尹 昱，王曉晗，王賀波，孫增鑫，董長征，李文玲，趙文清，趙振彪

目前關(guān)于伽瑪?shù)墩丈渥鳛殚_顱手術(shù)治療癲癇的替代方案的研究日益增多[1-2]。臨床研究[3-4]顯示低劑量伽瑪?shù)犊煽刂齐y治性癲癇患者的癇性發(fā)作，并可保護該類患者的認知功能，但作用機制仍不十分明確。目前認為鈣離子與學(xué)習(xí)、記憶等認知功能密切相關(guān)，而研究[5]顯示鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)還可誘發(fā)癇性發(fā)作，當細胞內(nèi)的鈣濃度超過正常水平，但劑量未達到產(chǎn)生興奮毒性的程度時，鈣濃度異常升高可能引起神經(jīng)細胞異常放電進而導(dǎo)致癲癇。低劑量伽瑪?shù)妒欠裢ㄟ^影響神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度水平而發(fā)揮抗癲癇和保護認知的作用，有待進一步深入探討?，F(xiàn)利用激光共聚焦顯微鏡檢測戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠額葉及海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+水平，并觀察低劑量伽瑪?shù)秾ζ涞挠绊?，以期為伽瑪?shù)吨委煱d癇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與癲癇模型制備選取清潔級健康雄性Wistar大鼠32只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，起始體質(zhì)量180～220 g，均在同一實驗室按清潔級大鼠要求飼養(yǎng)，22～25℃環(huán)境溫度，12 h光亮/黑暗條件，自由進食水。根據(jù)大鼠是否應(yīng)用PTZ致癇及接受低劑量伽瑪?shù)墩丈?，隨機均分為4組：正常對照組、伽瑪?shù)秾φ战M、PTZ致癇組、PTZ致癇+伽瑪?shù)督M。采用腹腔連續(xù)注射PTZ溶液(Sigma 公司，美國)(35 mg/kg)制備癲癇大鼠模型，每24 h注射1次，連續(xù)注射4周，每次注射后觀察大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作的表現(xiàn)。采用修正RacineⅥ級評價標準對大鼠癲癇發(fā)作情況進行評定[6]。在大鼠4周連續(xù)應(yīng)用PTZ期間內(nèi)，如Ⅳ級以上的癲癇發(fā)作連續(xù)出現(xiàn)3次，即被視為癲癇模型制備成功，并用于后續(xù)的實驗，此后仍每周腹腔注射1次相同劑量的PTZ以維持發(fā)作。正常對照組大鼠腹腔注射同等容量的生理鹽水；伽瑪?shù)秾φ战M僅給予伽瑪?shù)墩丈?；PTZ致癇組大鼠由PTZ制備癲癇模型；PTZ致癇+伽瑪?shù)督M大鼠經(jīng)PTZ制備癲癇模型后再接受低劑量伽瑪?shù)墩丈洹?/p>

1.2 低劑量伽瑪?shù)墩丈銹TZ連續(xù)注射4周，癲癇模型制備成功后，應(yīng)用Leksell伽瑪?shù)断到y(tǒng)(ELEKTA，瑞典)對實驗大鼠進行單次低劑量伽瑪?shù)墩丈?，實驗大鼠麻醉?腹腔注射水合氯醛，35 mg/kg)固定在動物架上，再將其置于伽瑪?shù)兜腖eksell框架上，應(yīng)用核磁共振儀(Signa 1.5T)對大鼠進行定位掃描，以大鼠雙側(cè)額葉為照射靶區(qū)，并根據(jù)核磁圖像在Gamma Plan系統(tǒng)上確定雙側(cè)額葉的坐標軸，以50%等劑量線包圍靶區(qū)，邊緣劑量為15 Gy，用4 mm準直器進行照射[3]。

表1 兩組大鼠不同時間點癇性發(fā)作程度的比較(n)

與PTZ致癇組比較：*P<0.05

1.3 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測各組大鼠分別于伽瑪?shù)墩丈浜?2周常規(guī)斷頭迅速取腦，在低溫操作臺上分離出額葉及海馬組織。經(jīng)DMEM培養(yǎng)基漂洗，用0.25%胰蛋白酶37 ℃恒溫消化30 min，再經(jīng)DMEM培養(yǎng)基漂洗終止消化反應(yīng)。后用不同口徑的玻璃吸管將腦組織輕柔吹打成單細胞懸液。懸液經(jīng)濾網(wǎng)過濾后，加入鈣離子熒光探針Fluo-3/AM(Biotium 公司，美國)(含0.1% F-127)，終濃度為5 μmol/L。再將細胞懸液避光孵育30 min(37 ℃)，用DMEM培養(yǎng)基漂洗2～3次。在載玻片上滴一定量的細胞懸液，待細胞貼壁后，再將其放置于激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)的載物臺上。先在低倍鏡(×10)下找到懸液中的神經(jīng)細胞，再在高倍鏡(×20)下選取不同視野的神經(jīng)細胞進行掃描。發(fā)射光為530 nm，激發(fā)光為488 nm。以熒光強度最強的掃描層面為標準值，每個樣本取20個神經(jīng)細胞，取其平均值作為每樣本的Ca2+熒光像素值。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠模型制備情況實驗大鼠于腹腔注射PTZ 3～6次后出現(xiàn)癇性發(fā)作，如頭面部抽動、四肢抽動及陣攣、全身肌陣攣發(fā)作、跌倒及周身翻滾等。每次于注射后3～5 min出現(xiàn)，隨著注射數(shù)次增加，發(fā)作程度逐漸加重。每次發(fā)作持續(xù)40～60 min后逐漸緩解。16只大鼠中共有12只模型制備成功，于注射12～16次后連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級以上的癇性發(fā)作，成功率為75%。

