姜文容， 繆應新， 王 粟， 王詩雯， 趙 虎， 張艷梅

（復旦大學附屬華東醫(yī)院檢驗科，上海 200040）

我國的肺癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)已位居世界首位，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）可占90%以上[1]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變與NSCLC患者對靶向治療藥物EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI）的療效密切相關。EGFR的T790M突變作為重要的獲得性耐藥突變，約占所有耐藥基因突變的50%[2]，是EGFR-TKI重要的療效監(jiān)測和預后判斷指標。然而，耐藥患者往往無法通過2次活檢取得組織樣本用于T790M突變檢測。此時，血漿循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）就是此類患者的最佳檢測標志物。ctDNA由腫瘤細胞釋放入血，攜帶高特異的腫瘤標記[3]，且兼具實時、均質(zhì)、創(chuàng)傷小、易獲取等優(yōu)點[4]。然而，ctDNA在血中含量極低，檢測時對樣本的要求極高[5]，而且，臨床血液樣本往往存在多樣性，檢測結(jié)果的準確性可受患者狀態(tài)和干擾物等多種干擾因素影響。血紅蛋白、膽紅素和三酰甘油作為臨床最常見的干擾因素[6]，對檢測ctDNAEGFRT790M突變的影響尚未見相關報道。本研究檢測各種模擬干擾血漿的ctDNAEGFRT790M突變的狀況，旨在確認三酰甘油、膽紅素和血紅蛋白對檢測ctDNAEGFRT790M的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 收集7例經(jīng)超級突變擴增阻滯系統(tǒng)（super amplification refractory mutation system，Super-ARMS）確認T790M為野生型的正常獻血者血漿，共計1 L。T790M突變型質(zhì)粒載體選用PUC57，T790M突變序列來源于美國國立生物技術信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI），由生工生物工程（上海）股份有限公司完成質(zhì)粒構建。1.1.2 儀器與試劑 NanoDrop One微量分光光度計和ABI 7500實時熒光PCR儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。核酸抽提試劑盒（AmoyDx離心柱型循環(huán)DNA型核酸提取試劑）和T790M突變檢測試劑盒（AmoyDxEGFR基因T790M突變檢測試劑）均購自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司；干擾物人血紅蛋白（美國Sigma公司，CAS9008-02-0，5 g）購自上海新睿生物科技有限公司；膽紅素（中國食品藥品檢定研究院，100077-201607，300 mg）及三酰甘油（上海源葉生物科技有限公司，CAS538-24-9，5 g）均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 T790M突變型血漿的制備 將7例經(jīng)Super-ARMS確認EGFRT790M為野生型的正常獻血者血漿混合，制備空白對照血漿，以空白對照血漿為基礎，添加不同濃度T790M突變型質(zhì)粒模擬突變型血漿樣本，以此作為空白組。根據(jù)檢測試劑盒靈敏度選取T790M質(zhì)粒濃度10拷貝/μL作為臨界陽性突變樣本；根據(jù)試劑盒質(zhì)控品選取500拷貝/μL作為強陽性突變樣本。

1.2.2 不同濃度單干擾物突變型血漿的制備 以制備的T790M突變型血漿為基礎，添加不同濃度干擾物制備單一干擾物突變型血漿樣本。各干擾物添加濃度最高值根據(jù)《WS/T 416-2013 干擾實驗指南》[7]附表C“常見內(nèi)源性干擾物的建議實驗濃度”確認，即膽紅素為342 μmol/L、血紅蛋白為2 g/L、三酰甘油為37 mmol/L。根據(jù)“干擾物劑量效應評價實驗”制備4個梯度濃度單干擾物血漿樣本，即低干擾血漿（低干擾組）、中度干擾血漿（中度干擾組）、較高干擾血漿（較高干擾組）及高干擾血漿（高干擾組）。各組單一干擾物突變型血漿的干擾物濃度見表1。

1.2.3 DNA濃度及純度檢測 采用AmoyDx離心柱型循環(huán)DNA型核酸提取試劑抽提DNA，嚴格按照產(chǎn)品說明書操作。采用NanoDrop One微量分光光度計檢測抽提樣本的DNA濃度與純度。DNA純度以樣本在260 nm和280 nm波長處的紫外吸光度比值（A260/A280）表示。A260/A280在1.6～1.8范圍，說明抽提樣本DNA純度高；A260/A280＞1.8提示有RNA污染；A260/A280＜1.6，則提示可能存在蛋白質(zhì)的污染[8]。

