江傲霜，王寧玲，劉亢亢，吳正玉，儲金華，楊林海

兒童急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是兒童惡性腫瘤中最常見類型[1]，其發(fā)病機制極其復雜，研究表明白血病的發(fā)生可能與Janus 蛋白質酪氨酸激酶(janus protein tyrosine, JAK)/信號轉導因子和轉錄激活子3(singal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信號通路的異常持續(xù)活化有關[2]，細胞因子信號轉導抑制因子3(cytokine signaling 3, SOCS3)作為一種可能的抑癌基因，是JAK/STAT3信號轉導通路的重要抑制因子，在多種惡性腫瘤中可發(fā)現(xiàn)SOCS3啟動子區(qū)域的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(CpG位點)高甲基化，從而引起SOCS3基因的表達下調或缺失[3]。這些已經(jīng)成為國內(nèi)外針對惡性腫瘤發(fā)病機制及特異性靶向治療的研究熱點，但國內(nèi)外針對SOCS3基因甲基化及轉錄水平與兒童ALL病程和預后的相關性研究少有報道。該研究通過檢測兒童ALL疾病不同階段的SOCS3甲基化及mRNA表達水平，并與正常兒童進行對照研究，以探討其與兒童ALL的治療反應及預后的關系，從而為SOCS3是否能作為兒童ALL特異性靶向治療點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2015年1月～2016年11月就診于安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科血液病區(qū)的新診斷的ALL患兒作為研究對象，納入及排除標準參照文獻[4]，共83例ALL患兒納入研究，隨訪時間截止至2018年6月，同時選擇21例健康兒童作為正常對照組。入組ALL患兒均完善骨髓細胞學、免疫分型、染色體核型分析及融合基因檢測(TEL-AML基因、E2A-PBX基因、BCR-ABL基因、MLL基因重排等)，根據(jù)初診時臨床及生物學特點，危險度分為低危(low risk, LR)、中危(moderate risk, MR)、高危(high risk, HR)3組，根據(jù)治療第19天和第46天骨髓微小病變殘留水平(minimal residual disease, MRD)調整危險度，按照CCCG-ALL-2015方案進行序貫化療，總療程2.5年。該研究已經(jīng)獲得安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(N0.201501)，根據(jù)赫爾基宣言，所有入組患兒監(jiān)護人均簽署臨床研究知情同意書、化療知情同意書、廢棄標本用于科研同意書，對照組健康兒童在入組前由監(jiān)護人簽署廢棄標本用于科研同意書。

1.2 骨髓單個核細胞提取用無菌EDTA抗凝管留取ALL患兒和正常兒童骨髓血2 ml，加入Ficoll分離液(天津生物科技有限公司)，參照說明書提取骨髓單個核細胞。

1.3 RNA提取和逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(reverse transcriptional quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從骨髓標本中提取RNA。用QuantiTect(德國Chiagen GmbH公司)逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為參照基因，用qRT-PCR進行cDNA定量檢測。SOCS3 mR-NA前引物序列: 5′-CAGCTCCA AGAGCGAGACCA-3′；SOCS3 mRNA后引物序列: 5′-AGAAGCCGCTCTCCTGCAG-3′；內(nèi)參基因GADPH前引物序列: 5′-AATGGAAAT CCCATCACCATCT-3′；GADPH后引物序列:5′-CGCCCCACTTGATTTTGG-3′。根據(jù)數(shù)據(jù)結果運用2-ΔΔCT公式計算mRNA相對表達量。

