層、中層、底層3 個(gè)不同取樣點(diǎn)吸取100 μL樣品溶液,經(jīng)Trizol充分提取RNA后,用建立的A群RV一步法RT-ddPCR方法檢測(cè),每個(gè)采樣點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)5 次,采用單因素方差分析方法比較不同采樣點(diǎn)的檢測(cè)值,確定該陽性糞便樣品中A群RV濃度,梯度稀釋制備成從高到低4 個(gè)濃度A群RV染毒液。

        1.3.6.1 食品樣品類型及染毒

        選取有代表性的4 種食品基質(zhì):貝類(蟶子)、硬表面食品(胡蘿卜)、生食蔬菜(生菜)和軟質(zhì)水果(冷凍桑葚)。染毒前先檢查牡蠣樣品的外殼是否完整,提取消化腺后勻漿,分裝為2 g/份;胡蘿卜分裝為若干份,生菜和冷凍桑葚分裝為25 g/份。分別取各濃度染毒液100 μL加入分裝好的蟶子消化腺,點(diǎn)涂到胡蘿卜表面(點(diǎn)涂面積≤100 cm2),添加到分裝好的生菜和冷凍桑葚表面,室溫吸附30 min,每種食品類型的每個(gè)染毒梯度均添加3 個(gè)樣品,每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

        1.3.6.2 染毒樣品前處理及核酸提取

        參照歐盟CEN ISO/TS 15216:2013[16]對(duì)染毒的食品樣品進(jìn)行病毒洗脫和濃縮,然后采用Trizol提取病毒RNA溶于100 μL DEPC水,再進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)。

        1.3.6.3 回收率計(jì)算

        不同濃度染毒樣品經(jīng)前處理、核酸提取、一步法RT-ddPCR檢測(cè)得到的檢出值與染毒液中A群RV理論含量的比值即為回收率,當(dāng)回收率高于1%時(shí),認(rèn)為人工染毒樣品中模擬病毒的回收和提取有效。

        1.4 統(tǒng)計(jì)分析

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 特異性引物探針

        根據(jù)A群RV的VP6和NSP3基因序列,設(shè)計(jì)出4 組引物和探針組合。篩選結(jié)果表明:僅VP6-F2/R2/P2(序列未給出)未擴(kuò)增出靶基因(圖1)。特異性驗(yàn)證結(jié)果說明,擴(kuò)增強(qiáng)度最大的NSP3-F1/R1/P1(序列見表1)特異性較好(圖2),故選取該組引物探針建立A群RV一步法RT-ddPCR方法。

        圖1 熒光PCR方法篩選A群RV引物探針Fig. 1 Screening of primers and probes by fluorescence PCR method for RV group A strains

        圖2 熒光PCR方法驗(yàn)證NSP3-F1/R1/P1特異性Fig. 2 Speci ficity veri fication of NSP3-F1/R1/P1 by fluorescence PCR method

        表1 一步法RT-ddPCR引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences used for RT-ddPCR

        2.2 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的建立及退火溫度優(yōu)化

        2.2.1 一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法

        應(yīng)用篩選的引物探針NSP3-F1/R1/P1,建立A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法。該法僅能檢出A群RV RNA,出現(xiàn)陽性擴(kuò)增的微滴,其余病毒RNA均呈陰性微滴,證明該檢測(cè)方法具有良好的特異性(圖3)。

        圖3 A群RV一步法RT-ddPCR體系特異性Fig. 3 Specificity of RT-ddPCR for assay of RV group A strains

        2.2.2 退火溫度的優(yōu)化

        退火溫度55 ℃和60 ℃均可出現(xiàn)比較明顯的陽性微滴簇,且在55 ℃擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于60 ℃,因此,將55 ℃作為最佳退火溫度(圖4)。

        圖4 A群RV一步法RT-ddPCR體系退火溫度優(yōu)化Fig. 4 Optimization of annealing temperature for RT-ddPCR assay of RV group A strains