2.2 各組大鼠癲癇發(fā)作情況對照組及伽瑪?shù)秾φ战M大鼠行為正常，無癇性發(fā)作。PTZ致癇組大鼠連續(xù)注射4周PTZ后每周再次注射時，絕大部分可出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作。PTZ致癇+伽瑪?shù)督M大鼠經(jīng)低劑量伽瑪?shù)墩丈浜?，隨時間的延長，每周再次注射PTZ，發(fā)作程度逐漸減輕。實驗將Ⅰ～ Ⅲ級發(fā)作定為輕度，Ⅳ～Ⅴ級定為重度，于照射后第12周，兩組大鼠發(fā)作差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠額葉皮層及海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+水平共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，伽瑪?shù)秾φ战M大鼠額葉及海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的Ca2+熒光強度輕度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PTZ致癇組較正常對照組升高；PTZ致癇+伽瑪?shù)督M較PTZ致癇組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F皮層=20.936、F海馬=26.189，P<0.001)。見表2和圖1、2。

表2 各組大鼠皮層及海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光像素值的比較

與正常對照組比較：*P<0.05; 與PTZ致癇組比較：ΔP<0.05

圖1 各組大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強度

A：正常對照組; B：伽瑪?shù)秾φ战M; C：PTZ致癇組; D：PTZ致癇+伽瑪?shù)督M

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+ 熒光強度

A：正常對照組; B：伽瑪?shù)秾φ战M; C：PTZ致癇組; D：PTZ致癇+伽瑪?shù)督M

3 討論

Ca2+廣泛分布于機體細胞與體液當中，作為細胞內(nèi)最重要的第二信使，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，參與多種生理功能的調(diào)節(jié)。正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)細胞外的Ca2+濃度約為細胞內(nèi)的2萬倍，細胞可通過多種調(diào)控機制維持細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，如細胞內(nèi)鈣庫攝取及釋放，Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運等。目前研究[7]表明，Ca2+在各種神經(jīng)退行性疾病的病生理過程中起著至關(guān)重要的作用，細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡是癲癇發(fā)生的觸發(fā)因素。關(guān)于神經(jīng)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡影響癲癇發(fā)病的實驗證據(jù)日益增多[8]。癲癇發(fā)作時大腦神經(jīng)細胞內(nèi)的Ca2+急劇升高超過閾值，神經(jīng)細胞受到損傷或異常放電，可能是癲癇發(fā)生的直接原因。Raze et al[9]研究發(fā)現(xiàn)慢性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，并且在致癇后1年神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度仍維持較高水平。 Pal et al[10]將海馬神經(jīng)元在無Mg2+培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+水平顯著升高，并出現(xiàn)癇性放電。Ghotbeddin et al[11]應(yīng)用膜片鉗實驗表明，杏仁核點燃可增強電壓門控Ca2+通道電流，而T型Ca2+通道的選擇性阻斷可抑制杏仁核點燃的進展[12]。以上研究顯示無論離體還是在體的癇性神經(jīng)元均存在鈣穩(wěn)態(tài)的變化。本研究顯示，致癇大鼠額葉皮層及海馬的神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，與近年來的文獻報道一致。

目前大量資料表明，Ca2+作為神經(jīng)細胞內(nèi)的重要信使與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，Ca2+內(nèi)流入突觸后膜是觸發(fā)形成LTP的必要條件之一。本研究表明PTZ致癇大鼠額葉皮層及海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，而癲癇大鼠學(xué)習(xí)和記憶受損[3]，提示鈣穩(wěn)態(tài)失衡與癲癇大鼠的認知障礙密切相關(guān)。課題組前期研究[13]還顯示，PTZ致癇大鼠腦組織N-甲基-D-天氡氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體亞基1、NMDA受體2A及NMDA受體2B過度表達，故推測皮層和海馬組織NMDA受體活性增強，可能是導(dǎo)致癲癇大鼠神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+水平升高的重要機制。

近年來研究[14]已證實伽瑪?shù)墩丈淇捎行У乜刂骑D葉癲癇的癲癇發(fā)作，并對該類患者的認知功能、心理、情緒沒有明顯影響。目前認為低照射劑量(邊緣劑量10～20 Gy)在不損害正常神經(jīng)元的同時可提高癲癇灶的閾值，產(chǎn)生抗癇作用[15]。但其生物學(xué)作用機制仍不明確。本研究結(jié)果顯示，邊緣劑量15 Gy的伽瑪?shù)墩丈淇娠@著降低癲癇大鼠皮層和海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+水平，而對正常腦組織影響較小，提示低劑量伽瑪?shù)犊赡苁峭ㄟ^調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)而起到抗癲癇作用的。然而，伽瑪?shù)墩丈鋵ι窠?jīng)細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)控機制尚不清楚。目前研究集中在電離輻射對Ca2+異化擴散和細胞膜的Ca2+通道的影響。結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果，低劑量伽瑪?shù)墩丈浜笊窠?jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度降低可能與癲癇病灶NMDA受體活性減低有關(guān)，具體機制有待進一步深入探討。