1.4 細胞DNA提取及甲基化特異性PCR反應參照DNA 提取試劑盒說明書提取細胞DNA 后，用紫外分光光度計測定DNA 的純度和濃度，取0.5 μg DNA 樣品(A260 nm/280 nm比值在1.7～2.0)進行亞硫酸鹽修飾，按照MethylCodeTM Bisulfite轉化試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書對cDNA 進行處理，使抽提到的DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶通過亞硫酸氫鹽處理后全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。SOCS3甲基化水平檢測以亞硫酸氫鈉修飾DNA為模板，采用亞硫酸氫鈉測序法檢測SOCS3基因甲基化水平。用上海Invitrogen公司設計和合成的巢式亞硫酸氫鈉測序PCR引物對CpG島進行擴增。第一輪引物序列，上游為5′-TTGATT TYGTAGGTGAT-3′，下游為5′-ACCTTTATATATATA TATATATATACACATACTC-3′(擴增片段555 bp)；第二輪引物序列，上游為5′-GAGTATATAAGAAG GT-3′，下游為5′-TCCTATATATACCC-3′(擴增片段408 bp)。用1.5%瓊脂糖凝膠把PCR 產(chǎn)物電泳后，用凝膠回收試劑盒進行回收純化，然后用氨芐西林耐藥的TA克隆進行連接反應。從每個平板中篩選出10個克隆，接種于2 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。最后送上海Invitrogen公司進行測序，分析測序結果中，○代表未發(fā)生甲基化的CG 位點，●代表發(fā)生甲基化的CG位點。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad 6.0作為制圖軟件。計數(shù)資料采用百分數(shù)進行卡方檢驗及Fisher 確切概率處理數(shù)據(jù)；計量資料采用均數(shù)±標準差表示并用方差分析處理數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCT法計算SOCS3 mRNA水平；采用秩和檢驗法分析SOCS3基因甲基化水平與臨床特點及治療反應的關系；采用Kaplan-Meier曲線繪制總生存率(overall survival, OS)和累積復發(fā)率(cumulative incidence of relapse, CIR)曲線，單因素預后分析采用對數(shù)秩Log-Rank卡方檢驗法，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般結果83例ALL患兒納入研究，男43例，女40例，中位年齡6.2歲(7月～14歲)，21例健康兒童作為健康對照組，男13例，女8例，中位年齡6.3歲(10月齡～ 14歲)。ALL患兒組與健康對照組在性別比率及年齡構成比之間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ALL患兒與健康對照組兒童一般臨床資料見表1。

2.2 兒童ALL化療前后SOCS3 mRNA表達水平83例ALL患兒按照CCCG-ALL-2015方案按序規(guī)范化治療后，9例復發(fā)，74例完全緩解。測定83例患兒初診時和健康對照組兒童的SOCS3 mRNA表達水平顯示，初診(1.024±0.584)及復發(fā)組(0.796±0.384)患兒SOCS3 mRNA的表達水平明顯低于健康對照組(3.459±1.118)兒童SOCS3 mRNA的表達水平(P<0.05)；完全緩解組患兒SOCS3 mRNA的表達水平基本恢復正常，與初診組SOCS3 mRNA的表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(3.021±0.549vs1.024±0.584；P<0.05)，而與健康對照組兒童SOCS3 mRNA的表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(3.021±0.549vs3.459±1.118；P>0.05)。

2.3 SOCS3基因甲基化狀態(tài)與治療反應的相關性運用甲基化特異性PCR檢測初診組、復發(fā)組、完全緩解組及健康對照組兒童的SOCS3基因甲基化水平，結果顯示：初診組、復發(fā)組、完全緩解組患兒的SOCS3基因甲基化水平檢測陽性率不等，而健康對照組兒童SOCS3基因甲基化均未檢出。初診組、復發(fā)組、完全緩解組ALL患兒的SOCS3基因甲基化水平明顯高于健康對照組(P<0.05)；初診組及復發(fā)組ALL患兒的SOCS3基因甲基化水平明顯高于完全緩解組(Z=4.539、3.044；P<0.05)，見表2、圖1。

表1 ALL及健康對照組兒童一般臨床資料

復發(fā)：定義為骨髓幼稚細胞≥20%，或髓外有白血病細胞浸潤證據(jù)；完全緩解：定義為外周血中性粒細胞計數(shù)≥1.0×109/L、血小板計數(shù)≥100×109/L及血紅蛋白濃度≥90 g/L，骨髓幼稚細胞≤5%，且無髓外白血病浸潤的任何證據(jù)。

