蔡金鳳， 曹宇碩， 王 棪， 陳海麗， 胡綠蔭， 朱召芹

（上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗醫(yī)學(xué)科，上海 201508）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是繼嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）后出現(xiàn)的又一種能引起人嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病的新型冠狀病毒——嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引發(fā)的傳染病[1]。COVID-19傳染性強、臨床表現(xiàn)多樣，給疫情防控和疾病治療帶來了一定的困難[2]。

病毒性肺炎合并細菌或真菌感染是導(dǎo)致病情加重的常見原因[3-5]，需要在臨床診治過程中特別注意。新生隱球菌是臨床常見的致病性真菌之一，可引起隱球菌性肺炎和腦膜炎等多部位的真菌感染，也是真菌性腦膜炎最常見的致病菌，尤其易導(dǎo)致免疫抑制的宿主感染，特別是獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者的感染[3]。近年來，隨著AIDS、腫瘤化療和器官移植等患者的增多，隱球菌病的發(fā)病率呈上升趨勢[6-8]。近期上海市公共衛(wèi)生臨床中心院收治1例COVID-19合并新生隱球菌血流感染患者，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

患者，男性，81歲，既往有“高血壓病、冠心病、心功能不全、房顫、腎功不全、肝功能異?！辈∈?。于2020年1月26日出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、鼻塞、流涕等癥狀，外院急診查血常規(guī)示淋巴細胞7.7%、甲型和乙型流感病毒抗原檢測均陰性。胸部電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）示：兩肺散在多發(fā)間質(zhì)性炎癥。SARS-CoV-2核酸檢測陽性。于2020年1月28日轉(zhuǎn)至上海市公共衛(wèi)生臨床中心治療。入院完善相關(guān)檢查，患者患重癥肺炎、呼吸衰竭，氧飽和度進行性下降，給予氣管內(nèi)插管呼吸機輔助通氣。2020年2月4日病情加重，行氣管切開術(shù)，2月7日病情進一步加重，行體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治療。

2月24日，實驗室回報2月22日送檢血培養(yǎng)報陽，報陽血培養(yǎng)樣本涂片找到真菌，培養(yǎng)物經(jīng)鑒定為新生隱球菌。該患者當(dāng)日血清樣本隱球菌抗原檢測結(jié)果為1∶256。

2 細菌培養(yǎng)

無菌采集患者入院第25天雙側(cè)靜脈血，分別注入2套厭氧血培養(yǎng)瓶和需氧血培養(yǎng)瓶中，置配套的BACTEX FX 200血培養(yǎng)儀（美國BD公司）內(nèi)孵育。培養(yǎng)57 h后，其中1瓶需氧血培養(yǎng)瓶報陽，報陽血培養(yǎng)樣本分別轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和沙保弱瓊脂（上?？片敿喂荆?，分別置35 ℃、5% CO2及28℃環(huán)境下培養(yǎng)，同時進行涂片和革蘭染色。涂片鏡檢可見圓形真菌孢子（圖1），疑似隱球菌。從血培養(yǎng)瓶中吸取適量樣本于離心管中，加蒸餾水破壞紅細胞，1 581×g離心，取沉淀物1滴置于載玻片上，加墨汁1滴，覆蓋玻片，在顯微鏡高倍鏡下可見圓形菌體，外有1圈透明的莢膜，內(nèi)有反光顆粒（圖2）。培養(yǎng)24 h后，哥倫比亞血瓊脂平板上見灰色、濕潤菌落生長；48 h后哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板上可見灰白色，較大菌落生長（圖3）。采用Microflex MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定儀（德國布魯克公司）鑒定為新生隱球菌格魯比變種，分值為1.793（圖4）。血培養(yǎng)的另一需氧瓶5 d未見細菌生長，將瓶中培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和沙保弱瓊脂，分別置35 ℃、5% CO2及28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，次日可見灰色、濕潤菌落生長，經(jīng)涂片和革蘭染色，鏡下可見圓形真菌孢子，質(zhì)譜鑒定為新生隱球菌格魯比變種。2瓶厭氧血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5 d無厭氧菌生長。

圖1 血培養(yǎng)物革蘭染色鏡下結(jié)果（×1 000）

圖2 血培養(yǎng)物去紅細胞后墨汁染色鏡下結(jié)果（×100）

圖3 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)24 h菌落生長情況

圖4 Micro flex MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

綜合檢查及培養(yǎng)鑒定結(jié)果，確認病原菌為新生隱球菌。當(dāng)日檢測該患者血清隱球菌抗原為陽性，滴度為1∶256。隨后立即予以伏立康唑抗真菌治療。2月25日血清隱球菌抗原為陽性，滴度降為1∶128。2月24日再次進行血培養(yǎng)，5 d后需氧血培養(yǎng)瓶和厭氧血培養(yǎng)瓶均為陰性。

3 討論

新生隱球菌含新生變種和格魯比變種，廣泛分布于自然界，主要侵犯免疫受損的機體，多在機體免疫力低下時引起感染。劉茜等[9]對COVID-19死亡患者尸體解剖大體病理觀察的報告提示COVID-19主要引起以深部氣道和肺泡損傷為特征的炎性反應(yīng)。外周血淋巴細胞減少是COVID-19患者的臨床特征之一，也是該病確診的診斷條件之一。本例患者入院時的免疫學(xué)指標(biāo)水平較低，淋巴細胞絕對數(shù)0.63×109/L，CD4+T淋巴細胞絕對值為113 cell/uL，CD8+T淋巴細胞絕對值為48 cell/uL，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值為3.507，CD19百分比為44%，白細胞介素（interleukin，IL）-6為481.54 pg/mL，IL-10為6.85 pg/mL，符合COVID-19的臨床表現(xiàn)。患者降鈣素原（procalcitonin，PCT）為1.21 ng/mL，C反應(yīng)蛋白81.4 mg/L，提示有混合感染的可能。人類免疫缺陷病毒抗體陰性。

新生隱球菌作為一種常見的條件致病菌，易引起免疫功能低下患者感染。本例患者在病程進展中，外周血淋巴細胞計數(shù)和CD4+T細胞進行性減低，外周血炎癥因子IL-6、PCT、C反應(yīng)蛋白進行性上升。對該患者的血液樣本分別進行二代測序檢測，檢出人類皰疹病毒5型。以上結(jié)果均提示患者存在免疫功能受損，因此容易合并其他機會性感染。本病例提示，COVID-19患者在免疫功能受損的情況下，可以合并包括新生隱球菌在內(nèi)的機會性感染，進而導(dǎo)致病情惡化，且比較復(fù)雜。

實驗室診斷過程中，臨床樣本的處理方法直接影響著檢出率的高低，必要時應(yīng)對臨床樣本進行離心處理，以提高檢出率。酵母菌在需氧瓶中易生長，多數(shù)酵母菌2～5 d可被檢測出，某些酵母菌如新生隱球菌則需延長孵育時間[10]。本例患者一側(cè)需氧血培養(yǎng)瓶報陽后的鑒定結(jié)果為新生隱球菌，另一側(cè)需氧血培養(yǎng)瓶血培養(yǎng)儀培養(yǎng)結(jié)果為陰性，故將瓶內(nèi)培養(yǎng)物繼續(xù)進行平板培養(yǎng)，以避免遺漏因菌的濃度未達儀器檢測閾值而報假陰性的情況發(fā)生。另外，我們對報陽血培養(yǎng)樣本進行紅細胞裂解處理，并行墨汁染色，可以提高顯微鏡鏡檢檢出率。實驗室病原體診斷需要多種方法聯(lián)合應(yīng)用。