蔡金鳳， 曹宇碩， 王 棪， 陳海麗， 胡綠蔭， 朱召芹

（上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，上海 201508）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是繼嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）后出現(xiàn)的又一種能引起人嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病的新型冠狀病毒——嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引發(fā)的傳染病[1]。COVID-19傳染性強(qiáng)、臨床表現(xiàn)多樣，給疫情防控和疾病治療帶來(lái)了一定的困難[2]。

病毒性肺炎合并細(xì)菌或真菌感染是導(dǎo)致病情加重的常見(jiàn)原因[3-5]，需要在臨床診治過(guò)程中特別注意。新生隱球菌是臨床常見(jiàn)的致病性真菌之一，可引起隱球菌性肺炎和腦膜炎等多部位的真菌感染，也是真菌性腦膜炎最常見(jiàn)的致病菌，尤其易導(dǎo)致免疫抑制的宿主感染，特別是獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者的感染[3]。近年來(lái)，隨著AIDS、腫瘤化療和器官移植等患者的增多，隱球菌病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[6-8]。近期上海市公共衛(wèi)生臨床中心院收治1例COVID-19合并新生隱球菌血流感染患者，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

患者，男性，81歲，既往有“高血壓病、冠心病、心功能不全、房顫、腎功不全、肝功能異?！辈∈?。于2020年1月26日出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、鼻塞、流涕等癥狀，外院急診查血常規(guī)示淋巴細(xì)胞7.7%、甲型和乙型流感病毒抗原檢測(cè)均陰性。胸部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）示：兩肺散在多發(fā)間質(zhì)性炎癥。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性。于2020年1月28日轉(zhuǎn)至上海市公共衛(wèi)生臨床中心治療。入院完善相關(guān)檢查，患者患重癥肺炎、呼吸衰竭，氧飽和度進(jìn)行性下降，給予氣管內(nèi)插管呼吸機(jī)輔助通氣。2020年2月4日病情加重，行氣管切開(kāi)術(shù)，2月7日病情進(jìn)一步加重，行體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治療。

2月24日，實(shí)驗(yàn)室回報(bào)2月22日送檢血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)，報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)樣本涂片找到真菌，培養(yǎng)物經(jīng)鑒定為新生隱球菌。該患者當(dāng)日血清樣本隱球菌抗原檢測(cè)結(jié)果為1∶256。

2 細(xì)菌培養(yǎng)

無(wú)菌采集患者入院第25天雙側(cè)靜脈血，分別注入2套厭氧血培養(yǎng)瓶和需氧血培養(yǎng)瓶中，置配套的BACTEX FX 200血培養(yǎng)儀（美國(guó)BD公司）內(nèi)孵育。培養(yǎng)57 h后，其中1瓶需氧血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)，報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)樣本分別轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和沙保弱瓊脂（上?？片敿喂荆謩e置35 ℃、5% CO2及28℃環(huán)境下培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行涂片和革蘭染色。涂片鏡檢可見(jiàn)圓形真菌孢子（圖1），疑似隱球菌。從血培養(yǎng)瓶中吸取適量樣本于離心管中，加蒸餾水破壞紅細(xì)胞，1 581×g離心，取沉淀物1滴置于載玻片上，加墨汁1滴，覆蓋玻片，在顯微鏡高倍鏡下可見(jiàn)圓形菌體，外有1圈透明的莢膜，內(nèi)有反光顆粒（圖2）。培養(yǎng)24 h后，哥倫比亞血瓊脂平板上見(jiàn)灰色、濕潤(rùn)菌落生長(zhǎng)；48 h后哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板上可見(jiàn)灰白色，較大菌落生長(zhǎng)（圖3）。采用Microflex MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定儀（德國(guó)布魯克公司）鑒定為新生隱球菌格魯比變種，分值為1.793（圖4）。血培養(yǎng)的另一需氧瓶5 d未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，將瓶中培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和沙保弱瓊脂，分別置35 ℃、5% CO2及28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，次日可見(jiàn)灰色、濕潤(rùn)菌落生長(zhǎng)，經(jīng)涂片和革蘭染色，鏡下可見(jiàn)圓形真菌孢子，質(zhì)譜鑒定為新生隱球菌格魯比變種。2瓶厭氧血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5 d無(wú)厭氧菌生長(zhǎng)。