        2.3 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的定量限和準(zhǔn)確度

        將制備的A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別按稀釋倍數(shù)102、103、104、105、106、2×106、4×106和107稀釋,每個(gè)稀釋倍數(shù)的理論濃度分別為580 000.00、58 000.00、5 800.00、580.00、58.00、29.00、14.50、5.80 拷貝/μL。結(jié)果表明,理論濃度為580 000.00 拷貝/μL的溶液超過了一步法RT-ddPCR的檢測(cè)范圍,其他稀釋梯度的檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為3.6%~16.0%,且理論濃度與檢測(cè)濃度之間呈線性關(guān)系,方程:Y=1.029X-11.444,R2=0.998 7,P<0.000 1,說明A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法可準(zhǔn)確定量檢測(cè)A群RV RNA濃度(表2,圖5)。當(dāng)A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至5 拷貝/μL左右時(shí),理論值與檢測(cè)體系檢測(cè)的實(shí)際值仍然接近,4 次重復(fù)的RSD均小于25%,表明該檢測(cè)體系定量限可達(dá)5 拷貝/μL。

        表2 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的定量限和準(zhǔn)確度Table 2 Limit of quanti fication and accuracy of RT-ddPCR

        圖5 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的線性關(guān)系Fig. 5 Linearity of RT-ddPCR

        2.4 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性

        對(duì)于濃度5.8×103拷貝/μL,組內(nèi)RSD為5.79%、6.27%和5.70%,與理論值的偏差分別為0.17%、0.43%和2.68%;濃度5.8 拷貝/μL,組內(nèi)RSD分別為10.40%、12.09%和6.01%,與理論值的偏差分別為0.52%、5.86%和3.28%(表3)。單因素方差分析發(fā)現(xiàn),2 個(gè)濃度的3 次重復(fù)檢測(cè)值之間差異不顯著(P>0.05),說明A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性。

        表3 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性(n=9)Table 3 Repeatability of RT-ddPCR (n= 9)

        2.5 A群RV陽性糞便樣品一步法RT-ddPCR定量結(jié)果

        不同取樣部位的一步法RT-ddPCR檢測(cè)平均值相近,單因素方差分析表明,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.122),Tukey多重比較分析發(fā)現(xiàn),不同取樣點(diǎn)定量結(jié)果之間沒有顯著差異(P>0.05),同一取樣點(diǎn)的5 次重復(fù)取樣檢測(cè)RSD均小于15%(表4)。將不同采樣點(diǎn)檢測(cè)值的平均值作為A群RV陽性糞便樣品的濃度,為1.579×1 06拷貝/μ L,染毒液濃度分別為1.5 7 9×1 04、1.579×103、1.579×102拷貝/μL和1.579×101拷貝/μL。

        表4 A群RV陽性糞便樣品一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)結(jié)果Table 4 Quantitative results of RV group A strains in positive fecal samples by RT-ddPCR

        2.6 不同食品基質(zhì)中A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)結(jié)果

        分別以蟶子、胡蘿卜、生菜和冷凍桑葚為代表的4 種食品基質(zhì)(貝類消化腺、硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果)的回收率分別為27.82%~53.82%、23.08%~38.27%、2.37%~7.63%和1.15%~2.73%。單因素方差分析結(jié)果表明,各染毒量中不同食品基質(zhì)的A群RV檢出量和回收率差異顯著(P<0.001),蟶子和胡蘿卜的檢出量和回收率明顯高于生菜和冷凍桑葚。冷凍桑葚中各染毒量的回收率均小于3%,而當(dāng)實(shí)際染毒量為1 579 拷貝時(shí),從生菜和冷凍桑葚染毒樣品檢出量的RSD大于25%,有的染毒樣品不能檢出A群RV RNA,說明提取的RNA溶液濃度低于一步法RT-ddPCR的檢測(cè)限(表5)。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey多重比較發(fā)現(xiàn),各染毒劑量下,不同食品基質(zhì)之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性(P<0.05)。

        3 討 論

        dPCR可將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)由經(jīng)典指數(shù)形式轉(zhuǎn)換為單分子信號(hào),將檢測(cè)靈敏度提高到單分子水平[18-19]。目前,ddPCR是常見的dPCR系統(tǒng)之一,采用油包水的方式分割PCR體系為微滴,PCR后,微滴逐一通過檢測(cè)器,有熒光信號(hào)的微滴記為“1”(存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物),無熒光信號(hào)的微滴記為“0”(不存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物),從而產(chǎn)生“數(shù)字”的概念[20-21]。按照泊松分布原理,根據(jù)陽性微滴的數(shù)量,計(jì)算反應(yīng)體系內(nèi)的模板拷貝數(shù)濃度,實(shí)現(xiàn)核酸的精準(zhǔn)定量[21-24]。因此,ddPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增循環(huán)閾值,可直接定量檢測(cè)核酸,屬于終點(diǎn)檢測(cè),某些程度上,擴(kuò)增不會(huì)造成定量的偏倚,對(duì)PCR抑制劑更為耐受,在改善定量分析準(zhǔn)確性和變異性上有較大優(yōu)勢(shì)[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn),A群RV一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液理論濃度相符,相關(guān)系數(shù)為0.998 7,定量范圍包括104~100拷貝/μL 5 個(gè)數(shù)量級(jí),定量限可達(dá)5 拷貝/μL,檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性。