表1 各組單一干擾物突變型血漿干擾物質(zhì)濃度

1.2.4 T790M突變檢測 抽提所得的DNA嚴格依照AmoyDxEGFR基因T790M突變檢測試劑說明書步驟進行檢測。取出P-T790M反應液A、B、P-T790M混合酶和P-T790M陽性對照，充分解凍后振蕩混勻，快速離心15 s后待用。根據(jù)檢測樣本例數(shù)（n）配制反應混合液，實際應配制（n+2.5）例反應混合液以減少分液誤差。每例樣本按60 μL反應液A、5 μL反應液B和0.4 μL混合酶的比例配制，振蕩混勻15 s，快速離心15 s，以每管65.4 μL的量分裝到聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應管中。分別加入需要檢測的樣品15 μL、P-T790M陽性對照15 μL和純化水15 μL，蓋上PCR管蓋后離心數(shù)秒。將PCR反應管放置于ABI 7500實時PCR儀中進行T790M突變檢測。反應條件為：95℃ 10 min，1個循環(huán)；95℃ 40 s，64℃ 40 s，72℃ 30 s，15個循環(huán)；93℃ 40 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，28個循環(huán)。

1.2.5 結(jié)果分析 按照試劑盒說明書要求，在陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品均合格且待測ctDNA樣本內(nèi)控Ct值＜19的情況下判定檢測結(jié)果。計算ΔCt值（ΔCt值= Ct值FAM- Ct值VIC），當ΔCt值＜8時，則該樣品為T790M突變陽性，反之則為陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，2個組間的比較采用配對t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各干擾物對抽提樣本DNA濃度的影響

臨界陽性突變樣本的DNA濃度受膽紅素（≥85.5 μmol/L）及三酰甘油（≥9.25 mmol/L）的顯著干擾（P＜0.05），其余各組抗干擾能力均較強。強陽性突變樣本除受低濃度膽紅素（85.5 μmol/L）及高濃度血紅蛋白（2.0 g/L）干擾外，其余各組抗干擾能力均較強（P＜0.05）。各干擾物不同濃度組間的干擾效果無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 不同濃度干擾物對抽提樣本DNA濃度的影響

2.2 各干擾物對抽提樣本DNA純度的影響

臨界陽性突變樣本的DNA純度幾乎不受干擾物的影響（P＞0.05）。強陽性突變樣本的DNA純度不易受膽紅素干擾影響（P＞0.05），但明顯受三酰甘油（≥9.25 mmol/L）和血紅蛋白（0.5～1.5 g/L）的影響（P＜0.05），脂血組各濃度三酰甘油和溶血組各濃度血紅蛋白的干擾效果無明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表3 不同濃度干擾物對抽提樣本DNA純度的影響

2.3 各干擾物對T790M突變檢測內(nèi)控Ct值的影響

內(nèi)控Ct值可綜合反映待檢測ctDNA的含量與質(zhì)量。三酰甘油（≥9.25 mmol/L）對臨界陽性及強陽性T790M突變樣本的內(nèi)控Ct值均可產(chǎn)生較大影響（P＜0.05），且各濃度三酰甘油產(chǎn)生的影響無明顯差異（P＞0.05）。此外，強陽性T790M突變樣本的內(nèi)控Ct值還可受較高濃度膽紅素（≥256.5 μmol/L）干擾（P＜0.05），但各濃度膽紅素干擾效果的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同濃度干擾物對T790M突變檢測值內(nèi)控Ct值的影響

2.4 各干擾物對T790M突變檢測突變ΔCt值的影響

突變ΔCt值可反映T790M突變豐度，與突變豐度成反比。臨界陽性突變樣本的突變ΔCt值極易受三酰甘油（≥9.25 mmol/L）干擾（P＜0.05），且各濃度三酰甘油的干擾效果無明顯差異（P＞0.05）。強陽性突變樣本的突變ΔCt值不受膽紅素干擾（P＞0.05），但可受三酰甘油（9.25～27.75 mmol/L）及中等濃度血紅蛋白（≥1.0 g/L）干擾（P＜0.05），且其各濃度影響效果的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 不同濃度干擾物對T790M突變檢測突變ΔCt值的影響

3 討論

EGFR基因突變是亞裔NSCLC患者最常見的驅(qū)動基因突變，突變率為30%～40%[4]，可用于預測EGFR-TKI靶向藥物的治療效果。然而，接受一、二代EGFR-TKI治療的患者通常會在治療后的9～13個月出現(xiàn)耐藥[9]，其中約50%的患者是由于EGFR的T790M突變所致[2]。奧希替尼作為第三代EGFR-TKI靶向藥物，可選擇性抑制T790M突變的NSCLC，為一、二代EGFR-TKI獲得性耐藥患者帶來了福音。因此，T790M突變檢測對于EGFR-TKI的療效監(jiān)測及耐藥后的后續(xù)治療選擇至關重要。