圖1 血培養(yǎng)物革蘭染色鏡下結(jié)果（×1 000）

圖2 血培養(yǎng)物去紅細(xì)胞后墨汁染色鏡下結(jié)果（×100）

圖3 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)24 h菌落生長(zhǎng)情況

圖4 Micro flex MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

綜合檢查及培養(yǎng)鑒定結(jié)果，確認(rèn)病原菌為新生隱球菌。當(dāng)日檢測(cè)該患者血清隱球菌抗原為陽(yáng)性，滴度為1∶256。隨后立即予以伏立康唑抗真菌治療。2月25日血清隱球菌抗原為陽(yáng)性，滴度降為1∶128。2月24日再次進(jìn)行血培養(yǎng)，5 d后需氧血培養(yǎng)瓶和厭氧血培養(yǎng)瓶均為陰性。

3 討論

新生隱球菌含新生變種和格魯比變種，廣泛分布于自然界，主要侵犯免疫受損的機(jī)體，多在機(jī)體免疫力低下時(shí)引起感染。劉茜等[9]對(duì)COVID-19死亡患者尸體解剖大體病理觀察的報(bào)告提示COVID-19主要引起以深部氣道和肺泡損傷為特征的炎性反應(yīng)。外周血淋巴細(xì)胞減少是COVID-19患者的臨床特征之一，也是該病確診的診斷條件之一。本例患者入院時(shí)的免疫學(xué)指標(biāo)水平較低，淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)0.63×109/L，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值為113 cell/uL，CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值為48 cell/uL，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值為3.507，CD19百分比為44%，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6為481.54 pg/mL，IL-10為6.85 pg/mL，符合COVID-19的臨床表現(xiàn)?；颊呓碘}素原（procalcitonin，PCT）為1.21 ng/mL，C反應(yīng)蛋白81.4 mg/L，提示有混合感染的可能。人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體陰性。

新生隱球菌作為一種常見(jiàn)的條件致病菌，易引起免疫功能低下患者感染。本例患者在病程進(jìn)展中，外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+T細(xì)胞進(jìn)行性減低，外周血炎癥因子IL-6、PCT、C反應(yīng)蛋白進(jìn)行性上升。對(duì)該患者的血液樣本分別進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，檢出人類(lèi)皰疹病毒5型。以上結(jié)果均提示患者存在免疫功能受損，因此容易合并其他機(jī)會(huì)性感染。本病例提示，COVID-19患者在免疫功能受損的情況下，可以合并包括新生隱球菌在內(nèi)的機(jī)會(huì)性感染，進(jìn)而導(dǎo)致病情惡化，且比較復(fù)雜。

實(shí)驗(yàn)室診斷過(guò)程中，臨床樣本的處理方法直接影響著檢出率的高低，必要時(shí)應(yīng)對(duì)臨床樣本進(jìn)行離心處理，以提高檢出率。酵母菌在需氧瓶中易生長(zhǎng)，多數(shù)酵母菌2～5 d可被檢測(cè)出，某些酵母菌如新生隱球菌則需延長(zhǎng)孵育時(shí)間[10]。本例患者一側(cè)需氧血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后的鑒定結(jié)果為新生隱球菌，另一側(cè)需氧血培養(yǎng)瓶血培養(yǎng)儀培養(yǎng)結(jié)果為陰性，故將瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行平板培養(yǎng)，以避免遺漏因菌的濃度未達(dá)儀器檢測(cè)閾值而報(bào)假陰性的情況發(fā)生。另外，我們對(duì)報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)樣本進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理，并行墨汁染色，可以提高顯微鏡鏡檢檢出率。實(shí)驗(yàn)室病原體診斷需要多種方法聯(lián)合應(yīng)用。