        不同的食品基質(zhì)A群RV的污染方式不同[27]:貝類通過濾食將水體中的A群RV濃縮到消化腺內(nèi),水果(包括硬表面水果和軟質(zhì)水果)和生食蔬菜等通過澆灌含有A群RV的肥料和灌溉水被污染;此外,食品中蛋白質(zhì)、多糖等某些大分子物質(zhì),能直接影響病毒洗脫、RNA提取及分子檢測(cè)過程,影響定量檢測(cè)結(jié)果,因此不同的食品基質(zhì)需要采用針對(duì)性的前處理方法以洗脫和濃縮病毒顆粒。本研究參照歐盟的CEN ISO/TS 15216:2013[16]對(duì)染毒的食品樣品進(jìn)行洗脫和濃縮。通過計(jì)算檢出量和回收率發(fā)現(xiàn),不同食品基質(zhì)中存在顯著差異(P<0.001),且蟶子和胡蘿卜明顯高于生菜和冷凍桑葚,而低染毒量時(shí),部分生菜和冷凍桑葚染毒樣品未檢出A群RV RNA,說明食品基質(zhì)對(duì)A群RV一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)量有較大影響。

        貝類中病毒洗脫和濃縮主要通過將貝類消化腺撕裂后,采用蛋白酶K和65 ℃高溫處理相結(jié)合的方法破壞消化腺組織,釋放病毒顆粒[28],再超速離心濃縮病毒顆粒,直接提取RNA。該方法已成功在0.15 g牡蠣消化組織中檢測(cè)出諾如病毒[29-30],相對(duì)于采用異硫氰酸酯/苯酚為主的試劑直接提取食品中的食源性病毒RNA方法回收率更高[31-32]。洗脫液的pH值對(duì)軟質(zhì)水果與生食蔬菜中食源性病毒顆粒的洗脫效果影響比較大,通常采用堿性緩沖液(pH≥9)洗脫此類食品表面的食源性病毒[33]。同時(shí)采用牛肉膏和甘氨酸減少病毒顆粒對(duì)食品基質(zhì)的非特異性吸附,可分別使此類樣品中的食源性病毒回收率提高數(shù)倍[34]。草莓、桑葚等軟質(zhì)水果含有的果膠會(huì)影響洗脫效果,需要采用果膠酶破壞這些果膠分子,保證這類軟質(zhì)水果的洗脫效率。硬表面食品的范圍可包括堅(jiān)果、蘋果、胡蘿卜等多種食品類型,它們的共同點(diǎn)是表面比較堅(jiān)硬,可通過棉拭子擦拭法將食品表面吸附的病毒顆粒擦拭下來,操作簡(jiǎn)便,具有相當(dāng)?shù)幕厥章省?/p>

        定量食品中的A群RV需要將病毒與食品基質(zhì)分離、濃縮,得到病毒懸液,提取RNA后,用A群RV一步法RT-ddPCR進(jìn)行檢測(cè)。在不考慮病毒分離、濃縮效率和RNA核酸提取效率時(shí),本研究建立的A群RV一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的檢測(cè)限可達(dá)到5 拷貝/μL。但病毒濃縮、RNA提取的過程中存在回收率和RNA提取效率未知等不確定因素,很難檢測(cè)到食品中可能存在的全部病毒核酸,因此利用一步法RT-ddPCR方法檢測(cè)的病毒核酸含量不等于實(shí)際樣品中食源性病毒的實(shí)際載量。后續(xù)研究中,需要建立一種簡(jiǎn)便可操作性強(qiáng)的過程控制程序監(jiān)控病毒濃縮、核酸提取過程,反映實(shí)際樣品中A群RV回收率,并且通過回收率計(jì)算樣品中A群RV的實(shí)際載量。

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