表2 ALL組和對照組患者SOCS-3基因甲基化的表達水平

與健康對照組比較：*P<0.05；與緩解組比較：#P<0.05

2.4 ALL患兒初診時SOCS3基因甲基化高水平組和低水平組臨床特點比較按照中位數(shù)法將初診組83例患兒SOCS3 基因甲基化水平分為高水平組和低水平組，高水平組中位甲基化密度為31.14%(25.32%～48.52%)，低水平組中位甲基化密度為15.22%(0～25.19%)，比較SOCS3基因甲基化高水平組和低水平組ALL患兒在年齡、性別、初診外周血白細胞計數(shù)及骨髓原始幼稚細胞、危險度分組、免疫分型、細胞遺傳學改變、治療反應中的差異。結果顯示，初診SOCS3甲基化高水平組有更高的外周血白細胞計數(shù)，與低水平組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SOCS3甲基化高水平組有更多的中高危組病例，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，SOCS3甲基化高水平組的復發(fā)病例高于SOCS3甲基化低水平組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而化療后SOCS3甲基化高水平組與低水平組比較，其治療完全緩解率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

圖1 ALL患兒化療前后SOCS3基因甲基化水平

A：健康對照組；B：初診組；C：復發(fā)組；D：完全緩解組；○代表未發(fā)生甲基化的CG 位點；●代表發(fā)生甲基化的CG 位點

將包括初診年齡、外周血白細胞計數(shù)、危險度分組、SOCS3 基因甲基化分組納入Cox比例風險模型進行多因素分析，結果表明：初診外周血白細胞計數(shù)>50×109/L、SOCS3 基因甲基化高水平組患兒復發(fā)率高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，相對危險度及95%置信區(qū)間分別為2.348(1.331～4.142)、0.397(0.209～0.751)。

2.5 SOCS3基因甲基化水平與預后的相關性基于SOCS3基因甲基化水平的42個月總生存率(overall survival, OS)和累積復發(fā)率(cumulative incidence of relapse, CIR)的Kaplan-Meier曲線見圖3，SOCS3基因甲基化高水平組CIR明顯高于低水平組(P<0.05)；而SOCS3基因甲基化高、低水平組總生存率之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

SOCS3作為負性調節(jié)JAK/STAT信號轉導通路的重要抑制蛋白之一，在胰腺癌、乳腺癌、肝癌等多種實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中均有SOCS3的表達下調[5-7]。 為探討SOCS3在兒童ALL不同病程中的變化，本研究采用qRT-PCR技術檢測了ALL患兒不同病程SOCS3 mRNA的表達水平，結果顯示，初診及復發(fā)階段SOCS3 mRNA的表達水平明顯低于健康對照組兒童，完全緩解階段SOCS3 mRNA的表達水平基本恢復正常。以上結果證實SOCS3也參與了兒童ALL的發(fā)生和發(fā)展，其表達水平與兒童ALL治療反應密切相關。SOCS3在復發(fā)狀態(tài)的再次減低，提示SOCS3 mRNA的表達水平在病程中的再次減低可能作為評估體內(nèi)殘留腫瘤細胞水平升高的指標，但其特異性有待進一步研究。