目前，臨床用于T790M突變檢測的樣本仍首選手術或活檢采集的組織樣本，但其樣本獲取不易、范圍局限、異質(zhì)性大、操作創(chuàng)傷大[10]，因此對于無法通過2次手術或活檢取得組織樣本的耐藥患者而言，血漿ctDNA是其檢測的最佳標志物。ctDNA由循環(huán)腫瘤細胞、腫瘤原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶等凋亡和壞死后釋放入血，攜帶有腫瘤的高特異性標記，同時能夠均化腫瘤的異質(zhì)性，更好地反映患者全身的腫瘤狀況。臨床研究證實，組織樣本與血漿樣本EGFR突變檢測具有高度一致性[11]，且EGFR-TKI耐藥后T790M突變血漿檢測陽性患者與組織檢測陽性患者接受奧希替尼治療具有相似的臨床獲益[12]。Super-ARMS作為目前臨床運用最廣泛的EGFR基因檢測方法，可快速、準確地檢測ctDNA中0.2%～0.8%的突變[13]，因而本研究利用Super-ARMS檢測臨床常見干擾物對ctDNAEGFRT790M突變的影響。

在Super-ARMS檢測的過程中，抽提樣本的DNA質(zhì)量直接關系到后續(xù)檢測的準確性。紫外分光光度法是目前臨床DNA質(zhì)量鑒定的首選方法，也是行業(yè)公認的標準[8]，故本研究采用該方法對抽提的樣本DNA進行檢測和評估。但也需考慮到該方法可能的弊端，例如樣本的DNA濃度過低或存在其他物質(zhì)的污染等均可能對檢測的準確性造成一定影響。所以，在結(jié)果分析時需綜合考慮濃度及純度2個參數(shù)。

除此之外，實驗室檢驗前的質(zhì)量控制對檢驗結(jié)果的準確性更為重要[14]。由于臨床血液樣本常存在溶血、脂血及黃疸等狀況，不可避免地會對各種檢測方法產(chǎn)生干擾，影響結(jié)果的準確性。已有研究證實，膽紅素、血紅蛋白和三酰甘油等干擾物質(zhì)可降低PCR擴增效率，從而影響檢測的準確性[6]。

溶血是臨床檢驗工作中最常遇到的問題，可由抽血操作不當、樣本劇烈振蕩等原因?qū)е耓15]。本研究發(fā)現(xiàn)，溶血可影響抽提樣本的DNA濃度、DNA純度及T790M突變檢測的突變ΔCt值，其可能的原因為溶血時紅細胞釋放的大量酶類及血紅蛋白可對抽提及PCR過程造成影響。血紅蛋白是存在于紅細胞內(nèi)的主要PCR抑制物，通過卟啉環(huán)可與Taq酶發(fā)生不可逆結(jié)合抑制其活性，或者通過釋放鐵離子干擾DNA合成，進而抑制PCR反應以產(chǎn)生干擾作用[16]。

黃疸主要因患者血液中膽紅素的大量堆積所致。本研究發(fā)現(xiàn)，黃疸可影響抽提樣本的DNA濃度和T790M突變檢測的內(nèi)控Ct值，其可能原因為膽紅素作為血紅蛋白的衍生物，也具有與血紅蛋白類似的PCR抑制作用[16]。

脂血主要是因為血液中乳糜微粒的增多所致，人乳糜微粒中84%～88%為三酰甘油，故三酰甘油水平能夠客觀反映脂血程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，脂血可影響ctDNAEGFRT790M突變檢測中的各項參數(shù)，干擾影響較溶血及黃疸更顯著。造成該干擾的原因可能是三酰甘油能夠通過光散射效應影響紫外分光光度法檢測DNA濃度及純度；光散射效應還能導致熒光淬滅，降低熒光信號強度，影響實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的判讀[18]。此外三酰甘油還可通過抑制Taq酶活性，降低PCR擴增效率[19]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，臨床常見的溶血、脂血和黃疸對Super-ARMS檢測血漿ctDNAEGFRT790M突變過程中的各項參數(shù)存在不同程度的干擾。因此，臨床應用此類樣本時應盡量做好樣本的檢驗前質(zhì)量控制，同時檢驗過程中應結(jié)合樣本的具體情況進行全面的分析和解讀，為臨床診療提供更加精準的實驗室參考依據(jù)。