表3 初診組ALL患兒SOCS3 基因甲基化高水平組和低水平組臨床特點比較

圖3 ALL患兒SOCS3基因甲基化高、低水平組的生存分析A:累積復發(fā)率比較；B:總生存率比較；與低水平組比較：*P<0.05

針對SOCS3在惡性腫瘤中的低表達分子機制引起眾多學者的關注和興趣，本課題組前期研究結果表明小兒ALL初診階段SOCS3的表達水平與STAT3的水平呈負相關，SOCS3在ALL兒童中的低表達可以導致ALL中STAT3的異常持續(xù)活化[4]，然而，SOCS3基因表達下降的原因尚不清楚。在基因表達調控的研究中表明，最常見的基因修飾是DNA甲基化，在多種惡性腫瘤中均存在基因啟動子啟動子區(qū)域甲基化改變[8]，且研究表明SOCS3的異常甲基化有助于JAK/STAT信號轉導通路的異常激活，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程[2]。本研究組運用甲基化特異性PCR檢測初診組、復發(fā)組、完全緩解組即代表兒童ALL不同病程階段的SOCS3基因啟動子區(qū)域甲基化水平，探討SOCS3基因表達降低的可能機制。結果顯示ALL患兒不同病程的SOCS3基因甲基化水平明顯高于健康對照組，提示SOCS3甲基化引起的SOCS3基因表達下調對兒童ALL的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

有關學者在針對肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SOCS3表達與腫瘤分化程度、血管浸潤及復發(fā)有關，SOCS3甲基化在腫瘤組織中的頻率和強度都有所增加，SOCS 3甲基化與肝細胞癌患者不良的臨床結局顯著相關，SOCS3表達水平及SOCS 3甲基化水平可作為評估肝癌預后的相關指標[7]。在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)SOCS3高表達組具有更高的外周血白細胞計數(shù)、乳酸脫氫酶水平及更多的預后不良基因病例[9]。為進一步討論SOCS3甲基化對SOCS3表達及ALL患兒治療反應及預后的影響，本研究針對SOCS3甲基化水平與治療反應及預后的相關性作出分析，結果顯示SOCS3甲基化水平的差異與兒童ALL初診外周血白細胞計數(shù)、疾病危險度相關。SOCS3甲基化低水平組患兒具有更高的外周血白細胞計數(shù)，且具有更多的中危組和高危組病例。

本研究中患兒初診時SOCS3甲基化水平升高，完全緩解后較前減低，復發(fā)后再次升高，提示SOCS3甲基化水平可反映白血病負荷程度，結合42個月隨訪結果顯示SOCS3甲基化高水平組復發(fā)率明顯高于低表達水平組，提示SOCS3甲基化水平與復發(fā)明顯相關，多因素分析提示SOCS3甲基化水平是影響復發(fā)率的重要危險因素之一。相關研究表明SOCS3通過調控STAT3參與腫瘤的發(fā)生及演進，SOCS3高度甲基化從而促使SOCS3基因沉默，無法負性調節(jié)JAK2/STAT3通路，從而促使STAT3的過度激活，誘發(fā)慢性炎癥有關的細胞因子，如IL-6、M-CSF、COX2等，這些因子又通過相關受體激活間質細胞中的STAT3，STAT3在腫瘤細胞和腫瘤基質細胞之間形成反饋環(huán)，促進炎性腫瘤微環(huán)境的形成，從而增強腫瘤的侵襲和轉移[10-11]。該研究證實了這一過程，提示SOCS3高度甲基化參與兒童ALL復發(fā)過程，SOCS3甲基化水平能否作為監(jiān)測復發(fā)后患兒治療療效的指標也是本課題組進一步的研究方向。但SOCS3甲基化高水平組和低水平組的總生存率之間差異無統(tǒng)計學意義，分析原因可能是與完成整個CCCG-ALL-2015方案療程停藥的患者較少、隨訪時間較短相關。SOCS3甲基化水平是否能作為評估兒童ALL的遠期預后指標有待繼續(xù)跟蹤隨訪觀察。

該研究表明SOCS3基因高度甲基化導致SOCS3基因表達下調，與兒童ALL的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)密切相關，這一結果啟發(fā)我們應用去甲基化試劑恢復體內(nèi)SOCS3表達功能，從而重新實現(xiàn)對JAK/STAT信號轉導通路的負性調節(jié)作用，抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡，可能有助于控制兒童ALL的惡化趨勢。SOCS3基因能否作為治療兒童ALL的新靶點有待研究組進一步探究。